施 洋, 熊善強(qiáng), 胡曉波, 張競(jìng)成, 劉 詠, 王軍輝,

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601; 2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 3.合肥工業(yè)大學(xué) 分析測(cè)試中心,安徽 合肥 230009)

多糖是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物中的天然生物大分子[1]。文獻(xiàn)[2]從不同材料中分離出的多糖皆具有多種生物學(xué)活性,包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性等。植物多糖具有多種藥理活性且無(wú)毒性的特點(diǎn)引起了廣泛關(guān)注,近年來(lái)有關(guān)植物多糖結(jié)構(gòu)和活性鑒定的研究較多，如具有免疫調(diào)節(jié)活性的人參多糖[3]、具有抗炎活性的辣木根多糖等[4]。研究表明,植物多糖可作為潛在的功能性食品或藥物成分以替代具有明顯副作用的化學(xué)合成藥物。

蒼耳子(FructusXanthii)為草本菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatrinexWidder)的帶總苞果實(shí),含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,如多糖、亞油酸、蒼耳苷以及醇、酯、酸等多種揮發(fā)油[5]。作為一種常見(jiàn)中草藥,具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及抗菌等多種藥理作用[6],但由于對(duì)蒼耳子現(xiàn)有研究較少,其應(yīng)用與推廣受到限制,大大降低了蒼耳子的藥用價(jià)值,造成了資源浪費(fèi)與經(jīng)濟(jì)損失。因此,有必要通過(guò)理化性質(zhì)和生物學(xué)活性方面的探索,綜合利用蒼耳子多糖,以開(kāi)發(fā)保健品和藥品。

我國(guó)蒼耳子分布極其廣泛,但目前對(duì)蒼耳子的研究主要集中于提取優(yōu)化和化學(xué)成分分析[7-8],有關(guān)提取方法對(duì)多糖理化性質(zhì)和生物學(xué)活性影響的報(bào)道并不多。本文旨在以蒼耳子作為原材料,通過(guò)清除自由基、氣相色譜(gas chromatography,GC)以及傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)等方法探究不同方法提取的多糖理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的差異,該研究為蒼耳子多糖的研究和開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒼耳子購(gòu)自于安徽省亳州市弘揚(yáng)中藥店,并經(jīng)合肥工業(yè)大學(xué)王軍輝教授鑒定屬菊科植物蒼耳帶總苞果實(shí)。

主要試劑有牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、無(wú)水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、甲醇、硼氫化鈉、水楊酸、氯仿、冰醋酸等，均為分析純。購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 蒼耳子多糖的提取

1.2.1 蒼耳子原料預(yù)處理

將干燥的蒼耳子經(jīng)高速藥物粉碎機(jī)粉碎,過(guò)80目篩,置于索氏提取器中用丙酮溶液脫色脫脂后烘干備用。

1.2.2 順序提取蒼耳子多糖

將1 g蒼耳子粉末與20 mL去離子水混合,沸水提取2 h,過(guò)濾獲得濾液和濾渣,重復(fù)提取2次,再將濾液濃縮、離心、Sevag法脫蛋白、80%乙醇醇沉24 h、透析和凍干,獲得多糖WXP。然后將濾渣用2 000 mL濃度為0.05 mol/L的EDTA、醋酸鈉和草酸鈉溶液在70 ℃下恒溫水浴2 h,過(guò)濾后重復(fù)上述步驟獲得螯合劑提多糖CXP。隨后,再依次使用0.05、1.00 mol/L的NaOH溶液在4 ℃下浸提濾渣2 h,過(guò)濾獲得濾液,使用乙酸中和濾液至pH=7,重復(fù)提取2次,再將濾液濃縮、離心、Sevag法脫蛋白、80%乙醇醇沉24 h、透析和凍干,獲得多糖BXP、AXP。

1.3 蒼耳子多糖的理化性質(zhì)研究

1.3.1 化學(xué)成分測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9],考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10],咔唑比色法測(cè)定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11]。

1.3.2 單糖組成分析

根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法并加以修改,稱取5 mg樣品于安瓿瓶中,加入4 mL TFA(3 mL TFA和16.5 mL水),封管,110 ℃水解4 h,使用甲醇共蒸除去TFA,再加入3 mL超純水將水解后的多糖完全溶解,加入30 mg硼氫化鈉室溫還原3 h后,將過(guò)量的硼氫化鈉通過(guò)25%乙酸中和,使用甲醇共蒸后,放于120 ℃烘箱中30 min以除去水分,再加入4 mL乙酸酐與3 mL吡啶于100 ℃下反應(yīng)1 h,通過(guò)甲苯共蒸以除去乙酸酐,使用3 mL氯仿萃取乙酰化產(chǎn)物,并數(shù)次加入等量蒸餾水洗滌氯仿層直至水層澄清,加入適量無(wú)水Na2SO4以除盡水分,取1 mL過(guò)有機(jī)濾膜(孔徑為0.22 μm)后移到進(jìn)樣瓶,通過(guò)氣相色譜(gas chromatography,GC)分析測(cè)定蒼耳子多糖的單糖組分。

1.3.3 FTIR分析

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法并加以修改,采用壓片法,使用Nicolet Nexus 67 FTIR光譜儀在 400～4 000 cm-1區(qū)內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.4 生物學(xué)活性研究

1.4.1 DPPH自由基清除能力

分別配制1 mL的 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL樣品溶液,與2 mL 0.02 mg/mL的DPPH-乙醇溶液混合均勻,放于暗處?kù)o置反應(yīng)30 min。在517 nm處測(cè)定吸光度,以蒸餾水為空白對(duì)照,以Vc為陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式為:

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%,

其中:Ai為蒼耳子多糖溶液與DPPH溶液的吸光度;Aj為蒼耳子多糖溶液與乙醇溶液的吸光度;A0為蒸餾水與DPPH溶液的吸光度。

1.4.2 羥基自由基清除能力

分別配制1 mL的 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL樣品溶液,依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液以及0.05 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.024%的H2O2溶液,37 ℃水浴30 min,在510 nm處測(cè)定吸光度。蒸餾水為空白對(duì)照,Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式如下:

清除率=[1-(Am-An)/A1]×100%,

其中:Am為蒼耳子多糖溶液與反應(yīng)試劑的吸光度;An為蒼耳子多糖溶液與蒸餾水的吸光度;A1為蒸餾水與反應(yīng)試劑的吸光度。

1.4.3 ABTS自由基清除能力

取10 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液與10 mL 2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀水溶液混合后避光反應(yīng)12 h,再使用蒸餾水稀釋,至734 nm處吸光度為0.7,得ABTS工作液。分別配制200 μL的1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL樣品溶液,各加入4 mL ABTS工作液,避光反應(yīng)10 min,在734 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水為空白對(duì)照,以Vc為陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式為:

清除率=[1-(As-At)/A2]×100%,

其中:As為蒼耳子多糖溶液與ABTS工作液的吸光度;At為蒼耳子多糖溶液與蒸餾水的吸光度;A2為蒸餾水與ABTS工作液的吸光度。

1.4.4 細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中,在含有體積分?jǐn)?shù)10%FBS和100 U/mL青霉素的DMEM中培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞,更換細(xì)胞液2 d/次。將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.5 細(xì)胞活力的測(cè)定

將細(xì)胞以每孔90 μL接種于96孔板中,孵育24 h后,將終質(zhì)量濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的樣品溶液添加到每個(gè)孔中(10 μL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。分別加入20 μL的MTT試劑(5 μg/mL)混勻并繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸除孔板中液體后快速加入200 μL DMSO溶液并避光振動(dòng)10 min。在570 nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算增殖指數(shù)。

1.4.6 NO的測(cè)定

細(xì)胞接種方法與1.4.5節(jié)相同。接種后培養(yǎng)24 h,將終質(zhì)量濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的樣品溶液添加到每個(gè)孔中(10 μL),孵育2 h后加入1 μL終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清液。使用Griess試劑進(jìn)行檢測(cè),在540 nm處測(cè)定吸光度。本實(shí)驗(yàn)中，選用未加LPS的DMEM組為空白對(duì)照組，LPS組為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上,采用Origin 8.0軟件作圖并進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。不同組之間的差異通過(guò)單向方差分析(ANOVA)進(jìn)行評(píng)估。統(tǒng)計(jì)結(jié)果中,*P<0.05表示存在差異，**P<0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒼耳子多糖化學(xué)組成分析

4種多糖組分的化學(xué)成分分析結(jié)果見(jiàn)表1所列。從表1可以看出，4種多糖組分WXP、CXP、BXP、AXP的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為54.2%、68.3%、53.9%、45.9%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.7%、7.3%、15.4%、21.5%,糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.3%、12.0%、10.3%、5.3%。順序提取法按提取極性由弱到強(qiáng)的順序提取蒼耳子多糖,因?yàn)樘崛O性的不同,4種提取方法提取多糖的部位也有區(qū)別,所以成分上的差異可能是由不同提取方法導(dǎo)致的。

通過(guò)GC測(cè)定4種蒼耳子多糖的單糖組成,可以看出WXP、CXP、BXP、AXP均為雜多糖,WXP、BXP、AXP由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖組成,CXP由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖組成,其單糖比例均不相同。已有研究表明,單糖組成及其比例與提取方法密切相關(guān)[14]。

通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn),WXP中含有大量的木糖,這可能是由于熱水提取時(shí),高溫使連接于細(xì)胞膜表面的糖蛋白脫離,其所含有的木糖被大量釋放。堿提多糖BXP、AXP中木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著降低,但半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加。半乳糖是細(xì)胞壁的主要組成成分,其半乳糖比例的增加可能是由于堿溶液對(duì)細(xì)胞壁的降解。4種蒼耳子多糖均含有高比例的阿拉伯糖,表明阿拉伯糖是構(gòu)成4種多糖組分主要結(jié)構(gòu)的重要成分。

表1 4種多糖組分的化學(xué)組成及其質(zhì)量分?jǐn)?shù) 單位:%

2.2 FTIR分析

4種多糖的FTIR如圖1所示。

圖1 4種多糖組分的FTIR譜圖

從圖1可以看出,4種多糖組分表現(xiàn)出相似的吸收峰,均有顯著的多糖結(jié)構(gòu)。4種組分在3 410 cm-1和2 925 cm-1處均有強(qiáng)吸收峰,這主要是由于O—H的伸縮振動(dòng)和C—H的伸縮振動(dòng)引起的,這說(shuō)明蒼耳子多糖中均含有大量的羥基[15]。1 650 cm-1附近為C=O的伸縮振動(dòng)峰,推測(cè)多糖中可能含有—CHO。1 420 cm-1處的吸收峰歸因于糖環(huán)上的O—H變形振動(dòng),1 000～1 100 cm-1范圍內(nèi)的存在吸收峰表明存在吡喃糖,860 cm-1附近的信號(hào)對(duì)應(yīng)于β-糖苷鍵。

2.3 生物學(xué)活性

2.3.1 抗氧化活性研究

蒼耳子多糖的抗氧化結(jié)果如圖2所示。

圖2 DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基清除率

從圖2可以看出,在質(zhì)量濃度在1.0～5.0 mg/mL范圍內(nèi),隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,4種組分的抗氧化活性呈劑量依賴性提高,當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大。通過(guò)比較4種組分在DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、ABTS自由基清除率上的表現(xiàn),可以看出在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)AXP均表現(xiàn)出優(yōu)良的抗氧化活性,最高自由基清除率可達(dá)到92.7%、77.5%、99.9%。

WXP和BXP除DPPH自由基清除能力略差于AXP外,在羥基自由基和ABTS自由基的清除能力上與AXP相似。而CXP的清除能力明顯弱于其他3種多糖。

據(jù)報(bào)道,糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖的抗氧化活性有很大影響[16],然而CXP的潛在抗氧化活性顯著低于AXP,已有研究表明抗氧化活性還與半乳糖有關(guān)[17],因此這一現(xiàn)象可能是由于CXP缺少半乳糖導(dǎo)致的。而糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的AXP由于具有高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的半乳糖表現(xiàn)出優(yōu)良的抗氧化活性。結(jié)果表明,半乳糖在抗氧化中起著更為重要的作用。

2.3.2 抗炎活性

4種多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性和NO生成的影響如圖3所示。

圖3 多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性和NO生成的影響

從圖3a可以看出,與空白對(duì)照組相比,4種蒼耳子多糖對(duì)巨噬細(xì)胞均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。在多糖質(zhì)量濃度較低時(shí)(12.5～50.0 μg/mL),CXP與BXP顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖;當(dāng)質(zhì)量濃度較高時(shí)(100.0～400.0 μg/mL),WXP的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于其他多糖。據(jù)此,確定蒼耳子多糖質(zhì)量濃度范圍25.0～400.0 μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

從圖3b可以看出,加入蒼耳子多糖后,NO的產(chǎn)生量明顯減少。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi),4種組分對(duì)NO的抑制能力具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性,當(dāng)質(zhì)量濃度為400.0 μg/mL時(shí),NO的釋放量減少近50%。

已有研究發(fā)現(xiàn)β-糖苷鍵是多糖中的主要活性成分[18],FTIR表明CXP具有β-糖苷鍵,這可能是CXP在缺少半乳糖的情況下依然具有優(yōu)良抗炎活性的原因。結(jié)果表明,蒼耳子多糖能有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,達(dá)到抗炎的效果。

3 結(jié) 論

本文采用順序提取法提取出4種蒼耳子多糖WXP、CXP、BXP、AXP,并研究了提取方法對(duì)其理化性質(zhì)以及生物學(xué)活性的影響。結(jié)果表明,4種多糖組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在明顯差別。受提取方法影響,4種多糖組分的單糖組成比例均不相同。通過(guò)評(píng)估蒼耳子多糖的生物學(xué)活性,發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān),半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的WXP、AXP、BXP展現(xiàn)出較高的抗氧化活性,而缺少半乳糖的CXP的抗氧化活性明顯弱于其他3個(gè)組分。

在抗炎活性的研究中,4種多糖組分對(duì)NO的抑制能力具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到400.0 μg/mL時(shí),NO的釋放量減少近50%。

研究結(jié)果表明,不同提取方法對(duì)蒼耳子多糖的理化性質(zhì)與生物學(xué)活性產(chǎn)生影響,有必要在分子水平上進(jìn)一步研究。