劉茂希，杜昆利

(1.山西省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，山西 太原 030013；2.第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院消化外科，陜西 西安 710032)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其嚴重危害著人類健康。以手術(shù)為主的綜合治療明顯改善了結(jié)直腸癌的生存率，但是其總體生存率仍有待提高，因此尋找新的結(jié)直腸癌治療方案迫在眉睫。探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，尋找結(jié)直腸癌的治療靶點是目前的研究熱點之一。磷脂酶D2(PLD2)作為PLD家族的重要成員之一，在多種腫瘤中發(fā)揮了重要作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PLD2在結(jié)直腸癌組織中的蛋白和mRNA表達水平升高，并且其與結(jié)直腸癌患者的腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存率等相關(guān)[1]，且其在結(jié)直腸癌中起到抑制凋亡的作用[2]。然而在體內(nèi)實驗中，干擾PLD2基因表達是否對結(jié)直腸癌的生長有影響，目前尚鮮見相關(guān)報道。本實驗擬通過構(gòu)建結(jié)直腸癌裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，構(gòu)建PLD2特異性小干擾RNA(ad-PLD2-siRNA)的表達載體注射裸鼠移植瘤，探討應(yīng)用RNA干擾法下調(diào)結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤中PLD2表達水平對結(jié)直腸癌細胞生長的影響，期望能為結(jié)直腸癌的基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 30只BALB/c雄性裸鼠，SPF級，鼠齡4～5周，體重16～20 g,由山西省腫瘤醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.1.2細胞和腺病毒 SW480和SW620細胞由本課題組前期凍存；ad-PLD2-siRNA腺病毒載體由上海漢恒生物技術(shù)有限公司構(gòu)建和鑒定；本研究干擾PLD2有效的PLD2-siRNA靶序列為：5′-GAT GAG ATT GTG GAC AGA ATC CTG-3′。只帶腺病毒載體而無有效序列的腺病毒作為陰性對照。

1.1.3試劑 胎牛血清和RPMI1640；PLD2抗體(美國Abcam公司)；β-actin、c-Myc和Bcl-2抗體購自武漢三鷹生物科技有限公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量反應(yīng)試劑盒購自大連TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)液及PVDF膜購自中國碧云天生物科技有限公司；裸鼠購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將SW480或SW620置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。收集處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細胞(5×105mL)，接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h貼壁后，棄培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的攜帶PLD2-siRNA的腺病毒載體或空載體[SW480的感染復數(shù)(MOI)=40；SW620的MOI=60]，細胞轉(zhuǎn)染4 h后，更換培養(yǎng)液并培養(yǎng)24 h，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況并進行后續(xù)研究。

1.2.2建立結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型 (1)所有動物均先飼養(yǎng)7 d，離心消化SW480和SW620細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并計數(shù)細胞使得每100微升PBS中至少重懸的細胞個數(shù)為3×106，并裝在EP管中備用。(2)酒精消毒小鼠右側(cè)背部皮膚，用1 mL注射器從EP管中吸凈細胞并注射在裸鼠右側(cè)后背部皮下，棉簽輕壓注射部位10 s，2種結(jié)直腸癌細胞株均注射10只。(3)用游標卡尺測量瘤體的橫徑(L)和縱徑(S)，每3天1次，根據(jù)公式0.5×L×S2計算腫瘤體積。(4)當腫瘤體積達到50～70 mm3時，瘤體內(nèi)多方向注射攜帶人PLD2-siRNA腺病毒或空病毒載體或生理鹽水，從而將2種細胞株均分為PLD2干擾組、空載組和正常組，每組各5只，第1次注射后每3天1次，共8次后處死裸鼠，分離腫瘤，稱重。每個瘤體取一部分保存于液氮以備后續(xù)蛋白和mRNA檢測用；一部分用4%的甲醛固定，以備后續(xù)進行免疫組織化學染色時用。實驗期間仍每3天測量瘤體的L和S。(5)根據(jù)所測的最大L和最大S，計算腫瘤體積并繪制生長曲線。(6)比較2種細胞株2組間的瘤體體積。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法 按照蛋白提取試劑盒的相關(guān)說明提取各組蛋白，測定蛋白濃度。將各組蛋白(50 μg)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，分離蛋白質(zhì)樣本，將蛋白質(zhì)樣本電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，然后孵育二抗2 h，洗膜后用ECL液在Fushison成像系統(tǒng)中進行顯影攝像，之后利用該系統(tǒng)進行表達水平分析。

1.2.4實時熒光定量PCR 按照RNA提取試劑盒的相關(guān)說明提取各組總RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄。PLD2引物的序列，上游為：5′-GTGGGCGATGAGATTGTGGAC-3′；下游為：5′-CAGGATTGAATACCCCCAC GA-3′。β-actin引物序列，上游為：5′-CCACAAATC TCCTCAACTCC-3′；下游為：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。熒光定量PCR采用SYBR?Premix EX TaqTMⅡ，按照試劑盒的相關(guān)說明進行。目的基因mRNA相對于β-actin mRNA的相對表達量按公式2-ΔΔCt進行計算，重復3次的平均值代表目的基因mRNA的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1腺病毒轉(zhuǎn)染效率 腺病毒轉(zhuǎn)染SW480和SW620細胞24 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率達90%，見圖1。

A、C分別為明視野下的SW620和SW480；B、D分別為綠色視野下的SW620和SW480。圖1 腺病毒轉(zhuǎn)染SW620和SW480后熒光顯微鏡圖(200×)

2.22種細胞各組瘤體組織PLD2 mRNA表達水平比較 2種細胞PLD2干擾組的PLD2 mRNA表達水平與正常組和空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2種細胞正常組與空載組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖2 2種細胞各組瘤體組織PLD2 mRNA表達水平比較

2.32種細胞瘤體組織PLD2蛋白表達水平比較 2種細胞PLD2 干擾組PLD2蛋白表達水平與正常組和空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2種細胞正常組PLD2蛋白的表達水平與空載組比較無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖3 2種細胞各組瘤體組織PLD2蛋白表達水平比較

2.42種細胞各組瘤體體積比較 通過繪制瘤體的生長曲線，發(fā)現(xiàn)從第21天開始PLD2干擾組的瘤體體積開始小于空載組和正常組(P<0.05)，然而空載組和正常組間體積無差異(P>0.05)，見圖4A；瘤體體積的比較，發(fā)現(xiàn)PLD2干擾組瘤體體積顯著低于空載組和正常組(P<0.05)，而正常組和對照組間無顯著差異(P>0.05)，見圖4B。這些研究結(jié)果提示干擾PLD2基因表達可以抑制結(jié)腸癌的生長。

A.瘤體生長曲線；B.瘤體體積；C.各組瘤體體積比較條形圖。與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖4 2種細胞各組瘤體體積比較

2.5干擾PLD2基因表達對瘤體組織c-Myc和Bcl-2蛋白表達水平的影響 PLD2干擾組c-Myc的蛋白表達水平與正常組和空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Bcl-2的表達水平明顯升高(P<0.05)；而正常組和空載組比較兩者的表達水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖5 2種細胞各組瘤體組織c-Myc和Bcl-2蛋白 表達水平比較

3 討 論

結(jié)直腸癌作為常見的消化道實體腫瘤之一，缺氧是其發(fā)生發(fā)展過程中的固有特點[3]。腫瘤細胞通過一系列機制調(diào)節(jié)自己以適應(yīng)缺氧的微環(huán)境并得以生存。WU等[4]通過干擾缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)基因后進行蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)PLD2表達水平下降明顯，提示PLD2可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

PLD2作為磷脂酶家族重要成員之一，其催化磷脂酰膽堿為磷脂和膽堿，后兩者可參與一系列信號的轉(zhuǎn)導從而參與多種生理和病理過程。過去的研究證實PLD在多種腫瘤中發(fā)揮作用，但是對于其在腫瘤中的具體作用目前依然尚未完全闡明。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)PLD2在結(jié)直腸癌組織和細胞中表達水平升高，且PLD2與結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期等呈正相關(guān)[1]。因此，推測PLD2可能促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。目前尚鮮見應(yīng)用體內(nèi)實驗來探討PLD2對結(jié)直腸癌生長影響的相關(guān)報道。為了探討這一科學問題，本課題組選擇裸鼠作為本實驗研究對象。由于裸鼠無胸腺和T細胞功能完全缺失導致對移植物不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，目前用于人類腫瘤異種移植已被學者們所接受[5]，此外RYGARRD已經(jīng)于1969年成功建立了該移植瘤模型[6]。本研究通過建立結(jié)直腸癌裸鼠腺病毒移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)干擾降低PLD2基因的表達可以抑制結(jié)直腸癌細胞的生長。在注射腺病毒后的即第21天開始，PLD2干擾組的瘤體即顯著小于對照組，表明PLD2可能促進了結(jié)直腸癌細胞的生長。YAO等[7]報道PLD可以通過c-Src相互作用協(xié)同促進細胞的增殖；過表達PLD2的成纖維細胞生長特性和形態(tài)學變化發(fā)生改變后，表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)化的特點，即處于S期細胞比例增加和細胞周期素D3的表達上調(diào)[8]，顯示PLD2促進腫瘤細胞增殖。此外，PLD2可以激活mTOR通路調(diào)控多種蛋白的合成促進癌細胞生長[9-11]。有研究也報道核因子-κB可以介導PLD促進乳腺癌細胞的生長[12-13]。這些結(jié)果說明PLD2處于多條信號通路交匯點，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。同時本研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導PLD2表達水平和活性升高，并且HIF-1α可以調(diào)控PLD2的表達[1]；有報道指出慢性風濕性關(guān)節(jié)炎中PLD2可以調(diào)控HIF-1α的表達[14-15]。因此，推測這兩者之間也可能存在Cross-talk的現(xiàn)象，從而促進結(jié)腸癌細胞的生長。不管怎樣，這些結(jié)果說明高表達的PLD2促進結(jié)腸癌的發(fā)生。目前關(guān)于PLD2調(diào)控結(jié)腸癌生長的靶基因尚未明確。已有文獻報道c-Myc和Bcl-2在結(jié)直腸癌的生長過程中發(fā)揮了重要作用。那么PLD2是否可以通過對c-Myc和Bcl-2的影響來調(diào)控結(jié)直腸癌的生長呢，現(xiàn)有的相關(guān)資料尚不能證實這一科學問題。為了說明這個問題，本研究通過腺病毒干擾降低PLD2基因表達，檢測c-Myc和Bcl-2表達水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PLD2表達水平的降低，c-Myc蛋白表達水平也下降，而Bcl-2的表達水平升高，提示PLD2可能通過調(diào)控c-Myc和Bcl-2表達來調(diào)控結(jié)直腸癌的生長。

綜上所述，在結(jié)直腸癌中高表達的PLD2可能通過調(diào)控c-Myc和Bcl-2表達來參與結(jié)直腸癌細胞的發(fā)生，本研究顯示PLD2可能成為結(jié)直腸癌靶向治療的新靶點。但是PLD2作用的具體分子機制和信號通路還有待進一步深入研究。