肝部分切除術(shù)后血清IL-24上調(diào)與肝再生相關(guān)性研究*

劉 晗，周 虹，李玥璐，狄濱茹，李薪宇，林 慶

(西南醫(yī)科大學(xué)：1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；3.麻醉學(xué)系，四川 瀘州 646000)

肝再生是動(dòng)物體內(nèi)最神秘、最迷人的現(xiàn)象之一。肝切除(70%)或肝損傷后[1]，其特點(diǎn)是恢復(fù)迅速。研究發(fā)現(xiàn)，肝部分切除術(shù)(PHx)后，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)在24 h內(nèi)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。在過(guò)表達(dá)IL-6的小鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞增殖增強(qiáng)，但I(xiàn)L-6基因敲除小鼠在PHx后肝再生被延遲。這表明IL-6是肝臟再生所必需的，但并不啟動(dòng)肝再生[2]。

近年來(lái)，有報(bào)道稱IL-10、IL-22等細(xì)胞因子在肝臟再生的初始階段發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟局部產(chǎn)生IL-22可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，但肝臟更容易發(fā)生腫瘤。IL-22對(duì)肝臟的炎癥無(wú)明顯作用。這些發(fā)現(xiàn)可能為臨床實(shí)踐中預(yù)測(cè)肝臟相關(guān)手術(shù)的預(yù)后提供線索[3]。

IL-24是IL-10家族細(xì)胞因子的新成員。IL-24在正常人黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞。黑色素瘤分化相關(guān)基因-7/IL-24(mda-7/IL-24)是一種在體外或體內(nèi)臨床前動(dòng)物模型中顯示廣譜抗癌活性的多功能細(xì)胞因子[4]。在生理?xiàng)l件下，IL-24主要由活化的單核細(xì)胞和T2輔助細(xì)胞分泌，而IL-24的主要靶向組織根據(jù)受體的表達(dá)模式，在起源上是非造血組織，包括皮膚、肺和生殖組織[5-6]。IL-24在肝損傷的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，可能用于肝損傷的治療。IL-24對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用主要依賴于IL-20R1[7]。IL-22受體的α1亞基(IL-22RA1)只允許IL-20和IL-24信號(hào)傳導(dǎo)。IL-20RA和IL-22RA1在某些組織中的表達(dá)受到限制，但I(xiàn)L-22RA1在皮膚、胰腺、肝臟、腎臟和腸道中高表達(dá)[5-6]。此外，IL-24作為IL-22R的配體，可促進(jìn)糖尿病db/db小鼠的創(chuàng)面愈合[8]。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠(8周，15～20 g)購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心(中國(guó)南京)。動(dòng)物的使用得到了西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物關(guān)愛(ài)倫理委員會(huì)(中國(guó)四川)的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共納入105只，隨機(jī)分為3組，分別為PHx組、對(duì)照組、假手術(shù)組，每組35只。對(duì)于70% PHx動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，然后結(jié)扎并切除中、左肝葉，如前所述[9]。假手術(shù)時(shí)，打開(kāi)腹腔，輕輕按摩肝臟，不切除。在手術(shù)后的不同時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)選取5只小鼠被實(shí)施安樂(lè)死，肝臟被取出并在10%磷酸鹽緩沖液(PBS)或福爾馬林中固定。2/3 PHx最常用于嚙齒動(dòng)物和大型動(dòng)物，因?yàn)槠涫侵饕脑偕碳?，引起殘余肝臟的同步和均勻反應(yīng)。為了測(cè)試IL-24在再生肝中的功能相關(guān)性，對(duì)小鼠進(jìn)行了2/3 PHx。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)印跡法 將小鼠組織在Triton裂解緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 7.4，137 mmol/L 氯化鈉溶液，10%甘油，1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 mmol/L 氟化鈉溶液，5 mg/mL抑肽酶，20 mmol/L 亮肽酶和1 mmol/L 原釩酸鈉)中裂解，并在4 ℃，以12 000 r/min離心15 min。使用BCA測(cè)定法測(cè)量上清液的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品用4×十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液[200 mmol/L Tris，pH 6.8，8% SDS，400 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，0.4%溴酚藍(lán)，40%甘油]在100 ℃下變性5 min，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和如前所述蛋白質(zhì)印跡分析[10]。

1.2.2定量即時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(q-PCR) 進(jìn)行半定量即時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(sq-PCR)和q-PCR。在指定時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本，應(yīng)用q-PCR檢測(cè)IL-24 mRNA水平，采用q-PCR檢測(cè)IL-20R2 mRNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用TRIzol試劑(Invitrogen，Thermo Fischer，USA)分離總RNA。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。sq-PCR通過(guò)在1%或4%(對(duì)于XBP1)瓊脂糖凝膠上運(yùn)行產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行。如前所述，qPCR分析使用SYBR預(yù)混料Ex Taq(日本Takara)進(jìn)行[10]。用18S對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)一化，并使用2-ΔΔCq方法進(jìn)行定量[11]。引物如下：mouse IL-24,forward:5′-TCTGCGTGTAAGTTCCGAGT-3′,and reverse:5′-GAGAACCACCCCTGTCACTT-3′;mouse IL-20R2,forward:5′-GTCTGGACAA GTCCGTTCATG-3′,and reverse:5′-GCTTCATGTTG GTTGACTGTAC-3′;mouse 18S,forward:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′,and reverse:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′。

1.2.3組織學(xué)分析 將小鼠的肝組織在室溫下固定在4%福爾馬林中至少24 h，嵌入石蠟中，并切成5 μm切片。將肝臟切片去蠟化并用蘇木精和伊紅(HE)染色以進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。通過(guò)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA;CST 2586S)免疫染色，如前所述[12]。

2 結(jié) 果

2.1mIL-24-Fc融合蛋白誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖 根據(jù)IL-22RA1在上皮細(xì)胞和肝臟中均有高表達(dá)，將mIL-24-Fc或PBS注射到小鼠皮內(nèi)。HE染色顯示2組小鼠表皮組織厚度不均勻。2組小鼠均有單層或多層角質(zhì)形成細(xì)胞，1層或2層是最薄的。mIL-24-Fc組和PBS對(duì)照組表皮最厚部位如圖1所示。PBS對(duì)照組在表皮組織最厚的部分有3～4層角質(zhì)形成細(xì)胞，而mIL-24-Fc組在表皮組織最厚的部分有5～6層角質(zhì)形成細(xì)胞，增厚的表皮覆蓋范圍更廣。

圖1 注射PBS和mIL-24-Fc小鼠皮下石蠟切片(HE染色)

2.2PCNA 通過(guò)PCNA染色評(píng)估肝再生，PHx后12、48 h肝臟再生顯著增強(qiáng)(圖2A)。但在3、12、48 h，假手術(shù)組的肝再生情況相比PHx組并不明顯。因此，PHx小鼠肝質(zhì)量的恢復(fù)機(jī)制可能與肝細(xì)胞增殖有關(guān)。

2.33組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酸(ALT)水平比較 PHx組、假手術(shù)組和對(duì)照組分別于3、12、48 h測(cè)定血清AST和ALT水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，3組的AST和ALT水平均遠(yuǎn)高于對(duì)照組。ALT和AST在12 h達(dá)到峰值,而ALT和AST水平在48 h低于3 h和12 h。然而,假手術(shù)組在3、12、48 h的ALT和AST水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2B、C。

A.對(duì)照組(上)、假手術(shù)組(中)和PHx組(下)分別在3 h(左)、12 h(中)和48 h(右)進(jìn)行PCNA染色。B、C分別為對(duì)照組、假手術(shù)組和PHx組的ALT和AST水平(n=5)。與對(duì)照組比較，aP<0.05。圖2 肝部分切除術(shù)小鼠模型的建立

2.4肝細(xì)胞IL-24 mRNA PHx組和假手術(shù)組在3 h時(shí)IL-24 mRNA水平均略有下降，假手術(shù)組和對(duì)照組在12 h時(shí)的IL-24 mRNA表達(dá)水平相同。然而，PHx組在12 h時(shí)IL-24 mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組和假手術(shù)組。PHx組在48 h時(shí)IL-24 mRNA水平顯著升高(圖3A)。經(jīng)PCNA檢測(cè)，48 h時(shí)肝細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)。因此，推測(cè)IL-24通過(guò)IL-20R2受體的未知信號(hào)通路或非受體方式的信號(hào)通路刺激肝細(xì)胞增殖。

A、B.q-PCR檢測(cè)對(duì)照組、假手術(shù)組和PHx組在3、12、48 h肝臟中IL-24和IL-20R2 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況(n=5)。與3、12 h比較，aP<0.05；與假手術(shù)組比較，bP<0.05。圖3 IL-24與小鼠肝切除后肝細(xì)胞增殖相關(guān)

2.5IL-20R2 mRNA PHx后IL-20R2 mRNA水平持續(xù)升高，在PHx小鼠3、12、48 h誘導(dǎo)IL-20R2基因轉(zhuǎn)錄。然而，假手術(shù)組IL-20R2基因在3、12、48 h的轉(zhuǎn)錄水平低于PHx組(圖3B)。

2.6血清 IL-24 蛋白 在指定時(shí)間內(nèi)用ELISA檢測(cè)IL-24水平(圖4A)。PHx組和假手術(shù)組的血清IL-24水平均顯著升高，在12 h達(dá)到峰值，然后開(kāi)始下降。這與IL-24 mRNA的變化不一致。結(jié)果表明，血清IL-24水平的不同是剖腹手術(shù)引起的應(yīng)激反應(yīng)結(jié)果。

A.血清IL-24蛋白ELISA分析；B.假手術(shù)組和PHx組在0、3、6、12、24 h肝臟p-STAT3和GAPDH的蛋白質(zhì)印跡法分析(n=5)。與0 h比較，aP<0.05。圖4 部分肝切除后IL-24通路誘導(dǎo)肝臟應(yīng)激反應(yīng)

2.7p-STAT3和GAPDH 在細(xì)胞表面與受體結(jié)合后，IL-24激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括JAK-STAT通路。分別在0、3、6、12、24 h通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)PHx組肝臟中的p-STAT3和GAPDH。結(jié)果表明，p-STAT3在前3小時(shí)內(nèi)保持激活狀態(tài)，p-STAT3升高在PHx后24 h(圖4B)，這與血清IL-24水平一致。IL-24通過(guò)JAK-1與細(xì)胞表面受體信號(hào)結(jié)合，導(dǎo)致p-STAT3轉(zhuǎn)錄因子的激活。信號(hào)通路激活(JAK-1/STAT3)是由剖腹手術(shù)引起的應(yīng)激反應(yīng)。

3 討 論

越來(lái)越多的研究集中在IL-24在人類疾病中的生理功能，因此IL-24被描述為IL-20家族細(xì)胞因子的成員，其中大部分集中在抗腫瘤特性上。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)IL-24是細(xì)胞增殖的新的關(guān)鍵介質(zhì)[6，13]。

本研究表明，將mIL-24-Fc融合蛋白注射到小鼠皮膚中誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。由于IL-22RA1在肝臟和上皮細(xì)胞中均高度表達(dá)，IL-24誘導(dǎo)小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，所以假設(shè)IL-24可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖。因此，在本研究中，確定了IL-24在肝臟再生中的作用。

IL-24通過(guò)2種異二聚體受體IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2起作用。在與受體結(jié)合后，IL-24誘導(dǎo)p-STAT3轉(zhuǎn)錄因子的快速激活，其參與細(xì)胞存活和增殖[6，13]。本研究結(jié)果顯示，剖腹術(shù)后，PHx組血清IL-24水平持續(xù)升高，12 h達(dá)到峰值，然后開(kāi)始下降。然而，肝細(xì)胞的IL-24 mRNA水平在12 h時(shí)顯著升高，在48 h達(dá)到峰值，然后開(kāi)始下降。血清和肝臟中IL-24的不同水平差異顯著，因此檢測(cè)到p-STAT3，其是IL-24的下游細(xì)胞因子。PHx后p-STAT3不斷升高，在12 h達(dá)到峰值，然后開(kāi)始降低。p-STAT3的不同趨勢(shì)與血清IL-24水平一致。值得注意的是，假手術(shù)組和PHx組血清IL-24和p-STAT3的變化趨勢(shì)是相同的。這些發(fā)現(xiàn)表明，血清IL-24和p-STAT3水平的不同是PHx后應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。出乎意料的是，IL-24 mRNA的變化趨勢(shì)與血清IL-24的變化趨勢(shì)存在顯著差異。這表明IL-24通過(guò)未知的細(xì)胞表面受體信號(hào)通路或非受體的方式促進(jìn)肝臟再生。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清中IL-24的上調(diào)是PHx后應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。作者假設(shè)IL-24通過(guò)未知的細(xì)胞表面受體信號(hào)通路或非受體的方式刺激PHx后肝細(xì)胞增殖。然而，IL-24在肝臟再生中的作用尚不完全清楚。因此，IL-24在肝臟再生中的作用仍有待進(jìn)一步研究。