李 杰 趙夢洋 賴夢雨 宋銀娟 張茜茜 梁正敏 楊東明 王元智 李志萍 屈孟錦 董玉慧 王浩然 劉一朵 關(guān)芷玲 姚 嬌 孫芷馨 陳玉蘭 葛 昕王冬冬 高虹麗 陳 森 趙化芬 李 雯 趙德明 周向梅 楊利峰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 國家動物海綿狀腦病實驗室，北京 100193)

科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力，隨著國家大力發(fā)展科學(xué)技術(shù)，實驗動物科學(xué)作為科學(xué)技術(shù)的重要組成部分取得了高速發(fā)展。實驗動物質(zhì)量的抽查檢驗是實驗動物主管部門綜合應(yīng)用抽查和檢驗兩種方式評價、判斷實驗動物質(zhì)量的行政行為。實驗動物的特殊性決定了實驗動物抽查檢驗的專業(yè)性、技術(shù)性和法定性。實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢測制度對全面了解實驗動物質(zhì)量，對實驗動物質(zhì)量總體水平做出科學(xué)的評估，及時發(fā)現(xiàn)實驗動物質(zhì)量存在的問題，采取有效措施，強化實驗動物質(zhì)量管理與安全意識，保障和維護實驗動物生產(chǎn)穩(wěn)定進(jìn)行發(fā)揮了重要作用[1]。

病理學(xué)診斷一直被認(rèn)為是準(zhǔn)確率高于其他檢查手段的“金標(biāo)準(zhǔn)”。應(yīng)用傳統(tǒng)病理學(xué)方法對實驗動物質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的評價與檢測，不但為實驗動物質(zhì)量評價提出可靠準(zhǔn)確的依據(jù)，還有助于實驗動物學(xué)科研究領(lǐng)域和生產(chǎn)實踐的合理、良好、科學(xué)的發(fā)展，也是對病理學(xué)全面發(fā)展的詮釋。兩門學(xué)科可互相促進(jìn)，共同進(jìn)步[2]。本研究擬對北京20多家實驗動物繁育機構(gòu)2020 年兩次送檢的750 只嚙齒類實驗動物的病理檢測結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，一方面對北京市嚙齒類實驗動物質(zhì)量總體水平做出科學(xué)評估，及時發(fā)現(xiàn)實驗動物質(zhì)量存在的問題，從而為實驗動物的生產(chǎn)、管理和改進(jìn)提供參考。另一方面強化實驗動物質(zhì)量管理與安全意識，保障和維護實驗動物生產(chǎn)穩(wěn)定。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2020 年5月份和10月份，由中國食品藥品檢定研究院從北京市20多家實驗動物單位總共抽取750只SPF 級、清潔級的小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和普通級豚鼠4種實驗用鼠進(jìn)行調(diào)查和分析，具體情況見表1。

表1 2020年抽查的750只嚙齒類實驗動物采樣情況Table 1 Classification of 750 rodent samples in 2020

1.2 實驗方法

1.2.1組織切片的制備和觀察：CO2安樂死動物，迅速采集動物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸。經(jīng)甲醛鈣液(10%甲醛+ 1%氯化鈣)固定后按常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，OLYMPUSU-SRG數(shù)碼顯微鏡觀察，采集圖像，記錄結(jié)果。

1.2.2肝臟油紅O染色：對HE染色觀察中有中度及以上細(xì)胞腫脹的肝臟樣品，抽取部分樣品進(jìn)行油紅O染色。主要步驟為: 組織塊用甲醛鈣液(10%甲醛+ 1% 氯化鈣) 固定一周，肝臟組織制作冰凍切片，油紅O染色，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.3肝臟PAS染色：同時對HE染色觀察出現(xiàn)中度及以上細(xì)胞腫脹的肝臟樣品進(jìn)行PAS染色。主要步驟為: 甲醛鈣液固定，制作肝組織石蠟切片，高碘酸氧化，Schiff氏試劑染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的病理學(xué)變化及統(tǒng)計

共取樣360只，其中SPF級320只，清潔級40只。結(jié)果顯示，5例SPF級NPG小鼠、4例SPF級C57小鼠和10例SPF級ICR小鼠脾臟表現(xiàn)出彌漫性白髓細(xì)胞減少，髓外造血增加；2例SPF級C57小鼠表現(xiàn)出脾臟輕度出血，含鐵血黃素沉著；1例SPF級BALB/c小鼠心臟表現(xiàn)出心外膜鈣化；1例SPF級BALB/c小鼠心臟表現(xiàn)出心外膜炎；1例SPF級ICR小鼠在大腸腸腔中發(fā)現(xiàn)了寄生蟲感染；1例清潔級C57小鼠小腸表現(xiàn)出慢性增生性腸炎；1例SPF級NIH小鼠腎臟表現(xiàn)出局灶性間質(zhì)性腎炎；2例SPF級KM小鼠肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞腫脹，其中1例經(jīng)特殊染色證實為肝細(xì)胞脂肪變性；1例清潔級ICR小鼠肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞腫脹，經(jīng)特殊染色證實油紅O染色與PAS染色均為陰性。其余各組織臟器未見明顯病理變化。

2.1.1脾臟病變：與正常脾臟(圖1A)相比，脾臟輕度出血在紅髓中可見棕褐色含鐵血黃素沉積(圖1B); 脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少，髓外造血增加，紅髓與白髓界限不清，白髓顯著減少，巨噬細(xì)胞呈彌漫性增多(圖1C)。

圖1 小鼠脾臟組織病變情況注: A.正常脾臟; B. 脾臟輕度出血; C. 脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少，髓外造血增加；A、B、C為HE染色(× 400) Fig.1 Pathological changes in mouse spleens tissueNote: A. Normal spleen; B. Spleen slight bleeding; C. Spleen diffuse white medullary cell decrease and extramedullary hematopoietic increase; A, B, and C were HE staining (× 400)

2.1.2心臟病變：與正常心臟相比(圖2A)，心外膜炎可見心外膜增厚，炎性細(xì)胞浸潤(圖2B)；心外膜鈣化可見心外膜增厚，其內(nèi)可見大量嗜堿性藍(lán)染顆粒狀成分，為大量鈣鹽沉著(圖2C)。

圖2 小鼠心臟組織病變情況注: A.正常心臟；B.心外膜炎；C.心外膜鈣化；A、B、C為HE染色(× 400)Fig.2 Pathological changes in mouse heart tissuesNote: A. Normal heart; B. Epicardial inflammation; C. Epicardial calcification; A, B, C were HE staining (× 400)

2.1.3腸道病變：與正常腸道(圖3A、C)相比，病變大腸腸腔中可見寄生蟲蟲體(圖3B); 慢性增生性腸炎可見黏膜下層增厚，較多漿細(xì)胞浸潤，腸腺萎縮(圖3D)。

圖3 小鼠腸道組織病變情況注: A.正常直腸；B.大腸寄生蟲感染；C.正常小腸；D.小腸慢性增生性腸炎；A、B、C、D為HE染色(×400)Fig.3 Pathological changes in mouse intestinal tissuesNote: A. Normal rectal; B. Rectal parasitic infection; C. Normal duodenum; D. Chronic proliferative; A, B, C and D were HE staining(×400)

2.1.4腎臟病變：與正常腎臟(圖4A)相比 ，腎臟間質(zhì)出現(xiàn)局灶性炎性細(xì)胞浸潤(圖4B)。

圖4 小鼠腎臟組織病變情況注: A.正常腎臟；B.間質(zhì)性腎炎；A、B為HE染色(× 100) Fig.4 Pathological changes in mouse kidney tissuesNote: A. Normal kidney; B. Interstitial nephritis;A and B were HE staining (×100)

2.1.5肝臟病變：與正常肝臟(圖5A)相比，肝細(xì)胞腫脹可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，未見明顯肝索結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖5B) ; 對肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行PAS染色(圖5C)和油紅O 染色(圖5D)，顯示肝臟脂肪變性，可見較多紅色大小不一的圓形小滴分布在肝細(xì)胞胞漿中，有的圍繞在細(xì)胞核周圍，有的聚集呈大脂滴(圖5D) 。

圖5 小鼠肝臟組織病變情況注: A.正常肝臟；B.肝細(xì)胞腫脹; C.肝臟PAS染色陰性; D.肝臟脂肪變性；A、B為HE染色(× 400)；C為PAS染色(× 400)；D 為油紅O 染色陽性(×1 000)Fig.5 Pathological changes in mouse liver tissuesNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver PAS staining was negative;D. Hepatic steatosis; A, B were HE staining (× 400)；C was PAS staining (×400); D was Oil Red-O staining positive (× 1 000)

2.2 大鼠的病理學(xué)變化及統(tǒng)計

共取樣160只，其中SPF級140只，清潔級20只。有15例脾臟表現(xiàn)為彌漫性白髓細(xì)胞減少，髓外造血增加；3例肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞腫脹，經(jīng)特殊染色確定1例為肝細(xì)胞糖原沉積。其余各組織臟器未見明顯病理變化。

2.2.1脾臟病變：與正常脾臟相比(圖6A)，脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少，髓外造血增加，紅髓與白髓界限不清，白髓顯著減少，巨噬細(xì)胞呈彌漫性增多(圖6B)。

圖6 大鼠脾臟組織病變情況注: A.正常脾臟；B.脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少，髓外造血增加；A、B為HE染色(×400)Fig.6 Pathological changes of in rats spleens tissuesNote: A. Normal spleen; B. Spleen diffuse white medullary cell decrease and extramedullary hematopoietic increase;A, B were HE staining (×400)

2.2.2肝臟病變：與正常肝臟(圖7A)相比, 肝細(xì)胞腫脹可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，未見明顯肝索結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖7B)；對肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O 染色(圖7C)和 PAS染色(圖7D) ，顯示肝細(xì)胞胞漿呈均質(zhì)淡粉色，其中可見紫紅染色的糖原顆粒(圖7D) 。

圖7 大鼠肝臟組織病變情況注: A. 正常肝臟；B. 肝細(xì)胞腫脹；C. 油紅O 染色陰性；D. 肝臟PAS染色陽性；A、B為HE染色(×400)；C為油紅O 染色陰性(×1 000)；D為PAS染色陽性(×400)；Fig.7 Pathological changes in rats liver tissuesNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver Oil red O staining was negative; D. Liver PAS staining was positive;A, B were HE staining (× 400)；C was Oil Red-O staining negative (× 1 000)；D was PAS staining positive(×400)

2.3 豚鼠的病理學(xué)變化及統(tǒng)計

共取樣210只，其中SPF級30只，清潔級20只，普通級160只。異常主要集中在普通級豚鼠的肺臟，肝臟和小腸。15例間質(zhì)性肺炎，其中兩只豚鼠同時表現(xiàn)出肝臟膽管上皮增生；13例肝臟細(xì)胞胞質(zhì)中有大小不一的空泡，進(jìn)行油紅O及PAS染色，結(jié)果為6例油O染色陽性，2例PAS染色陽性；5例小腸固有層含鐵血黃素沉積。在SPF級豚鼠中發(fā)現(xiàn)1例肉芽腫性肺炎。其余各組織臟器未見明顯病理變化。

2.3.1肺臟病變：與正常肺相比(圖8A), 間質(zhì)性肺炎的肺泡壁局部增寬，增寬區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)消失，在增生的區(qū)域及支氣管、血管周圍可見炎性細(xì)胞浸潤，鄰近區(qū)域可見局部肺泡代償性增大(圖8B)。肉芽腫性肺炎可見肺臟局部出現(xiàn)增生的區(qū)域有大量淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，并可見少量的多核巨細(xì)胞(圖8C，D)。

2.3.2肝臟病變：與正常肝臟(圖9A)相比，肝細(xì)胞腫脹可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，未見明顯肝索結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖9B)；對肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O 染色(圖9C)和 PAS染色(圖9D)，可見胞漿中大小不一的圓形紅染脂滴(圖9C)，肝細(xì)胞胞質(zhì)呈均質(zhì)淡粉色，其中可見紫紅染色的糖原顆粒(圖9D)。膽管上皮增生可見肝小葉間及匯管區(qū)膽管上皮增生，上皮呈團塊狀生長，不形成管腔(圖9E)。

圖9 豚鼠肝臟組織病變情況注: A. 正常肝臟；B. 肝細(xì)胞腫脹；C. 油紅O 染色陽性；D. 肝臟PAS染色陽性；E. 膽管上皮增生；A、B、E為HE染色(× 400)；C為油紅O染色陽性(× 1 000)；D為PAS染色陽性(× 400)Fig.9 Pathological changes of livers in guinea pigsNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver Oil red O staining was positive; D. Liver PAS staining was positive;E. Hyperplasia of bile duct epithelium; A, B, E were HE staining (×400); C was Oil Red-O staining positive (×1 000) ;D was PAS staining positive (×400)

2.3.3腸道病變：與正常小腸(圖10A)相比，小腸陳舊性出血可見腸絨毛固有層有數(shù)量不等的呈棕紅色的含鐵血黃素沉積(圖10B)。

圖10 豚鼠腸道組織病變情況注: A.正常十二指腸；B.十二指腸陳舊性出血；A、B為HE染色(×400)Fig.10 Pathological changes in guinea pig intestinal tissuesNote: A. Normal rectal; B. Chronic duodenal hemorrhag (× 400);A, B were HE staining (×400)

2.4 地鼠的病理學(xué)變化及統(tǒng)計

共取樣清潔級地鼠20只。被檢地鼠中可見3例肝細(xì)胞腫脹，經(jīng)特殊染色確定其中1例為糖原沉積，其余各組織臟器未見明顯病理變化。地鼠基本合格。

與正常肝臟(圖11A)相比，肝細(xì)胞腫脹可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，未見明顯肝索結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖11B)；對肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O 染色(圖11C)和 PAS染色(圖11 D)，其中可見紫紅染色的糖原顆粒(圖11D)。

圖11 地鼠肝臟組織病變情況注: A.正常肝臟；B. 肝細(xì)胞腫脹；C. 油紅O 染色陰性；D. 肝臟PAS染色陽性；A、B為HE染色(× 400)；C為油紅O 染色陰性(×1 000)；D為PAS染色陽性(× 400)Fig.11 Pathological changes in hamster liver tissuesNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver Oil red O staining was negative; D. Liver PAS staining was positive;A, B was HE staining (× 400); C was Oil Red-O staining negative (×1 000); D was PAS staining positive (× 400)

3 討論

本次抽查檢驗北京市嚙齒類實驗動物的病理變化顯示，大多數(shù)送檢的實驗動物基本健康。但來自于不同公司的SPF級小鼠和大鼠的脾臟均表現(xiàn)出彌漫性白髓細(xì)胞減少、髓外造血增加；普通級豚鼠普遍表現(xiàn)出間質(zhì)性肺炎。所有品種及不同級別的鼠肝臟出現(xiàn)個別腫脹、空泡化，但經(jīng)特殊染色觀察，僅有少數(shù)為脂肪變性、糖原沉積。其余不同級別鼠的臟器僅個別出現(xiàn)病理變化。如：心外膜炎、心外膜鈣化；直腸寄生蟲感染；十二指腸慢性增生性腸炎，陳舊性出血；腎臟間質(zhì)性腎炎。

3.1 肝臟病變分析

在取樣小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠中均出現(xiàn)個別肝細(xì)胞腫脹、空泡化。近10年肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞腫脹，炎性反應(yīng)，壞死比較明顯[3-12]，但呈現(xiàn)逐年下降趨勢[10]，說明北京市實驗動物質(zhì)量控制逐漸標(biāo)準(zhǔn)化。2020年嚙齒類實驗動物肝臟并沒有表現(xiàn)出其他病理變化，如炎性反應(yīng)、壞死、變性等，排除了肝臟毒性損傷。進(jìn)行特殊染色處理，僅有極少數(shù)為脂肪變性、糖原沉積，可能造成的原因為：①運輸、處死過程中的應(yīng)激以及部分組織臟器的自溶；②與飼料、飼喂管理方式(飲食、維生素A過量等)以及動物個體差異有關(guān)，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)營養(yǎng)紊亂[13]。因此，在實驗動物的繁育過程中，飼料應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的原料、合理恒定的配方及適宜的滅菌方法，動物飲水也應(yīng)使用滅菌的自來水[14]。

3.2 脾臟病變分析

分別來自不同單位的34例SPF級小鼠和大鼠脾臟表現(xiàn)出彌漫性白髓細(xì)胞減少、髓外造血增加。白髓細(xì)胞數(shù)量減少可能是由于衰老、應(yīng)激、營養(yǎng)不良、毒素、自身免疫、放射、感染或其他部位的腫瘤引起的?？赡苁且驗楸粰z測鼠長期接觸某些毒物或者病原微生物(細(xì)菌或病毒)引起脾臟濾泡萎縮，濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡、壞死，淋巴細(xì)胞生成減少。隨著時間推移，生發(fā)中心和濾泡消失，最終導(dǎo)致脾臟全部淋巴組織數(shù)量減少。這些因素還會引起脾臟紅髓巨噬細(xì)胞增多，髓外造血增加。實驗動物繁育公司可以排查飼料、墊料中是否有毒素的存在。

3.3 肺臟病變分析

普通級豚鼠肺臟普遍表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，其中2例同時表現(xiàn)出肝臟膽管上皮增生，可能與寄生蟲感染或者其他刺激因素有關(guān)。肺臟病變可能與墊料質(zhì)量不達(dá)標(biāo)或飼養(yǎng)密度過大有關(guān)，劣質(zhì)的墊料碎屑及塵埃較多，極易造成異物刺激引發(fā)動物肺部炎癥；飼養(yǎng)密度過大、溫濕度不適、通風(fēng)不良和飼養(yǎng)員清理不及時，室內(nèi)臭味和氨濃度升高容易誘發(fā)氣管炎、肺炎等。因而，在實驗動物的飼養(yǎng)過程中需要注意飼養(yǎng)環(huán)境的空氣情況、飼養(yǎng)密度以及通風(fēng)情況等。選用符合標(biāo)準(zhǔn)的墊料，盡量減少室內(nèi)墊料碎屑、臭味和氨味等對動物呼吸道的刺激。

3.4 其余臟器病變分析

其余臟器(如心臟、腎臟、大腸、小腸)僅有1例或極少數(shù)出現(xiàn)病變。SPF級小鼠大腸出現(xiàn)寄生蟲感染，說明飼養(yǎng)環(huán)境需要進(jìn)一步檢查完善。其他臟器的病變可能與飼料、飼喂管理方式以及動物個體差異有關(guān)。另外，運輸、處死過程中的應(yīng)激以及部分組織臟器的自溶可能對病理學(xué)檢查結(jié)果都會產(chǎn)生一定影響。

基于以上結(jié)果認(rèn)為，雖然大多數(shù)送檢實驗動物基本健康，但嚙齒類不同級別實驗動物的不同臟器出現(xiàn)不同程度的組織病理學(xué)損傷。雖然有的嚙齒類實驗動物符合國家微生物學(xué)等標(biāo)準(zhǔn)，但仍有部分實驗動物處于亞健康狀態(tài)。因此，病理學(xué)監(jiān)測在實驗動物質(zhì)量評價中有著不可替代的重要作用。通過病理學(xué)監(jiān)測實驗動物的健康狀況對于更好地保障實驗動物的福利和保證科學(xué)研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性具有重要的意義。