張麗紅，王隨境，陽 霞，廖華東，張新科，陳杰偉

子宮頸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，2020年有60.4萬新增病例和34.2萬死亡病例，嚴重危害女性的生命健康[1]。高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)屬于子宮頸癌前病變。子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasias, CIN)是子宮頸上皮細胞不典型增生或者異常分化形成的增生性病變，但尚未發(fā)生浸潤[2]，分為輕度不典型增生(CIN1)、中度不典型增生(CIN2)和重度不典型增生(CIN3)及原位癌，其中CIN2和CIN3屬于HSIL。HSIL如未經(jīng)治療，30%以上可進展為浸潤癌[3]。病理醫(yī)師僅通過HE染色切片評估HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤較為困難，急需尋找合適的染色方法進行鑒別診斷。為提高HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤診斷的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，本實驗擬通過網(wǎng)狀纖維染色檢測HSIL基膜的表達情況，判斷腫瘤與基膜的關(guān)系，以明確是否存在間質(zhì)浸潤，從而提高判斷HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年4月～2019年6月中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科存檔的87例子宮頸錐切石蠟標(biāo)本，患者年齡32～62歲，平均47歲，其中23例既往被診斷為子宮頸HSIL(CIN3)，64例為子宮頸HSIL(CIN3)可疑間質(zhì)浸潤，調(diào)取病理科存檔的石蠟組織連續(xù)切片備用；本組所有病例的診斷均參考WHO(2014)子宮頸腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 網(wǎng)狀纖維染色采用珠海貝索生物公司提供的網(wǎng)狀纖維染色試劑盒(批號C201201)，操作步驟嚴格按照網(wǎng)狀纖維染色的SOP進行。具體步驟：(1)石蠟組織切片75 ℃烤片15 min，二甲苯、乙醇脫蠟至水；(2)0.5%高錳酸鉀氧化5 min，稍水洗；(3)2%草酸漂白2 min，流水沖洗2 min，再用蒸餾水稍洗；(4)2%硫酸鐵銨媒染5 min，蒸餾水稍洗；(5)新鮮配置的改良Gomori銀氨液反應(yīng)50 s，蒸餾水浸洗2次，每次30 s；(6)10%中性福爾馬林還原1 min，流水沖洗10 min；(7)核固紅復(fù)染細胞核10 min，稍水洗；(8)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法石蠟標(biāo)本由兩位病理科主治醫(yī)師結(jié)合HE染色與網(wǎng)狀纖維染色進行獨立診斷，有爭議的病例由第三位高級職稱病理醫(yī)師作出診斷。診斷結(jié)果根據(jù)一致性及準(zhǔn)確性兩方面進行評價，一致性采用Kappa系數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)狀纖維在HSIL中的分布特點(1)部分病例HE染色鏡下可觀察到黏膜全層見鱗狀上皮增生，異型細胞局限于上皮層內(nèi)，細胞核增大深染，核分裂象可見；部分病例可見上皮巢邊緣光滑，呈柵欄狀排列，上皮間質(zhì)邊界清晰，鄰近的間質(zhì)無纖維組織反應(yīng)性增生(圖1)。經(jīng)網(wǎng)狀纖維染色后，可觀察到瘤周網(wǎng)狀纖維完整、連續(xù)，呈線型，未突破基膜，基膜下的網(wǎng)狀纖維未被破壞(圖2)，呈經(jīng)典的HSIL表現(xiàn)。(2)部分病例HE染色見上皮巢邊緣毛糙，上皮間質(zhì)邊界模糊不清，鄰近的間質(zhì)疑似有纖維組織增生性反應(yīng)，可疑小灶間質(zhì)浸潤(圖3、4)，依據(jù)HE染色明確診斷有一定的困難；經(jīng)網(wǎng)狀纖維染色后，其中有些病例可見瘤周網(wǎng)狀纖維完整、連續(xù)，呈線型，未突破基膜，排除了間質(zhì)浸潤(圖5)；另外一些可疑間質(zhì)浸潤灶的瘤周清晰可見環(huán)繞的網(wǎng)狀纖維被中斷，基膜下的網(wǎng)狀纖維被拉直，基膜處出現(xiàn)厚薄不一、不連續(xù)、斷裂、崩解甚至消失等不規(guī)則現(xiàn)象，呈現(xiàn)出間質(zhì)浸潤的特征(圖6)。

圖1 黏膜上皮巢邊緣光滑，呈柵欄狀排列，上皮間質(zhì)邊界清晰，鄰近的間質(zhì)無纖維組織增生性反應(yīng) 圖2 瘤周網(wǎng)狀纖維完整、連續(xù)，呈線型，未突破基膜，基膜下的網(wǎng)狀纖維未被破壞，網(wǎng)狀纖維染色 圖3 黏膜上皮巢邊緣毛糙，上皮間質(zhì)邊界模糊不清，鄰近的間質(zhì)疑似有纖維組織增生性反應(yīng)，可疑小灶間質(zhì)浸潤 圖4 黏膜上皮巢邊緣毛糙，上皮間質(zhì)邊界模糊不清，鄰近的間質(zhì)疑似有纖維組織增生性反應(yīng)，可疑小灶間質(zhì)浸潤 圖5 瘤周網(wǎng)狀纖維完整、連續(xù)，且呈線型，腫瘤細胞未突破基膜，網(wǎng)狀纖維染色 圖6 瘤周環(huán)繞的網(wǎng)狀纖維被中斷，基膜處出現(xiàn)斷裂、崩解甚至消失等不規(guī)則現(xiàn)象，網(wǎng)狀纖維染色

2.2 網(wǎng)狀纖維染色對判斷子宮頸HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤的準(zhǔn)確性兩位病理主治醫(yī)師根據(jù)子宮頸病變活檢組織的HE染色結(jié)果對87例子宮頸病變診斷進行分類，其中23例HSIL和64例HSIL可疑間質(zhì)浸潤，均與原診斷保持一致；結(jié)合網(wǎng)狀纖維染色再次進行獨立診斷評價，統(tǒng)計結(jié)果顯示：23例HSIL中兩位醫(yī)師均能得以驗證；而64例HSIL可疑間質(zhì)浸潤的病例中確定為HSIL的例數(shù)分別為30例(46.9%)和29例(45.3%)，找到間質(zhì)浸潤證據(jù)的例數(shù)分別為34例(53.1%)和35例(54.7%)，兩位醫(yī)師診斷結(jié)果一致性極高，HE染色結(jié)合網(wǎng)狀纖維染色方法具有極好的可重復(fù)性(Kappa=0.969，P<0.001)。其中僅有1例存在爭議，該病例由高級職稱病理醫(yī)師根據(jù)染色情況診斷存在間質(zhì)浸潤。因此，網(wǎng)狀纖維染色在判斷HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤中具有重要的參考價值，提示HE染色形態(tài)懷疑HSIL可疑間質(zhì)浸潤的病例，借助網(wǎng)狀纖維染色可以明確間質(zhì)浸潤的情況，有助于提高HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤診斷的準(zhǔn)確率，更好地指導(dǎo)臨床治療。

3 討論

HSIL屬于子宮頸癌前病變，主要治療方法為子宮頸錐切術(shù)[4]，HSIL伴有間質(zhì)浸潤主要行廣泛性子宮頸切除術(shù)，子宮頸HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤的診斷對治療有重要意義[5-7]。

目前子宮頸病變的篩查主要為三階梯式，即：HPV和(或)TCT檢查、陰道鏡檢查、陰道鏡指導(dǎo)下子宮頸活檢，其中子宮頸活檢被認為是子宮頸病變診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。病理醫(yī)師通過鏡下觀察活檢組織HE染色切片中細胞的形態(tài)進行診斷，當(dāng)異常增殖的細胞達到上皮的2/3及以上時可診斷為HSIL，而當(dāng)腫瘤細胞突破基膜時則診斷為存在間質(zhì)浸潤。

基膜是上皮細胞的基底面與深部結(jié)締組織之間共同形成的薄膜，可以將細胞與結(jié)締組織隔離，在電鏡下基膜可分為兩部分：基板和網(wǎng)板，其中網(wǎng)板是由結(jié)締組織的成纖維細胞分泌產(chǎn)生，主要由網(wǎng)狀纖維和基質(zhì)共同構(gòu)成[9]。網(wǎng)狀纖維為細胞外間質(zhì)成分，是Ⅲ型膠原纖維與嗜銀蛋白多糖共同結(jié)合的產(chǎn)物[10]。對于基膜的染色，有針對糖蛋白的PAS染色和網(wǎng)狀纖維的銀浸染法，但PAS染色特異性較差，存在糖原、黏液等干擾，而網(wǎng)狀纖維銀浸染法結(jié)果穩(wěn)定、定位準(zhǔn)確，易于判讀。自1905年Maresch應(yīng)用于網(wǎng)狀纖維染色后，現(xiàn)已發(fā)展成為一種穩(wěn)定性、特異性及敏感性均較好的染色方法，連網(wǎng)狀纖維中的細纖維均可顯示[11]，這對于鑒定子宮頸腫瘤細胞是否突破基膜具有重要意義，故本實驗采用網(wǎng)狀纖維染色法顯示基膜。

本實驗對87例既往診斷為HSIL及HSIL可疑間質(zhì)浸潤的病例進行HE和網(wǎng)狀纖維染色，發(fā)現(xiàn)部分病例組織的瘤周網(wǎng)狀纖維完整、連續(xù)，呈線型，未突破基膜，基膜下的網(wǎng)狀纖維未被破壞，可診斷為HSIL；而在另一部分病例，網(wǎng)狀纖維染色見上皮癌巢突破基膜形似小芽狀，進一步浸潤時，發(fā)展成為釘狀、舌狀和淚滴狀，從黏膜上皮或者所累及腺體的基膜分離出，癌細胞突破基膜，往平滑肌浸潤，纖維膠原化之處由于網(wǎng)狀纖維缺乏，基膜下網(wǎng)狀纖維被拉直，癌組織之間清晰可見環(huán)繞的網(wǎng)狀纖維被沖斷，基膜處可出現(xiàn)厚薄不一、不連續(xù)、斷裂、崩解或者消失等不規(guī)則現(xiàn)象，可確定為存在間質(zhì)浸潤。因此，病理醫(yī)師通過鏡下觀察腫瘤細胞的浸潤情況及網(wǎng)狀纖維的完整程度可準(zhǔn)確判斷HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤。

綜上所述，在病理診斷過程中，對于通過HE染色無法明確判斷HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤的病例可以加做網(wǎng)狀纖維染色，明確基膜形態(tài)，有助于準(zhǔn)確識別HSIL是否伴有間質(zhì)浸潤，提高診斷的準(zhǔn)確率，有利于子宮頸病變臨床管理策略的制定。