車 健, 馬 丁, 王 進(jìn)

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009; 2.同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200082)

0 引 言

微生物通過硝化-反硝化和厭氧氨氧化過程將氨氮轉(zhuǎn)化為N2O或N2,是陸地生態(tài)系統(tǒng)氮損失的重要途徑[1]。近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)一種新型的氨氧化耦合鐵還原的氮流失途徑,該過程以NH4+作為電子供體,Fe3+作為電子受體,即鐵氨氧化(Feammox)[2]。Feammox過程可以產(chǎn)生氮?dú)?N2)、硝酸鹽(NO3-)、亞硝酸鹽(NO2-)。Feammox過程已在多種環(huán)境下被證實(shí),包括熱帶森林土壤[3]、水稻土壤[2]、長江口潮間帶濕地[4]、紅樹林濕地[5]等。文獻(xiàn)[3]通過同位素示蹤技術(shù)首次在熱帶旱地土壤中發(fā)現(xiàn)Feammox現(xiàn)象,其研究結(jié)果表明,在熱帶旱地土壤中Feammox速率(以N計(jì),下同)為 0.32 mg/(kg·d),估算每年在0 ～ 10 cm熱帶旱地土壤中通過Feammox造成的氮損失(以NH4+-N 計(jì))為1 ～ 4 kg/(hm2·a);文獻(xiàn)[2]發(fā)現(xiàn)在不同年代水稻土中Feammox速率為(0.17±0.01)～(0.59±0.03) mg/(kg·d),并且通過與未被耕作的土壤相比較,發(fā)現(xiàn)已耕作土壤Feammox速率顯著高于未被耕作的土壤;文獻(xiàn)[4]研究表明,在潮間帶濕地中Feammox潛在速率為(0.24～ 0.36) mg/(kg·d),在春潮期間沉積物中Feammox速率普遍高于小潮期間,潮汐波動影響鐵還原細(xì)菌的生長和Fe(Ⅲ)的還原,由此影響Feammox速率以及潮間帶濕地中氮元素向大氣中轉(zhuǎn)化的過程。

同時(shí),微生物介導(dǎo)的異化鐵還原過程也是重要的生物地球化學(xué)過程,具有異化鐵還原功能的微生物廣泛存在于厭氧土壤、沉積物環(huán)境中。文獻(xiàn)[2-4]研究表明,在Feammox培養(yǎng)過程中異化鐵還原菌相對豐度也顯著提高,但當(dāng)異化鐵還原過程與Feammox同時(shí)發(fā)生時(shí),Feammox過程貢獻(xiàn)的Fe(Ⅲ)還原僅占總鐵還原的0.9%～3.0%,異化鐵還原過程仍然處于主導(dǎo)地位。由于異化鐵還原過程與Feammox過程共存時(shí)會競爭電子受體鐵,土壤中Fe(Ⅲ)的含量及形態(tài)對Feammox過程可能產(chǎn)生重要影響,目前在該方面的研究報(bào)道很少。

我國南方地區(qū)水稻土采用周期性的淹水-落干管理措施,其中的人工施肥過程為Feammox提供了良好的條件。水鐵礦作為鐵循環(huán)過程的重要中間產(chǎn)物,在水稻土中含量豐富,其具有較高的表面活性和生物可利用性。目前考察水鐵礦和Feammox過程之間相互作用的相關(guān)研究很少,其潛在的機(jī)制尚未闡明。

本文以水稻土為研究對象,通過厭氧培養(yǎng)及乙炔抑制技術(shù),研究表層水稻土中的Feammox過程,通過對比分析培養(yǎng)體系中N2產(chǎn)率,探討外加水鐵礦對Feammox轉(zhuǎn)化途徑及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,為進(jìn)一步了解Feammox拓展氮元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的水稻土取自長沙市長沙縣(113°7′E,28°10′N),用長鏟取0～ 10 cm深度的土壤,取樣量約為2 kg,所取土壤均放于無菌采樣袋中,并記錄時(shí)間、地點(diǎn),隨后迅速放入冰盒中,用保濕劑和脫氧劑保存。樣品采集后12 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。土壤樣本返回實(shí)驗(yàn)室后,立即在厭氧手套箱中均勻分成以下3個(gè)部分:第1部分樣品用于厭氧預(yù)培養(yǎng)過程,以耗盡土壤本身所存在的O2、NO2-和NO3-;第2部分樣品儲存在4 ℃冰箱中,用于測定土壤的理化特性,包括pH值、含水率w、氧化還原電位、無機(jī)氮質(zhì)量比、總鐵(total Fe,TFe)質(zhì)量比wTFe和總有機(jī)碳(total organic carbon,TOC)質(zhì)量比wTOC;第3部分樣品儲存在-80 ℃冰箱中,用于微生物群落分析。土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)取值見表1所列。

表1 土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)取值

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 所有的土壤樣品都在厭氧手套箱中進(jìn)行培養(yǎng),厭氧手套箱中充滿高純氬(Ar)。

(2) 對土壤樣品通過人工去除雜質(zhì),然后過220目篩;培養(yǎng)前,以質(zhì)量比3∶1的比例向新鮮土樣中加入滅菌后的去離子水,使土壤成漿;用超高純度He以100 mL/min沖洗土壤泥漿至少10 min,以去除土壤中溶解的O2。

(3) 實(shí)驗(yàn)中所有血清瓶均用丁基橡膠隔片密封,鋁蓋卷曲;然后將瓶子置于黑暗條件下35 ℃預(yù)培養(yǎng)28 d,以去除土壤中原有的氧(O2)、硝酸鹽(NO3-)、亞硝酸鹽(NO2-)和其他潛在的電子受體。

(4) 預(yù)培養(yǎng)完成后,將19 mL均勻的土壤泥漿轉(zhuǎn)移到50 mL血清瓶中,加入5 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分為:2.52 g/L NaHCO3、0.6 g/L KH2PO4、0.4 g/L MgCl2·6H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、維生素溶液1 mL、微量元素溶液1 mL。每升微量元素成分為:乙二胺四乙酸(EDTA)15 g、ZnSO4·7H2O 430 mg、CoCl2·6H2O 240 mg、MnCl2·4H2O 990 mg、CuSO4·5H2O 250 mg、NaMoO4·2H2O 220 mg、NiCl2·6H2O 190 mg、NaSeO4·10H2O 210 mg、H3BO4·2H2O 14 mg。

(5) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需求加入NH4Cl(5 mmol/L)和水鐵礦。水鐵礦采用氯化鐵溶液和氫氧化鈉溶液制備[6]。

(6) 每瓶鼓Ar 5 min后密封,C2H2處理組密封后抽取頂口6 mL氣體置換為C2H2,每組做3個(gè)平行樣。

本文實(shí)驗(yàn)分為9個(gè)處理體系,實(shí)驗(yàn)分組見表2所列。

表2 實(shí)驗(yàn)分組

所有需要添加C2H2的處理組,在鼓Ar密封后使用注射器抽取6 mL頂口氣體置換為C2H2,使頂空φ(C2H2)達(dá)到30%。研究表明,C2H2不僅可以抑制氧化亞氮還原酶活性,阻止N2O還原成N2,還可以抑制厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, Anammox)的過程[4]。所有組均以100 r/min搖晃3 min搖勻,隨后將所有小瓶置于35 ℃恒溫條件下暗培養(yǎng)28 d。

1.3 指標(biāo)測定及分析方法

1.3.1 基本指標(biāo)測定方法

采用Mettler-Toledo pH計(jì)測定土壤樣品pH值。對于土壤樣品的TOC,先經(jīng)過1 mol/L HCl浸出,除去碳酸鹽后采用Jena C/N (3100,TOC,德國耶拿分析儀器股份公司)測定土樣中wTOC。對樣品土壤使用2 mol/L KCl溶液萃取2 h,然后用氣相分子吸收光譜儀(GMA33xx,上海北裕分析儀器股份有限公司)測定土壤中的NH4+、NO3-和NO2-。對于N2的測定,采用氣相色譜法(Trace 1300,Thermo氣相色譜儀)測定培養(yǎng)后產(chǎn)生的N2。在氣體取樣完成后,對土壤泥漿進(jìn)行取樣,采用鄰菲羅啉法測定鹽酸可提取的Fe(Ⅱ)和可提取的總鐵[7]。

1.3.2 微生物群落分析

在本實(shí)驗(yàn)中,取0.5 g的土壤樣品通過FastDNA Spin Kit (美國MP Biomedicals公司)試劑盒提取DNA,采用分光光度計(jì)(ND-1000,美國Nanodrop公司)測定所提取DNA的濃度和純度,然后在-20 ℃保存。為了構(gòu)建焦磷酸測序基因文庫,提取的DNA分別用515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和806R (5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)引物擴(kuò)增16S rRNA的V4區(qū)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增體系為15 μL 2×Taq master Mix、1 μL Bar-PCR primer F (10 μmol/L)、1μL Primer R (10 μmol/L)、10～20 ng Genomic DNA、無菌水30 μL。PCR程序?yàn)?94 ℃ 3 min (初始步驟);94 ℃保持30 s(熔化),在53 ℃保持40 s(退火),在72 ℃保持5 min (延長),進(jìn)行28個(gè)循環(huán)。使用16S rRNA PCR產(chǎn)物在Illumina Miseq平臺上進(jìn)行測序,測序服務(wù)由商業(yè)公司(Majorbio)提供。

1.3.3 分析方法

采用SPSS軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。采用方差分析比較N2產(chǎn)率,用Pearson相關(guān)分析評價(jià)Fe(Ⅲ)還原率與N2產(chǎn)率的相關(guān)性。各組間的顯著性水平設(shè)為p< 0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 N2產(chǎn)生速率

本實(shí)驗(yàn)中,所有操作均在厭氧手套箱中進(jìn)行,以避免發(fā)生好氧硝化作用。所有的土壤泥漿均經(jīng)過28 d的厭氧預(yù)培養(yǎng),以去除土壤中的O2和NOx-。在厭氧培養(yǎng)體系中氨氮直接通過Feammox產(chǎn)生N2,或者通過Feammox產(chǎn)生的NOx-,再耦合Anammox或反硝化過程轉(zhuǎn)化為N2,因此氨氮均需要通過Feammox過程轉(zhuǎn)化[3]。氨氮直接通過Feammox過程產(chǎn)生N2的反應(yīng)式為:

3Fe(OH)3+5H++NH4+→
3Fe2++9H2O+0.5N2

(1)

氨氮通過Feammox過程氧化為硝酸鹽和亞硝酸鹽的反應(yīng)式為:

6Fe(OH)3+10H++NH4+→
6Fe2++16H2O+NO2-

(2)

8Fe(OH)3+14H++NH4+→
8Fe2++21H2O+NO3-

(3)

同時(shí),TOC作為有機(jī)質(zhì)的電子供體,被認(rèn)為是土壤環(huán)境中影響Feammox過程的重要環(huán)境因子[8]。本研究中,土壤樣品wTOC為1.85%,已報(bào)道Feammox發(fā)生地中wTOC為0.56%～2.16%[8],本實(shí)驗(yàn)土壤wTOC符合Feammox的發(fā)生條件。

不同水鐵礦濃度下N2產(chǎn)生速率如圖1所示。

圖1 不同水鐵礦濃度下N2產(chǎn)生速率

由圖1可知,在所有添加NH4+和NH4++C2H2處理組中均能檢測到N2生成。由于C2H2抑制了反硝化和Anammox過程,因此可以用NH4+組和NH4++C2H2組N2產(chǎn)生速率的差值表示直接通過Feammox途徑產(chǎn)生N2的速率。添加NH4+組N2的產(chǎn)生速率為(0.85±0.14)～(1.09±0.20) mg/(kg·d),添加NH4++C2H2組為(0.42±0.09)～(0.69±0.11)mg/(kg·d)。水鐵礦的加入提高了N2的產(chǎn)率,NH4++10 mmol/L水鐵礦處理組N2的產(chǎn)生速率為(0.86±0.15) mg/(kg·d),較NH4+處理組提高1.18%。NH4++50 mmol/L水鐵礦處理組N2產(chǎn)生速率為(1.09±0.20) mg/(kg·d),較NH4+處理組有顯著提高,提高率為28.24%。同時(shí),NH4++C2H2組中的N2產(chǎn)生速率為(0.42±0.09)mg/(kg·d),較NH4+組具有顯著差異(p<0.05)。NH4Cl+10 mmol/L水鐵礦+C2H2組、NH4Cl+50 mmol/L水鐵礦+C2H2組N2產(chǎn)生速率分別為(0.46±0.11) mg/(kg·d)、(0.69±0.11) mg/(kg·d),與NH4+組相比,N2產(chǎn)生速率分別增加9.52%、64.29%(p<0.05)。

文獻(xiàn)[9]研究表明,在沉積物、土壤和純培養(yǎng)3種條件下,當(dāng)體系中C2H2的分壓大于0.7 kPa時(shí),其可以完全抑制反硝化過程中N2O的還原;文獻(xiàn)[10]研究發(fā)現(xiàn)Anammox對C2H2更敏感,當(dāng)C2H2分壓大于70 Pa時(shí),C2H2對Anammox過程的抑制率為95%。由于所有添加C2H2的實(shí)驗(yàn)組中C2H2抑制了反硝化和Anammox過程,添加C2H2組中的N2由氨氮直接通過Feammox過程產(chǎn)生，產(chǎn)生N2速率為0.42～0.69 mg/(kg·d)。當(dāng)加入水鐵礦后,Feammox速率顯著提高,表明水鐵礦的加入促進(jìn)了Feammox過程。水鐵礦作為非晶體鐵氧化物，更易于微生物的生物利用,文獻(xiàn)[11]研究表明,在純培養(yǎng)條件下具有Feammox功能的微生物Acidimicrobiaceaebacterium A6在以水鐵礦為電子受體時(shí)具有最高的氨氧化速率。水鐵礦的加入可為Feammox過程提供更多的電子受體,提高Feammox反應(yīng)速率。

文獻(xiàn)[12]研究表明，F(xiàn)eammox過程可以生成NO3-或NO2-;文獻(xiàn)[3]從熱力學(xué)角度研究表明,可以通過Feammox過程產(chǎn)生NO3-。在本研究中,根據(jù)(1)式計(jì)算,未添加水鐵礦組直接通過Feammox過程N(yùn)2產(chǎn)生速率為0.42 mg/(kg·d),占Feammox過程所產(chǎn)總N2的49.41%。添加10、50 mmol/L水鐵礦組中直接通過Feammox過程產(chǎn)生N2速率分別為(0.86±0.15) mg/(kg·d)、(1.09±0.20) mg/(kg·d),其占Feammox過程所產(chǎn)總N2的54.14%、62.82%,分別比無水鐵礦處理組高4.73%、13.41%。因此,水鐵礦的加入促進(jìn)了氨氮直接通過Feammox轉(zhuǎn)化為N2。

2.2 Fe(Ⅲ)還原速率及其相關(guān)性分析

不同水鐵礦濃度下Fe(Ⅲ)還原速率(以Fe計(jì)，下同)如圖2所示。

圖2 不同水鐵礦濃度下Fe(Ⅲ)還原速率

在所有未添加氨氮的對照組中均可檢測到Fe(Ⅱ),鐵還原速率為0.37～0.41 g/(kg·d),其主要是以有機(jī)物為電子供體的異化鐵還原過程產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)。

向水稻土中加入NH4+后促進(jìn)了Fe(Ⅲ)的還原,鐵還原速率為0.69 g/(kg·d),這是由于體系中發(fā)生了以Fe(Ⅲ)作為電子受體的Feammox過程。NH4++10 mmol/L水鐵礦組中的Fe(Ⅲ)還原速率較只添加NH4+組顯著提高(p<0.05),鐵還原速率為0.78 g/(kg·d)。再加入50 mmol/L水鐵礦時(shí),隨著水鐵礦濃度的進(jìn)一步提升,鐵還原速率進(jìn)一步提高,鐵還原速率為0.88 g/(kg·d)。

已有研究表明[11],Feammox過程對于土壤中可利用的鐵氧化物具有很強(qiáng)的依賴性,并且土壤中的鐵氧化物會促進(jìn)Feammox過程的進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)中,對比NH4+組、NH4++10 mmol/L水鐵礦組和NH4++50 mmol/L水鐵礦組發(fā)現(xiàn),在加入10、50 mmol/L水鐵礦后,反應(yīng)體系中的鐵還原速率有顯著提高,分別提高13.04%、27.57%。因此,水鐵礦的加入促進(jìn)Fe(Ⅲ)還原過程,同時(shí)提高了Feammox反應(yīng)速率。

由圖2可知,相較于對照組,在加入NH4+和水鐵礦后,Fe(Ⅲ)的還原速率明顯提高。Fe(Ⅲ)作為Feammox過程中重要的影響因素,其還原速率與N2的產(chǎn)生速率具有很強(qiáng)的相關(guān)性,R2=0.901，p< 0.01,相關(guān)性擬合曲線如圖3所示。

從圖3可以看出,隨著Fe3+還原速率的升高,N2產(chǎn)生速率也相應(yīng)升高,這進(jìn)一步說明Fe(Ⅲ)在Feammox過程中發(fā)揮了重要作用。文獻(xiàn)[13]研究表明,弱酸性土壤提高了金屬離子的生物利用度;文獻(xiàn)[14]研究表明,充足的有機(jī)質(zhì)有利于土壤黏土礦物中結(jié)構(gòu)性鐵的釋放,也可能促進(jìn)Feammox過程的發(fā)生。在本研究中,土壤呈弱酸性,富含有機(jī)質(zhì),更加有利于NH4+作為電子供體、Fe(Ⅲ)作為電子受體,通過Feammox過程將NH4+轉(zhuǎn)化為NOx-或直接轉(zhuǎn)化為N2。

圖3 Fe(Ⅲ)還原速率與N2產(chǎn)生速率相關(guān)性擬合曲線

2.3 微生物群落分析

不同實(shí)驗(yàn)組中主要門的相對豐度如圖4所示。

實(shí)驗(yàn)組別圖4 不同實(shí)驗(yàn)組中主要門的相對豐度

在對照組中優(yōu)勢菌種為綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、變形桿菌門(Proteobactria)和放線菌門(Actinobacteria),其相對豐度分別為26.10%、24.07%、19.62%、7.78%。NH4+的添加增加了厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度,相對豐度分別為6.00%、12.51%,相對于對照組分別提高2.79%、4.74%。再添加50 mmol/L水鐵礦后厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度進(jìn)一步提高,相對豐度為10.09%,相對于對照組提高6.88%。據(jù)報(bào)道,在門水平上,酸桿菌門(Acidobacteria)、變形桿菌門(Proteobactria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)被歸類為鐵還原菌[15]。已有研究表明,鐵還原過程對土壤氮元素遷移轉(zhuǎn)化有顯著影響[16]。在Feammox過程中,鐵還原微生物可能與N2產(chǎn)生過程有關(guān),鐵還原菌的相對豐度隨著Feammox速率的增加而提高,但目前對能夠直接參與Feammox過程的微生物報(bào)道較少,Feammox功能菌尚不明晰[17]。

本研究中厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度約為3.21%～6.01%,其中以梭菌屬(Clostridium)為優(yōu)勢微生物,Clostridium是土壤中常見的發(fā)酵型異化鐵還原菌,能夠利用乙酸等有機(jī)碳源作為電子供體還原Fe(Ⅲ)[18]。不同實(shí)驗(yàn)組中主要屬水平微生物相對豐度如圖5所示。在對照組中,Clostridium的相對豐度為0.54%,在添加NH4+后其相對豐度達(dá)到0.82%,之后隨著50 mmol/L水鐵礦的加入,其相對豐度進(jìn)一步提高,達(dá)到1.46%。文獻(xiàn)[19]研究發(fā)現(xiàn)ClostridiumbeijerinckiiZ能夠利用有機(jī)物還原Fe(Ⅲ)。本研究的土壤呈弱酸性,適合Clostridium生長,同時(shí)長期的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程提供了充足的有機(jī)質(zhì)作為電子供體，在添加50 mmol/L水鐵礦處理組中,Clostridium相對豐度顯著提高,因此Feammox過程可能與Clostridium具有協(xié)同促進(jìn)作用。

圖5 不同實(shí)驗(yàn)組中主要屬水平微生物相對豐度

Anaeromyxobacter是隸屬δ變形菌門的呼吸型異化鐵還原菌,廣泛分布在厭氧沉積環(huán)境中,是一種能夠具有金屬還原功能的厭氧黏細(xì)菌[20]。本研究中,對照組中Anaeromyxobacter的相對豐度為0.29%,在添加NH4+后其相對豐度達(dá)到0.89%,再加入50 mmol/L水鐵礦后,其相對豐度進(jìn)一步提高,為1.01%。雖然這些鐵還原微生物的豐度與N2的產(chǎn)生有顯著的正相關(guān)關(guān)系,但沒有足夠的證據(jù)表明它們直接參與了Feammox過程。文獻(xiàn)[11]分離了一株具有厭氧鐵還原耦合氨氧化功能的細(xì)菌Acidimicrobiaceaebacterium A6,其可以將氨氮最終氧化為NO2-。本研究還發(fā)現(xiàn)一種unculturedAcidimicrobiaceae屬微生物,在對照組中,其相對豐度為1.09%,在NH4+組和NH4++50 mmol/L水鐵礦處理組中,其相對豐度明顯提高,分別達(dá)到2.39%、2.87%。然而,由于技術(shù)限制,本研究無法對系統(tǒng)中的Acidimicrobiaceae屬微生物進(jìn)行更加詳細(xì)細(xì)致的鑒定。同時(shí),文獻(xiàn)[11]報(bào)道的Acidimicrobiaceaebacterium A6細(xì)菌并不具有將氨氮氧化為N2的能力。Feammox過程功能微生物尚需進(jìn)一步探究。

3 結(jié) 論

(1) 本研究通過模擬培養(yǎng)和乙炔抑制技術(shù)證明水稻土中存在Feammox過程,外加水鐵礦有利于提高Feammox過程N(yùn)2產(chǎn)生速率。

(2) 水鐵礦的加入能夠促進(jìn)氨氮直接通過Feammox過程氧化為N2,隨著水鐵礦濃度從10 mmol/L增加到50 mmol/L,Feammox過程直接產(chǎn)N2占總產(chǎn)N2途徑的比例從49.41%增加到62.82%。

(3) 高通量測序結(jié)果表明,隨著Feammox過程產(chǎn)N2速率的增加,unculturedAcidimicrobiacea、Anaeromyxobacter和Clostridium的相對豐度顯著提高,其可能參與了Feammox過程,或與Feammox過程具有協(xié)同關(guān)系。