孫 航 寧 瓏 方鈺發(fā) 周艷凱 馮 晉 楊瓊英 何芳雁

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，昆明 650000)

高脂血癥是肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、糖尿病、高血壓、腦中風(fēng)等疾病的高危險(xiǎn)因素[1-5]。近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活方式的改變以及西方飲食的傳播，使得我國(guó)成年人血脂異常的總體患病率高達(dá)40.4%，并呈不斷上升趨勢(shì)[6]。他汀類藥物為HGM-CoA還原酶抑制劑，可抑制膽固醇的合成而發(fā)揮療效，臨床常用于治療高膽固醇血癥，然而其肝損傷和肌病等不良反應(yīng)在一定程度上限制了他汀類藥物的應(yīng)用[7-8]。因此尋找安全有效對(duì)抗高脂血癥的藥物仍具有現(xiàn)實(shí)意義。

降脂藥物的研究與開發(fā)需選擇適合的動(dòng)物模型，動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，其建立方法應(yīng)盡量吻合病程發(fā)展，并具備方法可重復(fù)、成本較低、操作簡(jiǎn)單、便于推廣等特點(diǎn)[9]。目前醫(yī)藥界研究高脂血癥的動(dòng)物模型有先天性模型、轉(zhuǎn)基因模型及化學(xué)誘導(dǎo)模型。先天性和轉(zhuǎn)基模型因來(lái)源困難、價(jià)格昂貴導(dǎo)致其使用范圍受限[8]。國(guó)內(nèi)應(yīng)用廣泛的是化學(xué)誘導(dǎo)模型，造模方法包含化學(xué)試劑注射法、高脂飼料喂養(yǎng)法、脂肪乳劑灌胃法[10]?；瘜W(xué)試劑注射法雖操作簡(jiǎn)單、模型復(fù)制迅速，但對(duì)動(dòng)物刺激性較大，并且其形成機(jī)制與人類高脂血癥差別較大，不適用于藥物作用機(jī)制的研究[11]；高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥模型與人類的高脂血癥形成過(guò)程類似，但存在造模時(shí)間長(zhǎng)、動(dòng)物進(jìn)食個(gè)體差異較大造成模型不穩(wěn)定等缺點(diǎn)；脂肪乳灌胃誘導(dǎo)的高脂血癥模型，操作簡(jiǎn)單，模型成果復(fù)制耗時(shí)少，并且能保證動(dòng)物脂質(zhì)攝取量均一。綜合比較，該方法優(yōu)于高脂飲食法。但目前報(bào)道的脂肪乳配方、動(dòng)物選擇及造模時(shí)間無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[12]。大鼠、小鼠具有成本低、易于飼養(yǎng)、抗病力強(qiáng)、易于造模、技術(shù)方法更成熟等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)常用其復(fù)制高脂血癥模型，但大鼠、小鼠模型之間仍存在一定差異[11]。因此，本研究進(jìn)行脂肪乳灌胃誘導(dǎo)大鼠、小鼠高脂血癥模型的對(duì)比研究，以期為高脂血癥發(fā)病機(jī)制的研究和降脂藥物的研發(fā)提供動(dòng)物疾病模型選擇的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)的雄性SD大鼠體質(zhì)量為(200±10)g，由昆明醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號(hào)：SCXK(滇)K2020—0004；SPF級(jí)的雄性KM小鼠【體質(zhì)量為(20±3)g】，由昆明醫(yī)科大學(xué)提供【SCXK(滇)K2020-0004】。按照云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倫理委員會(huì)審批號(hào)：R-06201984。

1.1.2試劑與耗材：膽固醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：H1926053)；丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1907N18)；丙二醇(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2018011701)；豬膽酸鈉(北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20181222)；高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(均為南京建成生物工程研究所，批號(hào)：03/2019)。低溫高速離心機(jī)(日本Hitachi Koki公司，型號(hào)：cf16rx)；脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(均為賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)分別為：CryoStar NX50、Excelsior AS、HISTOSTATS、Microm HM)；生物顯微鏡(瑞士Tecan公司，日本NIKON公司，型號(hào)：Ci-L)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與樣品采集：雄性SD大鼠，稱重后隨機(jī)分為對(duì)照組(灌胃等體積雙蒸水)、模型組(灌胃2 mL脂肪乳/100 g體重)，每組各10只；雄性KM小鼠，稱重后隨機(jī)分為對(duì)照組(灌胃等體積雙蒸水)、模型組(灌胃0.2 mL脂肪乳/10 g體重)，每組各10只。起初，飼以每只大鼠20 g/d(小鼠5 g/d)普通飼料，第二天稱取各組所剩飼料后補(bǔ)齊飼料。根據(jù)各組最少進(jìn)食量來(lái)控制各組動(dòng)物食量。脂肪乳灌胃2周、4周后取材，取材前12 h禁食(不禁水)。各組動(dòng)物在2周時(shí)進(jìn)行眼底靜脈叢取血；4周時(shí)，大鼠腹部靜脈取血、小鼠采用摘眼球取血后，迅速剝離出肝臟、脾臟、腎臟，在冰生理鹽水中涮洗，濾紙拭干水分后稱重，拍照觀察肝臟的形態(tài)學(xué)變化。脂肪乳的配制參考文獻(xiàn)方案[13-14]，分別稱取20 g膽固醇、1 g丙硫氧嘧啶片置于乳缽中研細(xì)備用；再稱取40 g豬油(市場(chǎng)自購(gòu))于鍋中小火加熱烊化呈液態(tài)，少量多次地加入研細(xì)的膽固醇粉末，混勻后，加丙硫氧嘧啶粉末，充分?jǐn)嚢杌靹?，再緩慢?0 mL吐溫-80、20 mL丙二醇，全部混勻后，再加20 mL的10%豬膽酸鈉溶液(2 g豬膽酸鈉加雙蒸水定容至20 mL)，快速研磨呈乳化狀態(tài)即可，置于密閉容器中分裝冷藏，使用前在37 ℃恒溫水浴鍋融化。每3天配置1次。

1.2.2血脂四項(xiàng)及肝組織TC、TG的測(cè)定：取出血樣，肝右葉、中葉加生理鹽水(肝組織∶生理鹽水=1∶9)勻漿后，分別置于低溫離心機(jī)(血4 ℃、3 000 r/min，肝組織3 500 r/min)離心10 min，取上清液備用。參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清、肝組織勻漿溶液的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

1.2.3HE染色：動(dòng)物肝左葉切分成兩塊，置于10%中性甲醛溶液中固定24 h。固定好的肝組織塊經(jīng)流水沖洗后置于脫水機(jī)中進(jìn)行脫水、透明、復(fù)蠟、包埋，而后進(jìn)行連續(xù)切片(切片厚度為5 μm)。肝組織石蠟切片脫蠟、梯度乙醇溶液復(fù)水，蘇木精染色2 min、返藍(lán)，伊紅染色45 s，透明后中性樹膠封片，晾干保存。

2 結(jié)果

2.1 脂肪乳灌胃誘導(dǎo)大鼠、小鼠高脂血癥模型的血脂4項(xiàng)對(duì)比

與對(duì)照組比較，KM小鼠模型組脂肪乳灌胃2周和4周后血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量均無(wú)明顯差異；SD大鼠模型組灌胃2周后血清TC、LDL-C明顯升高(P<0.001、P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.001)，TG無(wú)明顯變化；脂肪乳灌胃4周后，血清TC、TG、LDL-C明顯升高(P<0.001、P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.001)。詳見表1。

表1 大鼠、小鼠高脂血癥模型的血脂四項(xiàng)對(duì)比(mmol/L，Mean±SD，N=10)Table 1 Comparison of four items of blood lipids in hyperlipidemia models of mice and rats(mmol/L，Mean±SD，N=10)

2.2 脂肪乳灌胃誘導(dǎo)大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝臟TC、TG對(duì)比

與對(duì)照組比較，脂肪乳灌胃4周后，昆明種小鼠模型組肝組織TC、TG無(wú)明顯差異；SD大鼠模型組肝組織TC、TG明顯升高(P<0.001、P<0.01)。詳見表2。

表2 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝脂對(duì)比 (mmol/L，Mean±SD，N=10)Table 2 Comparison of liver lipids in hyperlipidemic models in rats and mice(mmol/L，Mean±SD，N=10)

2.3 脂肪乳誘導(dǎo)大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病變程度對(duì)比

2.3.1脂肪乳誘導(dǎo)大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝臟濕重及指數(shù)變化對(duì)比：與對(duì)照組比較，脂肪乳灌胃4周后，昆明種小鼠模型組肝臟濕重、肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.001、P<0.01)；SD大鼠模型組肝臟濕重、肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.001)。詳見表3。

表3 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝臟濕重、指數(shù)變化對(duì)比Table 3 Comparison of changes in liver wet weight and index of hyperlipidemia models in rats and mice

2.3.2脂肪乳灌胃誘導(dǎo)大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病變程度對(duì)比：與對(duì)照組比較，脂肪乳灌胃4周后，KM小鼠模型組肝臟稍有腫大，顏色發(fā)黃，質(zhì)地柔軟且飽滿光滑；SD大鼠模型組可見肝臟明顯腫大，顏色發(fā)黃甚至發(fā)白，質(zhì)地柔軟且飽滿光滑，切面有油膩感。詳見圖1。

圖1 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病變程度對(duì)比Fig.1 Comparison of liver pathological changes between hyperlipidemia model rats and mice

2.3.3脂肪乳灌胃誘導(dǎo)大、小鼠高脂血癥模型的肝組織病理學(xué)變化對(duì)比：與對(duì)照組比較，脂肪乳灌胃4周后，KM小鼠模型組肝細(xì)胞排列紊亂，肝索不清晰，肝血竇狹窄，甚至消失，肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核顯像清晰，細(xì)胞質(zhì)淡染；SD大鼠模型組肝細(xì)胞排列紊亂，肝索不清晰，肝血竇狹窄，甚至消失，肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核顯像清晰，細(xì)胞質(zhì)淡染，且有明顯的脂肪空泡。詳見圖2。

圖2 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病理改變對(duì)比Fig.2 Comparison of hepatic histopathological changes in hyperlipidemia models in rats and mice

3 討論

高脂血癥是指血漿中TG、TC、LDL-C的含量過(guò)高，HDL-C含量過(guò)低的一種全身脂代謝異常的疾病[15]。灌胃脂肪乳因外源性脂肪吸收增多，可導(dǎo)致血脂升高，超過(guò)肝臟對(duì)脂質(zhì)的代謝能力，脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，肝脂升高，肝細(xì)胞損傷，產(chǎn)生脂肪泡，最終形成脂肪肝[16-17]。本實(shí)驗(yàn)為綜合比較脂肪乳誘導(dǎo)的大、小鼠高脂血癥模型，以期獲得最佳模型復(fù)制方法，選用血脂(TG、TC、LDL-C、HDL-C)、肝脂(TG、TC)及肝臟病變程度(肝臟形態(tài)、濕重、指數(shù)、病理改變)為指標(biāo)。結(jié)果表明，脂肪乳灌胃2周，KM小鼠血脂四項(xiàng)均無(wú)明顯變化，SD大鼠血清TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，TC還未出現(xiàn)明顯變化。提示，SD大鼠較早出現(xiàn)血脂異常。脂肪乳灌胃4周，KM小鼠可見肝組織出現(xiàn)輕度病理?yè)p傷，但血脂和肝脂仍無(wú)明顯變化；SD大鼠血清TG、TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，并可見肝臟明顯腫大，顏色發(fā)白，肝組織病變程度較重，有明顯的脂肪空泡出現(xiàn)。提示，本脂肪乳配方持續(xù)灌胃4周可成功復(fù)制大鼠高脂血癥模型，而小鼠的高脂血癥模型還未復(fù)制成功，跟動(dòng)物種屬、造模時(shí)間及脂肪乳配方有一定關(guān)系。梁紅峰等[18]利用脂肪乳劑(100 g/L膽固醇、200 g/L豬油、20 g/L膽酸鈉和10 g/L丙基硫氧嘧啶)連續(xù)灌胃12周成功誘導(dǎo)昆明種小鼠TC升高為主的單純性高脂血癥。因此，高脂血癥發(fā)病機(jī)制和降脂藥物的研發(fā)實(shí)驗(yàn)可優(yōu)先選用SD大鼠用該脂肪乳配方灌胃4周。若選用本實(shí)驗(yàn)脂肪乳配方及昆明種小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可在此基礎(chǔ)上延長(zhǎng)造模時(shí)間，具體時(shí)間仍待進(jìn)一步研究。