任毓輝 聶 帥 彭春雪 楊 玲 沈海龍

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

紅松（）為松科（Pinaceae）松屬（）高大喬木樹(shù)種，是我國(guó)長(zhǎng)白山和小興安嶺林區(qū)紅松闊葉林的建群種，既是珍貴用材樹(shù)種，也是優(yōu)質(zhì)食用堅(jiān)果生產(chǎn)樹(shù)種，是具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值的珍貴鄉(xiāng)土樹(shù)種。紅松良種選育工作已經(jīng)取得一些成績(jī)，獲得了一些優(yōu)良種質(zhì)材料，包括雜交育種材料。這些少量的優(yōu)良種質(zhì)材料需要經(jīng)過(guò)規(guī)模化擴(kuò)繁，才能滿(mǎn)足造林需求，而體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)可以利用少量繁殖材料短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)繁大量苗木，是實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的的理想途徑。紅松組織培養(yǎng)最早的報(bào)道是1962年Lee等的胚培養(yǎng)、1986 年Kim 等獲得愈傷組織、1978 年黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所獲得不定芽，而最早的胚狀體（體胚）是1992年?yáng)|北林業(yè)大學(xué)所獲得，但只到球形的原始階段，未獲得進(jìn)一步發(fā)育。2005年申曉輝等報(bào)道獲得紅松胚性愈傷組織，2017 年高芳等對(duì)紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基類(lèi)型、糖源濃度和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及外植體取材部位等進(jìn)行了篩選，隨后科研人員對(duì)紅松體胚發(fā)生的外植體及其預(yù)處理技術(shù)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和超低溫保存技術(shù)、體胚成熟促進(jìn)和體胚的生理生化特性等進(jìn)行了系統(tǒng)研究?？傮w來(lái)看，目前紅松體胚發(fā)生已經(jīng)取得重大進(jìn)步，但是在胚性愈傷組織增殖過(guò)程中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合、碳源種類(lèi)和濃度尚有很大改進(jìn)空間，合適的增殖周期尚未確立，生理生化特性尚不明晰。因此，本研究對(duì)紅松胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基中的碳源類(lèi)型、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和種類(lèi)、增殖培養(yǎng)周期以及增殖中的胚性愈傷組織生理變化進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期為優(yōu)化紅松體胚發(fā)生體系提供參考。

1 材料與方法

1.1胚性愈傷組織材料及增殖保存方法

以3 月齡的紅松1-100 號(hào)細(xì)胞系為試材。增殖基本培養(yǎng)基在方案上微調(diào)：mLV 添加2 mg·L2，4-D，0.5 mg·L6-BA，25 g·L蔗糖，0.5 g·L酸水解絡(luò)蛋白，0.5 g·L-谷氨酰胺，4 g·L結(jié)冷膠。所有培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)節(jié)pH 為5.8，121 ℃高壓滅菌30 min。在（25±2）℃條件下暗培養(yǎng)，2周繼代1次。

1.2增殖培養(yǎng)的激素濃度效應(yīng)研究

取胚性愈傷組織試材接種到含以下不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中。處理1，2 mg·L2，4-D+0.5 mg·L6-BA；處理2，1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA；處理3，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA；處理4，1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA；處理5，無(wú)激素。每個(gè)處理重復(fù)5 次。激素外增殖基本培養(yǎng)基其他成分和培養(yǎng)條件同1.1。在增殖培養(yǎng)14 d 后收集材料進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)和生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3增殖培養(yǎng)的碳源效應(yīng)研究

取胚性愈傷組織試材接種到以下4 種不同碳源的增殖培養(yǎng)基上。處理6，25 g·L蔗糖；處理7，25 g·L麥芽糖；處理8，25 g·L果糖；處理9，25 g·L葡萄糖。每個(gè)處理重復(fù)5 次。碳源外增殖基本培養(yǎng)基其他成分和培養(yǎng)條件同1.1。在增殖培養(yǎng)14 d后收集材料進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)和生理指標(biāo)測(cè)定。

1.4增殖培養(yǎng)的增殖周期效應(yīng)研究

取紅松胚性愈傷組織試材接種至增殖培養(yǎng)基中，設(shè)定增殖培養(yǎng)周期為以下2 種：7 d 和14 d。每個(gè)處理重復(fù)5 次。增殖基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同1.1。在增殖培養(yǎng)第7和第14天收集材料進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)和生理指標(biāo)測(cè)定。

1.5體胚分化培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)不同增殖培養(yǎng)處理的胚性愈傷組織接種到體胚分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚分化。分化培養(yǎng)基基于Klimaszewska 等的方案：mLV+80 μmol·LABA+1.2%結(jié)冷膠+0.2 mol·L蔗糖，pH=5.8。黑暗中培養(yǎng)8 周后統(tǒng)計(jì)發(fā)生的體胚數(shù)量。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)每克胚性愈傷組織鮮質(zhì)量的體胚發(fā)生數(shù)量，計(jì)算公式如下：

1.6生理指標(biāo)測(cè)定

將經(jīng)過(guò)不同增殖培養(yǎng)處理的胚性愈傷組織接種到相應(yīng)類(lèi)型的增殖培養(yǎng)處理組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取材進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按樣本鮮質(zhì)量計(jì)算），采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖及淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按照蛋白濃度計(jì)算），采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法測(cè)定SOD 活性（按照蛋白濃度計(jì)算），愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD 活性（按照蛋白濃度計(jì)算），過(guò)氧化氫法測(cè)定CAT 活性（按照蛋白濃度計(jì)算）。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)分別收集0.5 g的材料。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用SPSS19.0 軟件進(jìn)行多重比較（Duncan’s）和方差分析。顯著性差異水平=0.05。最后用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行繪圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1增殖培養(yǎng)的激素濃度對(duì)體胚產(chǎn)量的影響

增殖培養(yǎng)基中不同激素濃度處理下的紅松胚性愈傷組織經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)均有體胚發(fā)生，但不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合顯著影響紅松體胚產(chǎn)量（<0.05）。其中，在1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA濃度處理下體胚產(chǎn)量最高，為166 個(gè)·g，在2 mg·L2，4-D+0.5 mg·L6-BA 濃度濃度下體胚為127 個(gè)·g。而激素濃度為0的處理組合中體胚產(chǎn)量最低，為13個(gè)·g（見(jiàn)圖1）。

2.2增殖培養(yǎng)的碳源效應(yīng)

增殖培養(yǎng)基中不同碳源處理下紅松胚性愈傷組織經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)后，碳源為蔗糖的處理分別與碳源為麥芽糖、果糖、葡萄糖的處理體胚產(chǎn)量之間差異顯著（<0.05），但是碳源為麥芽糖、果糖和葡萄糖的處理體胚產(chǎn)量之間差異相互不顯著。其中碳源為蔗糖的處理體胚產(chǎn)量最高為127 個(gè)·g，其次是碳源為麥芽糖的處理（80 個(gè)·g）。碳源為葡萄糖的處理體胚產(chǎn)量最低為53 個(gè)·g。碳源為蔗糖的處理相較于碳源為葡萄糖的處理其體胚產(chǎn)量增加了75 個(gè)·g（見(jiàn)圖1）。

2.3增殖培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)周期效應(yīng)

增殖培養(yǎng)中不同增殖培養(yǎng)周期處理下紅松胚性愈傷組織經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)后，增殖培養(yǎng)14 d 的處理和增殖培養(yǎng)7 d 的處理其體胚產(chǎn)量之間差異顯著（<0.05）。增殖培養(yǎng)7 d 的處理體胚產(chǎn)量最低為47 個(gè)·g。增殖培養(yǎng)14 d 處理的體胚產(chǎn)量遠(yuǎn)高于增殖培養(yǎng)7 d 的處理，約為增殖培養(yǎng)7 d 處理體胚產(chǎn)量的2.7倍（見(jiàn)圖1）。

圖1 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松體胚產(chǎn)量的影響處理1. 2 mg·L-1 2，4-D+0.5 mg·L-1 6-BA、蔗糖、繼代14 d；處理2.1 mg·L-1 2，4-D+0.25 mg·L-1 6-BA、處理3. 2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA；處理4.1 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 6-BA；處理5.無(wú)激素；同一測(cè)定指標(biāo)上不同字母代表P<0.05差異顯著；下同F(xiàn)ig.1 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on somatic embryo yield of P.koraiensisTreatment 1. 2 mg·L-1 2，4-D+0.5 mg·L-1 6-BA，sucrose，subculture for 14 d；Treatment 2. 1 mg·L-1 2，4-D+0.25 mg·L-1 6-BA；Treat?ment 3. 2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA；Treatment 4. 1 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 6-BA；Treatment 5. No hormone；Different letters on the same measurement index represent P<0.05，the same as below

2.4不同增殖培養(yǎng)處理方式的生理特性

在紅松愈傷組織增殖培養(yǎng)過(guò)程中，不同增殖培養(yǎng)方式顯著影響紅松胚性愈傷組織細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（<0.05）。在不同激素處理中，無(wú)激素處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（1.54 g·g），1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA 處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（2.50 g·g）。在不同的碳源類(lèi)型中，碳源為蔗糖的處理與其他碳源處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（<0.05）。碳源為葡萄糖的處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為0.77 g·g。在不同增殖培養(yǎng)周期中，增殖培養(yǎng)7 d的處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（2.75 g·g）為增殖培養(yǎng)14 d處理的1.14倍。在所有增殖培養(yǎng)類(lèi)型中，對(duì)照處理淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（6.53 g·g）。在不同激素處理中，1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA，1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間差異不顯著。在不同的碳源類(lèi)型中，碳源為葡萄糖的處理中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（2.05 g·g），約為對(duì)照（碳源為蔗糖）處理淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1/3（圖2～3）。

圖2 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松胚性愈傷組織可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on soluble sugar mass fraction in embryogenic callus of P.koraiensis

圖3 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松胚性愈傷組織可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on soluble starch mass fraction in embryogenic callus of P.koraiensis

2.4.2 可溶性蛋白分析

不同的激素處理的紅松胚性愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著（=0.199）。其質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在0.81 mg·g左右。1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為0.67 mg·g左右，與對(duì)照的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相似。在不同的碳源類(lèi)型中，碳源為麥芽糖的處理分別與碳源為蔗糖和果糖的處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，與碳源為葡萄糖的處理差異則不顯著。碳源為麥芽糖的處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為0.96 mg·g（見(jiàn)圖4）。

圖4 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松胚性愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on soluble protein mass fraction in embryogenic callus of P.koraiensis

在紅松愈傷組織增殖過(guò)程中，不同增殖培養(yǎng)方式對(duì)紅松愈傷組織CAT、POD、SOD 活性差異顯著（<0.05）。在不同激素類(lèi)型中，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理CAT 活性最高（129.70 μmol·min·g），相較于對(duì)照增加了約3 倍（見(jiàn)圖5）。1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA處理POD活性最高（2 157.60 U·mg），其次是2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理POD 活性（1 968.93 U·mg）（見(jiàn)圖6）。SOD 活性與POD 的活性趨勢(shì)相似，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理SOD 活性最高（612.93 U·mg），其次是2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理SOD活性（601.99 U·mg）（見(jiàn)圖7）。在不同的碳源類(lèi)型中，碳源為蔗糖的處理CAT 活性與其他碳源類(lèi)型處理差異顯著（<0.05），POD 和SOD 活性與碳源為麥芽糖的處理差異不顯著，與碳源為果糖的處理差異顯著（<0.05）。在不同增殖培養(yǎng)周期中，增殖培養(yǎng)7 d 的處理CAT 活性最高（229.79 μmol·min·g）相較于對(duì)照處理增加了6倍。

圖5 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松胚性愈傷組織中CAT活性的影響Fig.5 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on CAT activity in embryogenic callus of P.koraiensis

圖6 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松胚性愈傷組織中POD活性的影響Fig.6 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on POD activity in embryogenic callus of P.koraiensis

圖7 激素、碳源類(lèi)型和增殖培養(yǎng)周期對(duì)紅松胚性愈傷組織中SOD活性的影響Fig.7 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on SOD activity in embryogenic callus of P.koraiensis

3 討論

3.1增殖培養(yǎng)基中的激素濃度對(duì)體胚發(fā)生的影響

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是植物離體培養(yǎng)所必須的激素，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的不同比值和類(lèi)型不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，而且能控制細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生。在長(zhǎng)白落葉松（）中研究發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)造成無(wú)法正常增殖的現(xiàn)象。在增殖階段應(yīng)該及時(shí)去掉或降低2，4-D濃度，這樣既有利于胚性愈傷組織的增殖，也有利于后期更多的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)化為胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)。此外，有研究表明，在愈傷組織增殖階段，用NAA 代替2，4-D 更有利于以后體胚的發(fā)生，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)在含2，4-D的培養(yǎng)基上易造成體細(xì)胞胚成熟能力的喪失。本研究在培養(yǎng)基中添加1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理比添加2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理效果好，同時(shí)添加NAA 效果比添加2，4-D 的效果更好，分別印證了這些觀點(diǎn)。我們的研究表明，在1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理組合下獲得最多的體胚產(chǎn)量（166 個(gè)·g），同時(shí)該處理下愈傷組織中CAT 活性較低，POD 活性較高。有研究指出，在細(xì)胞脫分化和胚的早期發(fā)育過(guò)程中，CAT 活性低，而POD 活性高，這可能是不同時(shí)期的過(guò)氧化氫由不同酶來(lái)催化清除，使生物抗氧化系統(tǒng)處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中。此外，Marco的研究指出，POD活性與細(xì)胞壁的松動(dòng)、延伸、和交聯(lián)有關(guān)，它們調(diào)控細(xì)胞壁的可塑性，影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂速度。說(shuō)明1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理POD 活性促進(jìn)細(xì)胞分裂有助于體胚發(fā)生。這與詹園鳳等在大蒜（）體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)POD 對(duì)體胚誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用的報(bào)道相似。

3.2增殖培養(yǎng)基中的碳源對(duì)體胚發(fā)生的影響

碳源不僅為培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育代謝提供所需的能量和底物，而且調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透勢(shì)。在植物組織培養(yǎng)中，蔗糖是最常用的碳源和滲透調(diào)節(jié)劑。在培養(yǎng)基中添加蔗糖有利于體細(xì)胞胚干物質(zhì)的積累，對(duì)促進(jìn)體胚發(fā)生尤其是子葉胚的形成發(fā)揮了重要的作用。在本研究中，碳源為蔗糖的處理體胚產(chǎn)量最高（127 個(gè)·g），同時(shí)該處理下糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于碳源為葡萄糖、麥芽糖和果糖的處理。說(shuō)明碳源為蔗糖的處理中積累了體胚發(fā)生所需要的充足能量，為進(jìn)一步的體胚發(fā)生奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。與此同時(shí)，碳源為蔗糖處理中CAT 活性最低相較于其他碳源處理，而POD 活性最高。有報(bào)道指出，CAT 活性與植物抗逆性有關(guān)，與植物老化也有一定的關(guān)系，在老化的組織中其活性最強(qiáng)。一般認(rèn)為，CAT 活性與器官代謝強(qiáng)弱有關(guān)，代謝強(qiáng)，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫副產(chǎn)物就多，CAT 活性相對(duì)較高。而本研究中CAT 活性低說(shuō)明愈傷組織還尚未老化，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。此外，在愈傷組織細(xì)胞存在活性氧和自由基時(shí)，SOD活性會(huì)迅速增加消除此類(lèi)物質(zhì)避免細(xì)胞受到傷害，培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)SOD 活性在體胚發(fā)生早期迅速增加，說(shuō)明SOD 可能對(duì)體胚發(fā)生有促進(jìn)作用。而碳源為蔗糖的處理中SOD 活性相對(duì)較高，說(shuō)明有利于細(xì)胞正常分裂和分化從而促進(jìn)體胚發(fā)生。綜上所述，蔗糖為紅松愈傷組織體胚發(fā)生的最適碳源。

3.3增殖培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生的影響

適宜的增殖培養(yǎng)周期，對(duì)于保持愈傷組織良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和促進(jìn)其代謝十分有利。細(xì)胞增殖及代謝物的合成都需要大量能量和營(yíng)養(yǎng)成分，在培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分沒(méi)有完全耗盡的情況下，及時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，為細(xì)胞迅速增殖創(chuàng) 造 條 件。秦 彩 云 等在 青 海 云 杉（）的研究中發(fā)現(xiàn)，增殖培養(yǎng)周期為14 d 的愈傷組織既能保持胚性，又能獲得較大的增殖量，而在海岸松（）的研究中發(fā)現(xiàn)每周1次的繼代培養(yǎng)，使老化效應(yīng)最小化，有利于海岸松體細(xì)胞胚的早期發(fā)育。在本研究中，增殖培養(yǎng)周期為14 d獲得的體胚產(chǎn)量最多（127個(gè)·g）。增殖培養(yǎng)周期為7 d 的處理和增殖培養(yǎng)周期為14 d 的處理中淀粉、可溶性糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著，說(shuō)明其都具有體胚發(fā)生所需要的能量物質(zhì)。Peng 等的研究說(shuō)明喪失胚性愈傷組織細(xì)胞內(nèi)可能積累過(guò)高的HO從而喪失胚性。此外，Cui 等對(duì)寧夏枸杞（）體胚發(fā)生的研究中也認(rèn)為，適量的H0濃度對(duì)寧夏枸杞體胚發(fā)生有促進(jìn)作用，過(guò)高的HO濃度對(duì)寧夏枸杞體胚發(fā)生則有抑制作用。本研究中增殖培養(yǎng)7 d 的處理CAT 活性顯著高于增殖培養(yǎng)14 d 的處理中CAT 活性，可能是HO等代謝產(chǎn)物增多，產(chǎn)生毒害作用，從而喪失胚性。由此可以看出增殖培養(yǎng)周期過(guò)短，不利于后期體胚的發(fā)育和成熟。與此同時(shí)，增殖培養(yǎng)周期過(guò)短，提高成本加大了工作量，隨著增殖培養(yǎng)次數(shù)的增加，變異率也會(huì)提高，且體胚發(fā)生潛力逐漸下降甚至消失。

4 結(jié)論

在1 mg·LNAA 和0.25 mg·L6-BA 組合下，碳源為蔗糖，增殖培養(yǎng)周期為14 d 所獲得的紅松體胚產(chǎn)量最多（166個(gè)·g）。在胚性愈傷組織增殖的過(guò)程中，儲(chǔ)藏物質(zhì)為紅松的體胚發(fā)生提供充足的能量來(lái)源，為其體胚發(fā)生奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；CAT 活性過(guò)高不利于愈傷組織體胚發(fā)生，可能是HO等代謝產(chǎn)物增多，產(chǎn)生毒害作用。