鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響

謝文輝，黃莉娟，趙麗麗，王雷挺，趙文武

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，貴州貴陽 550025）

鈣（Ca）是植物生長發(fā)育期的必需營養(yǎng)元素，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的必需物質(zhì)，在維護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能、減少或延緩膜損傷等方面具有重要作用。在植物種子萌發(fā)期，Ca2+通過改變相關(guān)作用酶活性，調(diào)控種子出苗速度與發(fā)芽率。研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的Ca2+在幼苗生長期可以緩解干旱［1］、鹽害［2］、冷害［3］和細(xì)菌［4］等對植物的影響，促進(jìn)植物幼苗的健康生長。植物體內(nèi)Ca2+濃度過高或過低均會影響植物的正常生長代謝，植物體內(nèi)Ca2+濃度過低影響植物細(xì)胞壁形成，抑制細(xì)胞分裂，破壞原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植物枯死［5］；Ca2+濃度過高導(dǎo)致大量Ca2+與PO43-在植物體內(nèi)形成沉淀，影響Ca2+信號的正常傳導(dǎo)，損傷植物葉綠體膜結(jié)構(gòu)，光合作用無法正常進(jìn)行，從而影響植物的正常生長代謝［6-7］。

“中國南方喀斯特”在地質(zhì)地貌、生物生態(tài)、民族文化等方面的世界價值長期以來得到國內(nèi)外的廣泛重視和認(rèn)同，該區(qū)域面積達(dá)1762.28 km2，貴州省碳酸鹽巖山地面積約12.9 km2，占全省總面積的73.6%［8-9］?？扇苄詭r石（碳酸鹽巖、石膏、巖鹽等）長期受水的化學(xué)溶蝕作用，導(dǎo)致該生態(tài)系統(tǒng)中土壤Ca2+含量高于非巖溶地區(qū)［10］。該地區(qū)土壤鈣含量高達(dá)1%~3%，是同緯度硅酸鹽地區(qū)的2~3 倍［11］，因此，土壤Ca2+含量成為限制該地區(qū)植物生長的因素之一［12］。

葛藤（Pueraria lobata）作為一種豆科多年生優(yōu)良飼草，其嫩莖和葉片適口性好，莖葉除富含粗蛋白外，含有豐富的Mg、Ca 元素及微量元素Cu、Zn、Fe 等，是牛、羊、豬喜食的牧草之一。目前對葛藤的研究主要集中在其根部含有的異黃酮［13］、葛根素［14］等次生代謝產(chǎn)物的合成途徑、提取工藝及藥用效果上，有關(guān)葛藤作為水土保持及飼草的研究較少，以飼草及水土保持為利用目的的葛藤品種選育的相關(guān)研究較少。李安定等［15］通過研究喀斯特地區(qū)群落組成類型，發(fā)現(xiàn)葛藤在喀斯特石漠化生境中生態(tài)位寬度較大，適應(yīng)能力與抗逆性較強。因此，葛藤具有成為巖溶區(qū)優(yōu)良草種的巨大潛力。研究鈣鹽脅迫對葛藤幼苗生長、生理的影響，對栽培和選育適宜西南巖溶區(qū)耐高鈣鹽草種，開展石漠化生態(tài)恢復(fù)，緩解牧草資源緊張等方面具有重要意義。

種子萌發(fā)及幼苗生長是植物生長發(fā)育的重要且敏感時期，是影響葛藤大規(guī)模種植的關(guān)鍵期。因此，本研究通過不同濃度梯度的CaCl2溶液模擬鈣鹽環(huán)境，研究外源鈣脅迫對3 份葛藤種質(zhì)種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，初步揭示葛藤適應(yīng)鈣鹽的萌發(fā)及生理機制，為葛藤耐鈣鹽品種的選育及其在西南巖溶區(qū)的成功建植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葛藤3 份種質(zhì)材料來源信息詳見表1。經(jīng)貴州大學(xué)趙麗麗教授鑒定，均為蝶形花科葛屬植物葛藤種子。

表1 3 份葛藤種質(zhì)的資源信息Table 1 Resource information of the three P.lobata germplasms

1.2 試驗方法

1.2.1萌發(fā)試驗 試驗于2020 年9 月至2021 年1 月在貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系實驗溫室進(jìn)行。結(jié)合我國西南喀斯特區(qū)土壤含Ca 量［11］，設(shè)置50、100、150、200 mmol·L-1這4 個CaCl2濃度梯度，蒸餾水處理組為對照（CK）。選取籽粒飽滿、大小一致、無霉變及病蟲害的種子，10% NaClO 溶液消毒15 min，去離子水沖洗3~5 遍后，整齊擺放于鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿，每皿擺放30 粒種子。在擺好種子的培養(yǎng)皿中分別加入10 mL 不同濃度的CaCl2溶液，每個處理均設(shè)3 次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)。為保持恒定溶液濃度，每天采用稱重法補充蒸發(fā)失去的水分，并定時記載萌發(fā)種子數(shù)，以胚根長度大于種子的50%視為種子萌發(fā)。7 d 萌發(fā)試驗結(jié)束后每個處理隨機挑取5 粒發(fā)芽種子測量胚根長，計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。其中：

式中：Gt 表示第t 天的種子發(fā)芽數(shù)；Dt 為種子發(fā)芽天數(shù)；Sx 表示種子平均胚根長。

1.2.2苗期試驗 預(yù)先通過種子萌發(fā)培育出3 份葛藤種質(zhì)幼苗，以改良霍格蘭營養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，從每份種質(zhì)幼苗中選取生長一致、健康的幼苗進(jìn)行水培。當(dāng)幼苗生長至二葉一心，營養(yǎng)液中分別加入0（CK）、50、100、150、200 mmol·L-1的CaCl2溶液開始脅迫，每個處理取30 株，重復(fù)3 次。脅迫最后1 d 測定株高、葉長、葉寬、生物量（地下部干重和地上部干重）。每個重復(fù)隨機選取5 株葛藤，采用直尺法測量絕對株高。隨機取葛藤從上至下第3片完全展開功能葉測量葉形態(tài)（葉長、葉寬），每個重復(fù)測定5 片葉。從根莖處將植株剪斷分為地上部和地下部，105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重后稱地下和地上部干重。

1.2.3生理指標(biāo)測定 脅迫試驗結(jié)束，每個處理取新鮮葉片測定生理指標(biāo)。采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［16］，紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，磺基水楊酸法測定脯氨酸（proline，Pro）含量［16］，采用Yoshiyuki 法［17］測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［18］，蒽酮比色法測定可溶性糖含量。電導(dǎo)率用Bante-901 測定，稱取綠色幼嫩葉片0.5 g，將各處理葉片剪成小段分別放入不同試管，每個試管加10 mL 超純水，室溫下測定其電導(dǎo)率EC1，將材料煮沸10 min，冷卻至室溫后測定其電導(dǎo)率EC2，相對電導(dǎo)率（%）＝（EC1-EC0）/（EC2-EC0）×100，EC0為超純水電導(dǎo)率。采用植物激素酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定葉片中脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長素（auxin，IAA）、赤霉素（gibberellin A3，GA3）及玉米素（Zeatin，ZT）含量［19］。每個樣品均重復(fù)測定3 次。

1.2.4模糊隸屬函數(shù)綜合評價法 采用模糊隸屬函數(shù)法計算3 份葛藤種質(zhì)種子萌發(fā)及幼苗生長階段的耐鹽隸屬函數(shù)值，據(jù)此對3 份葛藤種質(zhì)的耐鹽性進(jìn)行綜合評價［20］。計算公式如下：

式中：μ（Xj）代表第j個指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xj代表第j個指標(biāo)值；Xmin代表第j個指標(biāo)的最小值；Xmax代表第j個指標(biāo)的最大值；耐鹽性與指標(biāo)呈正相關(guān)時采用公式（1）計算，呈負(fù)相關(guān)時則采用公式（2）進(jìn)行計算。

1.2.5單項指標(biāo)主成分分析 為篩選葛藤耐鹽性的主要對比指標(biāo)，對3 份葛藤種質(zhì)各單項指標(biāo)的耐鹽系數(shù)ω分別進(jìn)行主成分分析［21］，計算耐鹽系數(shù)（ω）公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 21 軟件作數(shù)據(jù)處理與分析，SigmaPlot 12 軟件作圖，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)種子萌發(fā)的影響

從圖1 可知，隨CaCl2脅迫濃度升高，AUS 和JS 種質(zhì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈逐漸降低趨勢。HN 種質(zhì)種子在CaCl2濃度為50~150 mmol·L-1時發(fā)芽率、發(fā)芽勢與CK 相比差異均不顯著，當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到200 mmol·L-1時，其4 個發(fā)芽指標(biāo)相比CK 均顯著降低。HN 種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在CK 時顯著低于其他2 份葛藤種質(zhì)種子，當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到200 mmol·L-1，AUS 葛藤發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于其他2 份種質(zhì)。當(dāng)CaCl2濃度為50 和100 mmol·L-1時，HN 葛藤種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢（除100 mmol·L-1）、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于其他2 份葛藤種質(zhì)種子。

圖1 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of calcium salt stress on seed germination indexes of three P. lobata germplasms

HN 種質(zhì)種子活力指數(shù)在CK 下顯著低于AUS 種質(zhì)。AUS、JS 及HN 種質(zhì)種子活力指數(shù)在CaCl2濃度分別為50、100 和150 mmol·L-1時，與CK 相比開始產(chǎn)生顯著差異。AUS、HN 和JS 種質(zhì)種子活力指數(shù)在CaCl2濃度為200 mmol·L-1時均達(dá)到最低，與CK 相比分別降低72.53%、87.84%和92.61%。

2.2 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)幼苗生長的影響

由表2 可知，3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉長、葉寬和株高均隨CaCl2脅迫濃度的提高呈降低趨勢。50 mmol·L-1CaCl2脅迫下，HN 種質(zhì)幼苗株高與CK 相比顯著降低，100 mmol·L-1CaCl2脅迫下，AUS 種質(zhì)幼苗葉長、株高和JS 種質(zhì)幼苗葉長與CK 相比顯著降低，150 mmol·L-1CaCl2脅迫下，AUS 和HN 種質(zhì)葉寬均顯著低于CK，JS 種質(zhì)幼苗株高在此脅迫濃度開始顯著低于CK。200 mmol·L-1CaCl2脅迫下HN 種質(zhì)幼苗葉長與JS 種質(zhì)幼苗葉寬顯著低于CK。AUS 種質(zhì)幼苗葉長和株高降低幅度最大，相比CK 降低39.77%和47.44%，JS 種質(zhì)幼苗葉寬降低幅度最大，為30.77%。

表2 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)幼苗生長指標(biāo)的影響Table 2 Effects of calcium salt stress on seedling growth indexes of three P.lobata germplasms

由表2 可知，隨脅迫濃度升高，3 份葛藤種質(zhì)幼苗地上部與地下部干重均表現(xiàn)為降低趨勢。與CK 相比，AUS種質(zhì)幼苗地上部干重降低幅度最大，降低46.00%，HN 種質(zhì)幼苗地下部干重降低幅度最大，降低66.67%。50 mmol·L-1CaCl2脅迫下，AUS、HN 和JS 種質(zhì)幼苗地上部干重相比CK 降低6.00%、12.50%和4.76%。3 份葛藤種質(zhì)的地上、地下部干重在50 mmol·L-1CaCl2濃度下均與CK 無顯著差異。

2.3 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)相對電導(dǎo)率、丙二醛和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖2 可知，伴隨鈣鹽脅迫濃度升高，3 份葛藤種質(zhì)相對電導(dǎo)率和MDA 含量的變化趨勢基本相同，均隨著脅迫程度的增強整體呈升高趨勢。整個處理過程中，AUS 種質(zhì)相對電導(dǎo)率（除CK 和50 mmol·L-1）和MDA 含量始終高于JS 和HN 種質(zhì)。AUS 種質(zhì)相對電導(dǎo)率變化幅度最大，JS 種質(zhì)變化幅度最小，AUS、HN、JS 種質(zhì)最大相對電導(dǎo)率與CK 相比分別顯著升高85.14%、67.10%和77.35%。3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉片Pro 含量隨脅迫濃度的增加，表現(xiàn)為先增后減的趨勢。AUS 種質(zhì)在脅迫濃度為100 mmol·L-1，JS 和HN 種質(zhì)均在脅迫濃度為150 mmol·L-1時，葉片Pro 含量達(dá)到最大值且顯著高于CK。3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉片可溶性糖含量整體呈先升后降的相似趨勢，但3 份種質(zhì)葉片可溶性糖含量達(dá)到最高時的CaCl2脅迫濃度不同，JS 為50 mmol·L-1、AUS 和HN 均為100 mmol·L-1。與CK 相 比，JS 的 可溶 性 糖含 量 變化 幅 度 最 大，為CK 的2.21 倍。CaCl2脅迫 濃 度為200 mmol·L-1時，AUS 種質(zhì)可溶性糖含量最低，而JS 種質(zhì)最高。

圖2 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)相對電導(dǎo)率、丙二醛和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig. 2 Effects of calcium salt stress on relative conductivity，malondialdehyde and osmotic adjustment substance contents of three P. lobata germplasms

2.4 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)抗氧化酶活性的影響

由圖3 可知，隨鈣鹽脅迫濃度升高，AUS 和HN 種質(zhì)葉片POD 活性表現(xiàn)為先升后降的趨勢，JS 種質(zhì)表現(xiàn)為不斷上升趨勢。其中AUS 種質(zhì)的變化幅度最大，其葉片POD 活性在CaCl2濃度為150 mmol·L-1時，相比CK 顯著增高82.83%，CaCl2脅迫濃度為200 mmol·L-1時，AUS 種質(zhì)的POD 活性顯著下降，JS 和HN 種質(zhì)則無顯著變化。3 份葛藤種質(zhì)葉片CAT 活性整體變化趨勢為先升后降。3 份葛藤種質(zhì)葉片CAT 活性均在CaCl2濃度為50 mmol·L-1時達(dá)到最高。3 份葛藤種質(zhì)葉片SOD 活性隨CaCl2脅迫濃度升高，均呈先升后降的趨勢，但3 份葛藤種質(zhì)SOD活性升至最大值時的脅迫濃度不同，HN 和JS 種質(zhì)在150 mmol·L-1時達(dá)到最大值，而AUS 種質(zhì)在50 mmol·L-1即達(dá)到最大值。在整個脅迫處理期間，AUS 種質(zhì)的SOD 活性均低于HN 和JS 種質(zhì)（除50 mmol·L-1）。3 份葛藤種質(zhì)葉片APX 活性的變化趨勢和幅度不同，AUS 種質(zhì)葉片APX 活性表現(xiàn)為先增后減趨勢，而HN 和JS 種質(zhì)隨CaCl2脅迫濃度的升高表現(xiàn)為持續(xù)上升趨勢，并在200 mmol·L-1時達(dá)到最大值。AUS 種質(zhì)在50 mmol·L-1時其APX 活性達(dá)到最大值且顯著高于HN 和JS 種質(zhì)，分別高58.09%和73.74%。

圖3 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)葉片過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶活性的影響Fig. 3 Effect of calcium salt stress on the activities of peroxidase（POD），catalase（CAT），superoxide dismutase（SOD）and ascorbate peroxidase（APX）in leaves of three kinds of P. lobata germplasms

2.5 鈣鹽脅迫對3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉片內(nèi)源激素含量的影響

由表3 可知，不同濃度的鈣鹽脅迫下3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉片中的ABA、IAA 和GA3含量均表現(xiàn)為先增后減的趨勢。AUS 種質(zhì)葉片ABA 含量變化幅度最大，在CaCl2濃度為50 mmol·L-1時就達(dá)到最大值（103.67 ng·g-1），并顯著高于CK 和JS 及HN 種質(zhì)，JS 種質(zhì)ABA 含量變化幅度最小，在100 mmol·L-1時達(dá)到最大值，為CK 的1.36倍。在高鈣鹽脅迫濃度（150~200 mmol·L-1）下，3 份葛藤種質(zhì)葉片IAA 含量均小于CK。AUS 和JS 種質(zhì)葉片GA3含量均在CaCl2濃度為100 mmol·L-1時達(dá)到最大值并顯著高于CK，分別為CK 的1.28 和1.36 倍。HN 種質(zhì)

表3 鈣鹽脅迫下3 份葛藤種質(zhì)葉片內(nèi)源激素含量的變化Table 3 Changes of endogenous hormone contents in leaves of three P.lobata germplasms under calcium salt stress（ng·g-1）

葉片GA3含量在150 mmol·L-1時為最大值（8.64 ng·g-1）。3 份葛藤種質(zhì)葉片ZT 含量變化趨勢和變化幅度差異較大，AUS 和HN 種質(zhì)葉片ZT 含量表現(xiàn)為先增后減趨勢，兩份種質(zhì)在脅迫濃度達(dá)到100 mmol·L-1時均達(dá)到最大值，分別為19.61 和19.48 ng·g-1。JS 種質(zhì)葉片ZT 含量表現(xiàn)為隨脅迫濃度增加呈下降趨勢，200 mmol·L-1時，其ZT 含量達(dá)到最小值（16.15 ng·g-1）。

2.6 耐鹽性綜合評價

2.6.1不同鈣鹽脅迫下3 種葛藤的耐鹽性指標(biāo)主成分分析 由表4 和表5 可以看出，AUS 葛藤耐鹽性指標(biāo)主成分分析的第Ⅰ主成分特征值λ1=15.008，貢獻(xiàn)率為71.468%，指標(biāo)對應(yīng)的特征向量中，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、葉長、地上部干重和地下部干重性狀 數(shù) 值 較 大，分 別 為0.251、0.257、0.257、0.257、0.256 和0.255，主要反映出鹽脅迫下，AUS 種質(zhì)種子活力及幼苗生長形態(tài)狀況；第Ⅱ主成分的特征值和貢獻(xiàn)率分別為4.137 和19.699%。對應(yīng)的特征向量中CAT、ABA、IAA、GA3、ZT 性狀數(shù) 值較大，分別為0.282、0.463、0.360、0.382 和0.443，主要反映出鹽脅迫下AUS 種質(zhì)幼苗的抗氧化酶和內(nèi)源植物激素的狀況。HN 葛藤耐鹽性指標(biāo)主成分分析的第Ⅰ主成分特征值λ1=12.585，貢獻(xiàn)率為59.931%，耐鹽性指標(biāo)所對應(yīng)的特征向量中，活力指數(shù)、葉寬、株高和地上、地下部干重數(shù)值較大，分別為0.281、0.258、0.277、0.271、0.259，集中反映HN 種質(zhì)種子活力和幼苗生物量狀況。第Ⅱ主成分的特征值和貢獻(xiàn)率分別為7.199 和34.281%。其中耐鹽性指標(biāo)特征向量中的葉長、SOD、可溶性糖和ZT 含量數(shù)值較大，分別為0.322、0.340、0.303 和0.360，反映出鹽脅迫下HN 種質(zhì)幼苗生長、抗氧化酶和內(nèi)源植物激素變化狀況。

表4 3 份葛藤種質(zhì)耐鹽性指標(biāo)的特征值和貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalue and contribution of salt tolerance index of three kinds of P.lobata germplasms

表5 3 份葛藤種質(zhì)耐鹽性指標(biāo)的主成分分析Table 5 Principal component analysis of salt tolerance index of three kinds of P.lobata

JS 葛藤耐鹽性指標(biāo)主成分分析的第Ⅰ主成分特征值λ1=14.192，貢獻(xiàn)率為67.583%，耐鹽性指標(biāo)所對應(yīng)的特征向量中，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、葉長、株高、地上及地下部干重、相對電導(dǎo)率、POD 和CAT 數(shù)值較大，分別為0.254、0.259、0.261、0.260、0.259、0.256、0.254、0.250、0.250 和0.252，集中反映JS 葛藤種子活力和幼苗生長狀況。其第Ⅱ主成分的特征值和貢獻(xiàn)率分別為4.917 和23.413%。其中耐鹽性指標(biāo)特征向量中的丙二醛、可溶性糖、ABA、IAA、GA3含量數(shù)值較大，分別為0.410、0.418、0.318、0.340 和0.406，反映出鹽脅迫下JS 葛藤幼苗的滲透調(diào)節(jié)作用與內(nèi)源植物激素的變化狀況。

綜上可知，第Ⅰ、Ⅱ主成分分別集中反映出AUS、HN、JS 葛藤種質(zhì)耐鹽性指標(biāo)的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到91.167%、94.212%、90.996%，對葛藤耐鹽性綜合評價的指示意義較大。表5 中各耐鹽性指標(biāo)特征向量數(shù)值越大，表明該指標(biāo)越能集中反映3 份葛藤種質(zhì)種子萌發(fā)及幼苗生長對鈣鹽脅迫的敏感性。因此，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、葉長、地上部干重和地下部干重、CAT、ABA、IAA、GA3、ZT 含量可作為AUS 葛藤種質(zhì)耐鹽性綜合評價的主要指標(biāo)；種子活力指數(shù)、葉寬、株高和地上、地下部干重、葉長、SOD、可溶性糖和ZT 含量可作為HN 葛藤種質(zhì)耐鹽性綜合評價的主要指標(biāo)；種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、葉長、株高、地上及地下部干重、相對電導(dǎo)率、POD、CAT、MDA、可溶性糖、ABA、IAA、GA3含量可作為JS 葛藤種質(zhì)耐鹽性綜合評價的主要指標(biāo)。

2.6.23 份葛藤種質(zhì)對鈣鹽脅迫的耐受性綜合評價 通過對3 份葛藤各耐鹽性指標(biāo)的主成分分析，得出3 份葛藤種質(zhì)生長生理指標(biāo)中可以作為鈣鹽脅迫耐受性評價的指標(biāo)，利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對篩選出的3 份葛藤種質(zhì)的生長生理指標(biāo)進(jìn)行鈣鹽耐受性評價（表6），用每份葛藤種質(zhì)各項指標(biāo)隸屬度的平均值作為種質(zhì)耐鈣鹽能力綜合鑒定標(biāo)準(zhǔn)，該值越大耐鈣鹽性越強。結(jié)果顯示：AUS、HN 和JS 種質(zhì)的隸屬函數(shù)平均值分別為0.475、0.487、0.495，表明3 份葛藤種質(zhì)耐鈣鹽能力順序為JS>HN>AUS。

表6 3 份葛藤種質(zhì)對不同鈣鹽濃度的耐受性綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation of tolerance of three P.lobata germplasms to different calcium concentrations

3 討論

3.1 葛藤種子萌發(fā)期對鈣鹽的適應(yīng)性反應(yīng)

植物種子在萌發(fā)期對外界鹽脅迫十分敏感，植物種子發(fā)芽能力受眾多因素的影響［22］。種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標(biāo)能夠較集中地反映種子的發(fā)芽能力［23］。本研究表明在鈣鹽脅迫處理濃度為50 mmol·L-1時，3 份葛藤種質(zhì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)除AUS 種質(zhì)的種子活力指數(shù)和HN 種質(zhì)的發(fā)芽指數(shù)顯著低于CK 外，其余種質(zhì)發(fā)芽指標(biāo)均與CK 無顯著差異，表明低鈣鹽濃度（50 mmol·L-1）脅迫對種子萌發(fā)無顯著抑制作用，種子發(fā)芽能力基本不受影響，3 份種質(zhì)對該鈣鹽濃度脅迫耐受性較強?？赡茉蚴堑外}鹽脅迫濃度下，細(xì)胞中鈣離子參與脅迫信號的感受、傳遞、響應(yīng)與表達(dá)，進(jìn)而提高了植物抗逆性。從100 mmol·L-1CaCl2濃度開始，AUS 和JS 種質(zhì)的各項發(fā)芽指標(biāo)與CK 相比開始顯著降低，到高鈣鹽（200 mmol·L-1）濃度脅迫時，兩者的種子正常萌發(fā)受到顯著抑制。可能原因是高濃度鈣鹽脅迫會對種子產(chǎn)生離子毒性，抑制種子正常萌發(fā)，這與孔德政等［24］和李玉梅等［25］的研究結(jié)果一致。HN 種質(zhì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢與CK 相比，中鈣鹽（100~150 mmol·L-1）濃度脅迫下略有上升趨勢但不顯著，當(dāng)脅迫達(dá)到高鈣鹽（200 mmol·L-1）濃度才開始顯著低于CK，表明其發(fā)芽能力雖較弱，但種子應(yīng)對鈣鹽脅迫時抗逆性較好，可能因為HN 葛藤種質(zhì)種子種皮較硬，導(dǎo)致種子休眠，提高了種子的耐鈣鹽性，導(dǎo)致其在低鈣鹽脅迫下發(fā)芽能力低于AUS 和JS 種質(zhì)，但中高鈣鹽脅迫下卻高于二者。種子休眠在植物界十分常見，是植物幫助自己度過不良環(huán)境的一種常見手段，種子種胚未成熟或缺少必要的激素刺激及種皮或果皮等物理因素的限制是造成種子休眠的因素［26］。

3.2 葛藤幼苗生長及生理對鈣鹽的適應(yīng)性反應(yīng)

3.2.1生長響應(yīng) 植物在應(yīng)對鹽脅迫時，會通過降低株高、葉長、葉寬等形態(tài)指標(biāo)來適應(yīng)脅迫造成的逆境［27］，同時通過對自身不同部位分配不同生物量來維持自身的正常生長［28］。菘藍(lán)（Isatis indigotica）幼苗在低濃度鹽環(huán)境下能維持其正常生長，濃度過高時其生長明顯受到抑制［29］，狹葉香蒲（Typha angustifolia）在高鈣鹽脅迫濃度下的生長被抑制［30］。本研究中，低鈣鹽（50 mmol·L-1）濃度脅迫下，3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉長、葉寬、株高（除HN 種質(zhì)）和地上部干重整體均與CK 無顯著差異，表明低鈣鹽脅迫對3 份葛藤幼苗生長均沒有產(chǎn)生顯著抑制。中高鈣鹽濃度均顯著抑制3 份葛藤種質(zhì)幼苗正常生長，幼苗葉長、葉寬、株高和地上部干重與CK 相比均顯著降低。HN 和JS葛藤種質(zhì)地下部干重在高鈣鹽濃度脅迫下仍與CK 無顯著差異，可能原因是植物通過維持一定的地下生物量來提高自身水分及養(yǎng)分的利用效率，從而提高自身耐鹽能力［31］。

3.2.2生理響應(yīng) 鹽脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，造成植物細(xì)胞膜脂中的不飽和脂肪酸過氧化，導(dǎo)致終產(chǎn)物MDA 含量增加，MDA 含量和相對電導(dǎo)率大小在一定程度代表細(xì)胞膜損傷程度和植物抗逆能力［32-33］。本研究中，MDA 含量與相對電導(dǎo)率大小隨鈣鹽濃度的升高整體呈逐漸上升趨勢，與賈興平等［34］的研究結(jié)果一致。50 mmol·L-1脅迫下，3 份葛藤幼苗葉片相對電導(dǎo)率均略大于CK 但無顯著差異，AUS 葛藤種質(zhì)幼苗MDA 含量略高于CK 但不顯著，HN 和JS 葛藤種質(zhì)幼苗葉片MDA 含量與CK 相比顯著升高，表明低鈣鹽脅迫濃度下，3 份葛藤種質(zhì)幼苗細(xì)胞受到逆境脅迫開始導(dǎo)致細(xì)胞膜膜脂過氧化，但生長指標(biāo)未受到顯著抑制，說明其他生理指標(biāo)起到了重要的調(diào)控作用。

大量研究表明，植物遭受鹽脅迫時會引起細(xì)胞水分虧缺，導(dǎo)致體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量明顯升高［35-37］。游離脯氨酸和可溶性糖是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脯氨酸可作為溶質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞水分環(huán)境的變化［38］，逆境中積累的脯氨酸還可作為能量和氮源的儲存庫，脅迫解除后直接參與植物代謝［39］，可溶性糖可維持細(xì)胞膜穩(wěn)定，提高細(xì)胞保水力和原生質(zhì)彈性來保持植株自身活力［40］。本研究中，3 份葛藤種質(zhì)幼苗葉片可溶性糖和游離脯氨酸含量隨CaCl2濃度的增加均表現(xiàn)為先升后降趨勢，可能是在中低鈣鹽濃度（50~100 mmol·L-1）脅迫下，植物為適應(yīng)逆境環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)脯氨酸和可溶性糖大量合成，以維持植物細(xì)胞內(nèi)外的滲透勢穩(wěn)定，保證植物代謝的正常進(jìn)行與植株正常生長［41］。2 個指標(biāo)分別在150（除AUS）和100 mmol·L-1（除JS）達(dá)到峰值，并在高鈣鹽濃度，特別是200 mmol·L-1脅迫時，植物細(xì)胞內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量下降，可能是隨脅迫濃度持續(xù)升高，鹽害逐漸加重，植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成速度逐漸減弱，而降解速度逐漸增快所致。本研究結(jié)果表明，3 份葛藤種質(zhì)中，JS 脯氨酸含量和可溶性糖含量在各鹽脅迫梯度下均高于其他兩份種質(zhì)，表明JS 種質(zhì)的滲透勢較其他2 份種質(zhì)穩(wěn)定。

逆境脅迫下，SOD 可將植物體內(nèi)產(chǎn)生的傷害性物質(zhì)O2-歧化為H2O2和O2，從而減輕植物體的損傷程度［42］。而由于SOD 歧化作用產(chǎn)生的過量H2O2，會在植物體內(nèi)被氧化形成可以引起細(xì)胞膜脂過氧化的羥自由基（·OH），CAT、POD 和APX 均具有清除植物體內(nèi)H2O2的能力，可以使植物體內(nèi)自由基保持較低水平狀態(tài)［43］。CAT 具有較高的酶活性效率，但對H2O2的親和力較弱。POD 對H2O2有高的親和力，但它能參與葉綠素的降解并引起膜脂過氧化［44］。本試驗中，SOD 和POD 活性在150 mmol·L-1時增長明顯，CAT 活性在50~100 mmol·L-1時增長明顯，一方面表明在不同鈣鹽濃度脅迫下，不同抗氧化酶在清除H2O2中起主導(dǎo)作用，但關(guān)于抗氧化酶作用的關(guān)聯(lián)性有待于進(jìn)一步深入研究；另一方面表明在面臨逆境脅迫時，植物能及時啟動保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)而有效地清除植物體內(nèi)的過氧化物，這是葛藤對環(huán)境脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。3 份種質(zhì)葉片SOD、POD（除JS）和CAT 的活性達(dá)到峰值后，隨著鈣鹽脅迫濃度增加開始下降，表明葛藤體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)受損，過氧化物質(zhì)的產(chǎn)生與清除開始失衡，植物體正常生長受到損害。JS 種質(zhì)POD 和APX 活性在整個脅迫期表現(xiàn)為持續(xù)上升趨勢，有別于其他種質(zhì)，表明其保護(hù)酶系統(tǒng)受損較小。這一生理差異與3 份葛藤種質(zhì)在遭受持續(xù)鈣鹽脅迫時植株的形態(tài)變化是一致的。

3.2.3體內(nèi)激素響應(yīng) 面對逆境脅迫時，植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素含量的變化來調(diào)控植物的新陳代謝，從而使植物能夠維持正常的生理功能［45］。植物內(nèi)源激素是重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。IAA、GA3和ZT 主要表現(xiàn)為促進(jìn)生長作用，ABA 主要表現(xiàn)為生長抑制作用［46］。ABA 是重要的反映植物遭受脅迫反應(yīng)的植物激素，本試驗中，ABA、IAA 和GA3含量均隨鹽脅迫濃度的增加表現(xiàn)為先增后減趨勢?？赡茉蚴窃诘蜐舛让{迫時，葛藤尚能通過調(diào)節(jié)這幾種激素的水平降低生理需求，抵抗脅迫，而高濃度的鈣鹽脅迫對植物造成更大的傷害，使得各部位不能再協(xié)同調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為激素合成下降，植物生長受到顯著影響。前人對于鹽脅迫下ZT 含量變化的研究結(jié)果也不盡相同，其中湖北海棠（Malus hupehensis）［47］葉片ZT 含量隨著鹽濃度的增加呈上升趨勢，而楊樹（Populus）［48］、向日葵（lianthus annuus）［49］的變化趨勢卻相反。本研究中，3 份葛藤種質(zhì)葉片ZT 含量變化在整個脅迫期有不同變化趨勢，AUS 和HN 種質(zhì)均隨鹽脅迫濃度的增加表現(xiàn)為先增后減趨勢，JS 種質(zhì)則表現(xiàn)為隨脅迫濃度增加呈下降趨勢，有學(xué)者認(rèn)為這是由于植物細(xì)胞內(nèi)外離子平衡隨電解質(zhì)滲漏被打破，破壞了細(xì)胞器正常合成ZT 激素的pH 環(huán)境，從而抑制了ZT 的正常合成［50］。不同植物對逆境反應(yīng)的調(diào)控機制不同，植物可能通過多種激素的相互協(xié)調(diào)，來維持自身的正常生長，對此仍需進(jìn)一步研究。

3.3 耐鹽性綜合評價

植物耐鹽性是由多種因素的相互作用和協(xié)同作用決定的，鈣鹽脅迫對植物的影響是多方面的，植物通過自身營養(yǎng)物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶活性等多種生理機制的共同作用來減輕或延緩傷害的發(fā)生［51］。因此，選擇單一的耐鹽種質(zhì)材料篩選評價指標(biāo)局限性較大，本研究結(jié)合主成分分析法和模糊隸屬函數(shù)法對3 份葛藤種質(zhì)耐鹽性進(jìn)行綜合評價，經(jīng)主成分分析篩選出耐鹽性綜合評價的主要指標(biāo)，克服了信息重疊與指標(biāo)的相關(guān)性，既避免單一指標(biāo)的片面性，又在多指標(biāo)的基礎(chǔ)上對3 份葛藤種質(zhì)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評價，求得3 份葛藤種質(zhì)不同生長生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值，作為不同種質(zhì)耐鈣鹽能力綜合鑒定標(biāo)準(zhǔn)，該值越大，葛藤耐鹽性越強。結(jié)果表明發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、葉長、葉寬、株高、地上部干重、地下部干重、MDA、POD、CAT、SOD 活性、相對電導(dǎo)率、可溶性糖、ABA、IAA、GA3、ZT 含量對鈣鹽脅迫處理比較敏感，可將其作為3 份葛藤種質(zhì)耐鹽性綜合評價指標(biāo)。AUS 種質(zhì)對鈣鹽脅迫耐受性最差，HN 種質(zhì)次之，JS 種質(zhì)最強。

4 結(jié)論

通過研究不同濃度鈣鹽脅迫對不同產(chǎn)地3 份葛藤種質(zhì)種子萌發(fā)、幼苗生長、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶系統(tǒng)及植物內(nèi)源激素的影響，認(rèn)為高鈣鹽濃度顯著抑制葛藤種子萌發(fā)率、萌發(fā)速度及種苗生活力，但部分種子可通過種子休眠來規(guī)避這種逆境。為緩解鈣鹽脅迫傷害，葛藤幼苗通過提高自身有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、增強不同時期不同抗氧化酶活性、改變內(nèi)源激素含量等方式來快速調(diào)節(jié)自身生理代謝功能，進(jìn)而更迅速適應(yīng)鈣鹽脅迫環(huán)境。CaCl2濃度在0~50 mmol·L-1時，對葛藤種質(zhì)幼苗無顯著抑制作用，表明葛藤對低鈣鹽脅迫具有一定耐受性。結(jié)合主成分和隸屬函數(shù)分析，本研究認(rèn)為AUS 種質(zhì)對鈣鹽脅迫耐受性最差，HN 種質(zhì)次之，JS 種質(zhì)最強。