侯旭亮，宋銀平，季乃云*

(1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

天然產(chǎn)物是現(xiàn)代藥物研發(fā)的重要源泉，有相當(dāng)數(shù)量的藥物來(lái)源于天然產(chǎn)物或是以天然產(chǎn)物骨架為模板合成的類(lèi)似物或擬藥[1]。但是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的開(kāi)發(fā)，從陸生生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新藥或先導(dǎo)化合物的難度越來(lái)越大，抗藥性問(wèn)題也日益嚴(yán)重。而海洋生物量占地球生物總量的80%以上，同時(shí)，由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性，海洋生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和酶反應(yīng)系統(tǒng)與陸生生物有著巨大的差異，導(dǎo)致海洋生物，尤其是海洋微生物，在次級(jí)代謝產(chǎn)物研究上相比陸生生物具有一些顯著的優(yōu)勢(shì)[2]。

海洋藻棲真菌主要指棲息于海藻或與海藻相關(guān)的絲狀真菌，但不包括來(lái)自海草的絲狀真菌[3]。近年來(lái)，海洋藻棲真菌來(lái)源的天然產(chǎn)物已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，已有數(shù)百種新型天然產(chǎn)物被分離和鑒定，具有廣泛的生物活性，包括抗癌、抗病毒、抗氧化、酶抑制或活化活性[3-5]。從海洋藻棲真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的具有抗菌活性的新型化合物占海洋真菌來(lái)源的近76%[6]?？梢?jiàn)，海洋藻棲真菌是天然產(chǎn)物研究中發(fā)現(xiàn)新藥或先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。

為進(jìn)一步了解海洋藻棲真菌的多樣性及其生物活性，作者以在煙臺(tái)海岸帶采集的海藻為對(duì)象，分離內(nèi)生真菌及附生真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析對(duì)藻棲真菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其抗菌活性、抗微藻活性及海洋動(dòng)物毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期篩選出活性較高并具有較低毒性的良好菌株，為下一步次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

2020年8月從煙臺(tái)棧橋附近的海岸帶采集了33份新鮮海藻樣品，包括江蘺、松節(jié)藻、凹頂藻、馬尾藻、酸藻等，低溫保存。

供試細(xì)菌：檸檬交替假單胞菌(Pseudoalteromonascitrea)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，保藏于實(shí)驗(yàn)室。供試微藻：東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、海洋卡盾藻(Chattonellamarina)，保藏于實(shí)驗(yàn)室。供試海洋動(dòng)物：豐年蝦(Artemiasalina)，為實(shí)驗(yàn)室保存卵孵化；褶皺臂尾輪蟲(chóng)(Brachionusplicatilis)，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，北京路橋技術(shù)股份有限公司；真菌培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、味精，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；蛋白胨，北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯霉素。

潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 真菌的分離及保藏

附生真菌的分離：將海藻樣品用無(wú)菌海水至少?zèng)_洗3次，再將整株海藻或海藻的一部分置于加入適量氯霉素的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)2～3 d，待長(zhǎng)出菌落后，使用接種針?lè)磸?fù)接種直至得到單一的附生真菌。

內(nèi)生真菌的分離：采用組織塊培養(yǎng)法[7]，將海藻樣品表面滅菌，用無(wú)菌海水沖洗3次，用75%乙醇浸泡滅菌1～2 min[8]，再用無(wú)菌海水沖洗表面殘余的乙醇，切成小塊置于PDA培養(yǎng)基中。同上述步驟，從海藻切口處生長(zhǎng)的菌落中分離得到單一的內(nèi)生真菌。

采用超低溫冷凍保藏法[9]對(duì)分離純化后的菌株進(jìn)行保藏。使用真菌培養(yǎng)基配制真菌培養(yǎng)液，滅菌，在凍存管中加入0.9 mL真菌培養(yǎng)液；將菌株接種至PDA培養(yǎng)基中，待菌落生長(zhǎng)旺盛時(shí)，取適量菌落加入凍存管中，24 h后加入0.9 mL滅菌的50%甘油溶液，搖勻，使甘油終濃度為25%；將凍存管置于-80 ℃冰箱中保存，每種菌株保存3份。

1.3 藻棲真菌的鑒定

采用針對(duì)真菌核糖體RNA基因序列的通用引物ITS1和ITS4對(duì)真菌 rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]，ITS1的堿基序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4的堿基序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR產(chǎn)物送青島睿博生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定真菌的屬別。

1.4 真菌粗提物的制備

大米培養(yǎng)基：將12 g大米、20 mL培養(yǎng)液加入800 mL錐形瓶中，培養(yǎng)液成分為葡萄糖 20 g、蛋白胨 5 g、酵母浸粉5 g、味精5 g、淡水1 L。

將真菌在大米培養(yǎng)基中于25 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)21 d，加入適量乙酸乙酯浸泡殺菌；過(guò)濾，分離發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液用乙酸乙酯多次萃取，有機(jī)相減壓旋蒸濃縮，得到發(fā)酵液粗提物；菌絲體晾干后粉碎，用乙醇多次浸泡提取，過(guò)濾，有機(jī)相減壓旋蒸濃縮，得到菌絲體提取物。二者所含成分基本相同，合并，得到真菌粗提物。

1.5 活性測(cè)試

1.5.1 抗菌活性測(cè)試

采用濾紙片擴(kuò)散法[11]，通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑評(píng)價(jià)真菌粗提物的抗菌活性。供試細(xì)菌為檸檬交替假單胞菌和鰻弧菌，用比濁法稀釋至5×104CFU·mL-1，真菌粗提物加量為20 μg/片，陽(yáng)性對(duì)照為氯霉素。

1.5.2 抗微藻活性測(cè)試[12]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供試微藻，用f/2培養(yǎng)基稀釋至微藻細(xì)胞濃度約5×104個(gè)·mL-1。取96孔板，每孔加入195 μL 藻液，在20 ℃、光照強(qiáng)度為2 000 Lux、光暗比為14∶10(h∶h)的條件下，培養(yǎng)24 h。利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察記錄死亡微藻數(shù)和微藻總數(shù)，計(jì)算微藻抑制率。樣品組、空白組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)平行。樣品組加入5 μL濃度為4 mg·mL-1的真菌粗提物溶液，溶劑為DMSO；空白組加入5 μL DMSO；對(duì)照組加入5 μL濃度為4 mg·mL-1的K2CrO7溶液。

1.5.3 海洋動(dòng)物毒性測(cè)試

將400 mL抽濾后的海水、100 mg豐年蝦卵加入到500 mL燒杯中，通入空氣，室溫孵化24 h，去除未孵化的卵和卵殼后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待用。采用Solis改良法，取96孔板，每孔加入195 μL 備用液，約有15個(gè)豐年蝦幼體，培養(yǎng)24 h后，在解剖鏡下觀察記錄死亡豐年蝦數(shù)和豐年蝦總數(shù)，計(jì)算致死率[13]。樣品組、空白組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)平行。樣品組加入5 μL濃度為4 mg·mL-1的真菌粗提物溶液，溶劑為DMSO；空白組加入5 μL DMSO；對(duì)照組加入5 μL濃度為4 mg·mL-1的K2CrO7溶液。

25 ℃下，分別以小球藻、鹽藻和扁藻制成的濃縮藻液為餌料培養(yǎng)褶皺臂尾輪蟲(chóng)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前24 h停止投喂餌料，備用。取96孔板，每孔加入195 μL備用液，約有10個(gè)健康輪蟲(chóng)，培養(yǎng)24 h后，在解剖鏡下觀察記錄死亡輪蟲(chóng)數(shù)和輪蟲(chóng)總數(shù)，計(jì)算致死率[14]。樣品組、空白組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)平行。樣品組加入5 μL濃度為4 mg·mL-1的真菌粗提物溶液，溶劑為DMSO；空白組加入5 μL DMSO；對(duì)照組加入5 μL濃度為4 mg·mL-1的K2CrO7溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 真菌的分離及鑒定

通過(guò)形態(tài)觀察，從33份海藻樣品中分離獲得無(wú)重復(fù)真菌菌株124株，其中內(nèi)生真菌47株，附生真菌77株。將菌株的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLAST搜索，均可以找到相似度在98%以上的相似序列，并基于Neighbor-Joining(N-J)法，使用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。將ITS序列的對(duì)比分析結(jié)果與真菌形態(tài)及菌絲體特征觀察相結(jié)合，有102株真菌鑒定到屬，主要包括59株木霉屬真菌、11株曲霉屬真菌、9株鐮刀菌屬真菌、4株青霉屬真菌及一些其它真菌(表1)。

表1 藻棲真菌的分離及鑒定

圖 1 基于N-J法對(duì)102株藻棲真菌的ITS-rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 活性測(cè)試結(jié)果

2.2.1 抗菌活性

以檸檬交替假單胞菌和鰻弧菌為指示菌，挑選出62株真菌，測(cè)定其真菌粗提物的抑菌活性。結(jié)果顯示，有40株真菌對(duì)檸檬交替假單胞菌表現(xiàn)出了抑菌活性，占菌株總數(shù)的64.5%；只有4株真菌對(duì)鰻弧菌表現(xiàn)出較弱的抑菌活性，菌株編號(hào)分別為12.Ⅱ.2N、19.Ⅰ.1F、B4.1F、C2.1N，分別屬于鐮刀菌屬、黑團(tuán)孢屬、木霉屬、橫梗霉屬，這4株真菌對(duì)2種致病菌均表現(xiàn)出了一定的抑菌活性。

2.2.2 抗微藻活性

以東海原甲藻和海洋卡盾藻為模型，挑選出62株真菌，測(cè)定其真菌粗提物的抗微藻活性。結(jié)果顯示，對(duì)東海原甲藻抑制率大于50%的真菌有24株，占菌株總數(shù)的38.7%，其中有19株真菌的抑制率達(dá)到100%；對(duì)海洋卡盾藻抑制率大于50%的真菌有49株，占菌株總數(shù)的79.0%，其中有27株真菌的抑制率達(dá)到100%；有21株真菌對(duì)東海原甲藻和海洋卡盾藻的抑制率均大于50%，其中有17株真菌對(duì)2種海洋赤潮微藻的抑制率均達(dá)到了100%，編號(hào)分別為4.A.2F、5.1.1F、5.1.2F、6.Ⅱ.1F、10.Ⅱ.1F、11.Ⅱ.2N、12.Ⅱ.2N、14.1.1F、17.Ⅰ.1N、17.Ⅱ.1N、18.A.2N、26.1.2F、A1.1F(A)、A1.2F(B)、B1.2N、B4.1F、C3.1N，包括10株木霉屬真菌、2株鐮刀菌屬真菌、1株葡萄穗霉屬真菌、1株鏈格孢屬真菌、3株未知屬真菌。

2.2.3 海洋動(dòng)物毒性

以豐年蝦和褶皺臂尾輪蟲(chóng)為模型，挑選出62株真菌，測(cè)定其真菌粗提物的海洋動(dòng)物毒性。結(jié)果顯示，62株真菌均對(duì)輪蟲(chóng)表現(xiàn)出了較高的毒性；有13株真菌對(duì)豐年蝦表現(xiàn)出了較低的毒性，編號(hào)分別為2.Ⅰ.1F、2.Ⅱ.1F、6.Ⅰ.1N、6.Ⅰ.2F、6.Ⅱ.3F、8.Ⅰ.2F、10.2.1F、10.2.3F、11.Ⅱ.2N、12.Ⅱ.2N、17.Ⅰ.1N、27.Ⅱ.2N、C4.2F，包括9株木霉屬真菌、3株鐮刀菌屬真菌、1株未知屬真菌。

2.3 討論

從海藻樣品中分離得到124株真菌，經(jīng)過(guò)真菌形態(tài)學(xué)和ITS序列分析，鑒定到17個(gè)屬，其中有59株真菌來(lái)自于木霉屬，占比為47.58%，說(shuō)明木霉是海洋藻棲真菌的優(yōu)勢(shì)種群之一。木霉屬真菌在世界范圍內(nèi)廣泛分布，已發(fā)現(xiàn)的木霉屬真菌有250多種[15]，其中哈茨木霉(T.harzianum)、綠木霉(T.virens)、綠色木霉(T.viride)等[16]因具有生防能力在農(nóng)業(yè)上得到應(yīng)用；另外，木霉屬真菌在工業(yè)酶制劑生產(chǎn)、土壤或水源污染修復(fù)等方面也有著廣泛的應(yīng)用[17-19]。在天然產(chǎn)物研究方面，陸地和海洋來(lái)源的木霉屬真菌能產(chǎn)生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括萜類(lèi)、甾體類(lèi)、聚酮類(lèi)、生物堿和肽。本實(shí)驗(yàn)還分離得到了糙刺籃狀菌(Talaromycestrachyspermus)，屬于罕見(jiàn)菌種，我國(guó)僅在浙江舟山市和河南鄭州市分離得到。

124株真菌中，內(nèi)生真菌有47株，附生真菌有77株，分別占菌株總數(shù)的37.9%和62.1%。內(nèi)生真菌的數(shù)量比附生真菌的少，可能是因?yàn)?，?nèi)生真菌寄生在海藻的內(nèi)部組織中，其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)與寄主藻類(lèi)存在著復(fù)雜的密切關(guān)系。當(dāng)把內(nèi)生真菌從其寄生的組織中分離出來(lái)后，由于生長(zhǎng)環(huán)境的改變，可能會(huì)導(dǎo)致菌株某些特性的改變，加大了內(nèi)生真菌分離的難度[3]。因此，在分離過(guò)程中通過(guò)模擬宿主內(nèi)部環(huán)境來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)條件，可能更利于內(nèi)生真菌的分離及后續(xù)研究。

關(guān)于海洋藻棲真菌抗菌活性的報(bào)道較多，馬悅欣等[20]分離得到的海藻附生真菌中，31.3%具有抗菌活性；Gao等[21]從海洋紅藻的內(nèi)生真菌PenicilliumchrysogenumQEN-24S中分離得到對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、綠膿桿菌和表皮葡萄球菌具有抑制活性的新型化合物。本實(shí)驗(yàn)分離得到的部分藻棲真菌對(duì)細(xì)菌尤其是檸檬交替假單胞菌具有抑菌活性，說(shuō)明藻棲真菌具有產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的潛力。有害赤潮在我國(guó)發(fā)生的規(guī)模和頻率逐年上升，造成嚴(yán)重的環(huán)境危機(jī)和經(jīng)濟(jì)損失。Chen等[22]從海洋真菌中分離得到對(duì)海洋綠藻(Brachiomonassubmarina)和中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)有抑制作用的活性物質(zhì)；Redhead等[23]發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素可以在水華魚(yú)腥藻周?chē)纬扇茉迦?；Kumar[24]研究發(fā)現(xiàn)，青霉素可以抑制組囊藻的生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)分離的藻棲真菌中有部分對(duì)2種海洋赤潮微藻具有抑制作用，這些真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中可能含對(duì)抗赤潮微藻的有效成分。此外，藻棲真菌還具有其它生物活性，倪敏等[25]發(fā)現(xiàn)，部分海藻附生真菌的抗氧化活性顯著；Abdel-Lateff[26]從藻棲真菌中分離得到對(duì)p56lck酪氨酸激酶具有顯著抑制活性的物質(zhì)。

研究表明，在我國(guó)海岸帶蘊(yùn)藏著豐富的藻棲真菌資源。對(duì)藻棲真菌的深入研究能促進(jìn)我們對(duì)海洋生物生長(zhǎng)習(xí)性和生態(tài)功能的了解。同時(shí)，藻棲真菌良好的生物活性說(shuō)明其可能含有豐富的抗微藻和抗菌活性物質(zhì)，是藥用活性物質(zhì)的重要來(lái)源，具有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

3 結(jié)論

以在煙臺(tái)海岸帶采集的海藻為對(duì)象，分離內(nèi)生真菌及附生真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析對(duì)藻棲真菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其抗菌活性、抗微藻活性及海洋動(dòng)物毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，從海藻樣品中共分離得到124株真菌，包括47株內(nèi)生真菌和77株附生真菌，其中102株真菌被鑒定到17個(gè)屬。從124株真菌中挑選62株進(jìn)行活性測(cè)試，有40株真菌對(duì)檸檬交替假單胞菌表現(xiàn)出抑菌活性，有4株真菌對(duì)鰻弧菌表現(xiàn)出抑菌活性，且這4株真菌對(duì)2種致病菌均表現(xiàn)出抑菌活性；有21株真菌對(duì)東海原甲藻、海洋卡盾藻的抑制率大于50%，且有17株真菌的抑制率達(dá)到100%；62株真菌均對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)表現(xiàn)出較高的毒性，有13株真菌對(duì)豐年蝦表現(xiàn)出較低的毒性。表明海洋藻棲真菌生物多樣性豐富，部分藻棲真菌具有一種或多種良好的生物活性，具有開(kāi)發(fā)活性天然產(chǎn)物的巨大潛力，值得進(jìn)一步研究。