劉思林，陳俊雪，楊陽，陳中文，盧玲玲，牟英輝，2*

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南地區(qū)作物栽培科學(xué)觀測實驗站，廣東 廣州 510642）

牛筋草（Eleusine indica）是一年生禾本科穇屬植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上屬于危害作物生長的一種世界性雜草［1］。在一些適宜牛筋草生長的區(qū)域，牛筋草以強(qiáng)大的繁殖力及抗性演變成為惡性雜草。近年來，由于過度地使用除草劑，使得牛筋草產(chǎn)生了極強(qiáng)的抗藥性［2-3］，這迫切需要尋找能夠減少除草劑使用的其他形式的控草方法。紫云英（Astragalus sinicus）是豆科黃耆屬二年生草本植物，是一種重要的綠肥作物。冬種紫云英可以提高土壤肥力［4-8］、減少化肥施用［9-11］、改善土壤理化性質(zhì)［12-15］以及保持水土［16-17］。此外，間套作紫云英可以提高目標(biāo)作物的品質(zhì)［13］、產(chǎn)量［10，18-19］和抗病蟲害能力［20］。由此可見，紫云英的研究關(guān)注點在于其對作物生長、土壤理化性質(zhì)及病蟲害的影響方面，而關(guān)于紫云英對雜草的抑制作用，尤其是還田后的殘枝腐解物對后茬作物田間雜草防控方面的研究甚少。本研究以綠肥翻壓還田的利用方式作為切入點，結(jié)合前人研究及田間觀察設(shè)計了腐解物控草試驗，以期找到紫云英腐解規(guī)律，明確紫云英腐解物對牛筋草的影響，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上合理地利用和開發(fā)紫云英這一生物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

KES 2.0 人工氣候箱、恒溫?fù)u床、YLD-561 型游標(biāo)卡尺（德國）、PIP 9.1 顯微鏡（廣東珠海）、高壓滅菌鍋、BSA224S 型萬分之一電子天平（德國）、SX711 型pH 計（上海）和SW-301 型電導(dǎo)率計（廣東廣州）。

1.2 材料

試驗用紫云英種子由御景園綠化工程有限公司提供。2020 年7 月，在人工氣候培養(yǎng)箱中播種紫云英，設(shè)置溫度（23±2）℃，濕度75%，12 h/12 h 光暗周期，期間保持土壤濕潤，并于同年9 月收集紫云英秸稈，在自然條件下風(fēng)干，粉碎，室溫下密閉干燥備用。牛筋草種子由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院陳勇老師實驗室提供，采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城實驗基地（23°14′18.42″N，113°38′8.06″E）。

1.3 器材滅菌與種子消毒

將鑷子、濾紙和培養(yǎng)皿放入高壓滅菌鍋內(nèi)，經(jīng)過121 ℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min，待滅菌鍋氣壓降至常壓時取出，放置于較為干凈的無菌櫥或?qū)嶒炇覂?nèi)冷卻備用。將種子放進(jìn)75%乙醇中處理30 s，期間適當(dāng)振蕩，消毒完畢用無菌水沖洗2 次，再放入已配制好的濃度為2.2%的次氯酸鈉溶液中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩滅菌12 min。種子滅菌完畢后取出，用無菌水沖洗5 次。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1紫云英腐解液對牛筋草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響 將風(fēng)干后的紫云英全株粉末按粉末∶土∶水=1∶1∶30（m∶m∶v）混合，裝入具蓋的廣口塑料瓶中，以不添加紫云英粉末的土壤溶液作為對照（CK），放置于28 ℃200 r·min-1的恒溫?fù)u床中分別腐解2、3、7 和15 d，獲得紫云英腐解液。腐解液及對照經(jīng)濾紙過濾以及12000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，得到的除菌腐解液用滅菌超純水配制成2%、5%、30%和80%濃度梯度培養(yǎng)液。種子萌發(fā)采用雙層濾紙法，處理組每個皿加2 mL 培養(yǎng)液，對照組（CK）加等量對照溶液，每個處理5 個重復(fù)，每個皿接種30 粒種子，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，相對濕度控制在75%左右，暗培養(yǎng)。每天下午5 點觀察并統(tǒng)計一次數(shù)據(jù)，補(bǔ)充培養(yǎng)皿內(nèi)的水分。以胚根出現(xiàn)作為種子發(fā)芽標(biāo)志，3 d 內(nèi)發(fā)芽總數(shù)不變時停止統(tǒng)計發(fā)芽率并測定幼苗生理指標(biāo)。

1.4.2紫云英腐解液對牛筋草幼苗的化感作用 用腐解15 d 的紫云英腐解液配制成2%、5%、30%和80%（V∶V）濃度梯度培養(yǎng)液，對生長于基質(zhì)中2 周的兩葉期牛筋草幼苗進(jìn)行灌根處理，對照組（CK）以不含紫云英粉末的土壤溶液處理。每個處理5 個重復(fù)，每盆種植10 株幼苗。自灌根處理后7 d 內(nèi)每隔2 d 補(bǔ)充1 次培養(yǎng)液，7 d停止培養(yǎng)，取葉片測定每個處理的保護(hù)酶體系活性、脯氨酸（proline，Pro）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，每個重復(fù)取0.3 g 葉片于研缽，加入總體積為5 mL 的pH 7.8 磷酸緩沖液用液氮研磨成勻漿狀后，置于超聲清洗機(jī)內(nèi)10 ℃以下超聲提取1 min。提取液經(jīng)4 ℃，8000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液，存于-20 ℃用于酶活性及MDA 含量分析。采用磺基水楊酸研磨提取液測定Pro 含量。

1.5 測定方法

萌發(fā)試驗：測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、株高和鮮重6 個指標(biāo)。每個重復(fù)取10 株長勢均一的幼苗測定株高；從5 個重復(fù)中隨機(jī)取20 株測定總鮮重（數(shù)量不足的處理按一定比例縮小取樣數(shù)量，稱重后最終結(jié)果乘相應(yīng)倍數(shù)），3 次重復(fù)。發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)則按以下公式計算：

式中：Gt表示發(fā)芽數(shù)，Dt表示天數(shù)；S表示株高均值。

pH 值和電導(dǎo)率測定：將腐解了0、2、3、7 和15 d 的紫云英腐解液過濾后置于燒杯中，使用pH 計和電導(dǎo)率計分別測定其中的酸堿度和電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）。

幼苗試驗：采用NBT 還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，TBA 法測定MDA 含量。取幼苗最后一片完全展開葉，采用DAB 染色法進(jìn)行H2O2 組織原位定位分析，采用磺基水楊酸研磨提取，酸性茚三酮法測定脯氨酸（proline，Pro）含量［21］。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

計算不同腐解天數(shù)腐解液處理的各測定指標(biāo)平均值，用其化感隸屬值（respond index，RI）評價紫云英腐解物的化感效應(yīng)。表示化感促進(jìn)作用；RI<0，表示化感抑制作用；絕對值大小與化感作用強(qiáng)弱一致，計算各萌發(fā)指標(biāo)的化感隸屬值累加值，綜合評價腐解物的化感效應(yīng)［22］，在本研究中，RI 累加值達(dá)到-6 時，表明牛筋草的萌發(fā)和生長被完全抑制。

采用SPSS 24 對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 7 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英腐解液電導(dǎo)率及酸堿度變化

紫云英腐解液酸堿度隨著腐解時間增加呈現(xiàn)下降趨勢，以腐解2 d 時下降最快，腐解7~15 d 降幅較小。腐解液電導(dǎo)率在腐解2 d 時快速上升并達(dá)到最大值，隨后5 d 時間內(nèi)電導(dǎo)率下降，腐解7~15 d 電導(dǎo)率緩慢上升（圖1）。

圖1 不同腐解天數(shù)腐解液的電導(dǎo)率及酸堿度變化Fig. 1 The changes of electrical conductivity and pH of decomposed liquids in different decay days

2.2 紫云英腐解液對牛筋草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響和綜合評價

腐解時間≤3 d，濃度為2%，以及濃度為5%的2 d 腐解液對牛筋草種子發(fā)芽率表現(xiàn)為促進(jìn)作用，濃度≥30%時表現(xiàn)為抑制作用。當(dāng)腐解時間≥7 d 時，試驗設(shè)計的各濃度腐解液均對牛筋草萌發(fā)起到抑制作用。腐解時間≥3 d，腐解液濃度為80%及腐解時間為15 d，腐解液濃度≥30%的處理下牛筋草發(fā)芽率為0。腐解2 d，濃度≤5%及腐解3 d，濃度為2%的紫云英腐解液對牛筋草發(fā)芽勢表現(xiàn)為促進(jìn)作用，當(dāng)濃度升高時表現(xiàn)為抑制作用。當(dāng)腐解時間≥7 d 時，試驗設(shè)計的各濃度腐解液均對牛筋草發(fā)芽勢起到抑制作用。腐解天數(shù)≥2 d，腐解液濃度為80%的處理條件下，牛筋草種子發(fā)芽勢為0。腐解7 d 濃度≥30%及腐解15 d，濃度≥5%的處理組牛筋草種子發(fā)芽勢為0。腐解時間≤3 d，濃度為2%，以及濃度為5%的2 d 腐解液能提高牛筋草種子發(fā)芽指數(shù)，其余濃度處理降低牛筋草種子發(fā)芽指數(shù)。當(dāng)腐解時間≥7 d 時，試驗設(shè)計的各濃度腐解液均對牛筋草發(fā)芽指數(shù)起到抑制作用，其中腐解≥7 d，濃度為30%的處理組發(fā)芽指數(shù)及腐解≥3 d，濃度為80%的處理組牛筋草發(fā)芽指數(shù)為0。腐解時間≤7 d 的腐解液在2%濃度條件下對牛筋草種子活力指數(shù)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其中腐解天數(shù)為2 d 的腐解液在濃度為5%時可以顯著提高牛筋草種子活力。腐解時間≥3 d，濃度≥5%及腐解時間為15 d 濃度≥2%的腐解液對牛筋草種子活力指數(shù)表現(xiàn)為抑制作用。腐解時間≥3 d，腐解液濃度為80%及腐解時間≥7 d，腐解液濃度≥30%的處理下，牛筋草種子活力為0（圖2）。

圖2 不同濃度及不同腐解天數(shù)腐解液對牛筋草種子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different concentrations and different decay days decomposed liquids on the seeds germination of goosegrass

腐解時間≤7 d，濃度≤5%及腐解15 d 濃度為2%的腐解液對牛筋草株高表現(xiàn)為促進(jìn)作用，此外，腐解時間為3 d，濃度為30%的腐解液對牛筋草幼苗株高表現(xiàn)為促進(jìn)作用。4 個腐解時間段的80%腐解液以及7 d 和15 d濃度為30%的腐解液處理均能顯著抑制牛筋草株高。腐解時間≤7 d，濃度≤5%，以及濃度為30%的3 d 腐解液能顯著促進(jìn)牛筋草鮮重的增加。腐解時間為3 d，濃度為80%、腐解時間為7 d，濃度≥30%以及腐解時間為15 d，濃度>5%的腐解液處理下牛筋草鮮重為0（15 d 腐解液處理下，濃度為5%和30%的處理組，平均分別只有2 株和1 株萌發(fā)，取樣不具代表性，無法準(zhǔn)確測定鮮重，故其結(jié)果記為0）（圖3）。

圖3 不同濃度及不同腐解天數(shù)腐解液對牛筋草幼苗生長的影響Fig.3 Effects of different concentrations and different decay days decomposed liquids on the seedling growth of goosegrass

結(jié)合表觀生物學(xué)特征化感抑制效應(yīng)分析，紫云英秸稈經(jīng)過15 d 腐解產(chǎn)生的腐解液能顯著抑制牛筋草萌發(fā)，但是對腐解時間小于7 d，濃度小于30%的腐解液處理下萌發(fā)的牛筋草株高抑制效應(yīng)不明顯（圖4）。

圖4 不同濃度及不同腐解天數(shù)腐解液對牛筋草萌發(fā)的影響效果Fig. 4 Effect of different concentrations and different decay days decomposed liquids on the germination of goosegrass

以化感作用隸屬累加值作為紫云英對牛筋草化感作用的評價指標(biāo)，腐解2 d 的低濃度（≤5%）腐解液及腐解3~7 d 濃度為2%的紫云英腐解液對牛筋草種子萌發(fā)和生長有促進(jìn)作用，其余處理均不利于牛筋草萌發(fā)和生長，隨著腐解天數(shù)和濃度的增加，腐解液對牛筋草的化感抑制作用增強(qiáng)（表1）。

表1 紫云英2~15 d 腐解液對牛筋草種子萌發(fā)和生長的綜合評價Table 1 Comprehensive evaluation of 2-15 days decomposed liquids on seed germination and growth of goosegrass

2.3 紫云英15 d 腐解液對牛筋草幼苗生長的影響

不同濃度紫云英15 d 腐解液處理下，通過牛筋草幼苗鮮重數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度腐解液對牛筋草鮮重的增加具有顯著抑制作用。相比CK，在含有腐解液的處理中，牛筋草根長也受到抑制，特別是80%濃度處理下的牛筋草，其根系較其他處理短且色深。通過觀察葉色也不難看出，高濃度（≥30%）腐解液處理下的牛筋草葉子顏色相比其他處理較黃。綜上，紫云英腐解液可以有效抑制牛筋草幼苗的生長（圖5）。

圖5 不同濃度15 d 腐解液對牛筋草幼苗的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of 15 days decomposed liquid on goosegrass seedlings

2.4 紫云英15 d 腐解液對牛筋草幼苗保護(hù)酶活性、MDA 和Pro 含 量 的 影 響

牛筋草SOD 活性隨著腐解液濃度升高而極顯著下降（P<0.001）；POD 活性在低濃度（≤5%）腐解液處理條件下活性極顯著下降，濃度>30%處理時活性提高，其中80%條件下達(dá)到極顯著水平。CAT 活性在30%腐解液濃度內(nèi)隨著濃度升高而升高，2%濃度處理時活性提高不顯著，5%和30%濃度條件下達(dá)到顯著水平（分別為P<0.05 和P<0.01），當(dāng)濃度達(dá)到80%時活性極顯著下降。MDA 含量隨著濃度的升高而升高，即使是在低濃度腐解液條件下，MDA 水平也極顯著高于對照組。牛筋草植株P(guān)ro 含量隨著腐解液濃度升高而升高，當(dāng)腐解液濃度≥5%時，Pro 含量升高程度達(dá)顯著水平（圖6）。

圖6 不同濃度15 d 腐解液對牛筋草幼苗SOD、POD、CAT 活性、MDA 及Pro 含量的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of 15 days decomposed liquid on SOD，POD，CAT activity，MDA and Pro contents of goosegrass seedlings

2.5 牛筋草幼苗葉片H2O2的組織原位定位分析

腐解液濃度<5%時，牛筋草葉片不產(chǎn)生明顯的褐斑，當(dāng)濃度≥5%時，褐斑逐漸增多，當(dāng)濃度≥30%時，葉尖處積累較多H2O2，經(jīng)染色處理后在葉尖部的葉脈附近呈現(xiàn)黃褐色。80%濃度處理下牛筋草葉尖、葉中部及葉基部的H2O2含量均較其他濃度處理多。H2O2在牛筋草葉片不同部位聚集程度不同，葉尖較葉基部多，葉脈較葉肉多（圖7）。

圖7 牛筋草幼苗葉片不同部位H2O2定位Fig.7 Location of H2O2 in different parts of leaf of goosegrass seedlings

3 討論

綠肥是一種全養(yǎng)分植物源肥料，合理使用綠肥不僅可以起到提高地力、改良土壤和保持水土的作用，還可以減少土傳病害［23-24］、控制蟲害發(fā)生［25］以及控制雜草生長［26］。植被覆蓋可以減少除草劑的使用，增加土壤養(yǎng)分，是有機(jī)農(nóng)業(yè)［27］、生態(tài)農(nóng)業(yè)以及可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要組成部分［28］。紫云英作為綠肥使用時常將地上部分粉碎后利用旋耕機(jī)翻壓或鏵式犁翻壓，使其分布于表土下自然腐解。綠肥殘枝落葉腐解或浸提液可以促進(jìn)或者抑制其他植物的生長，這與提取過程中化感物質(zhì)的合成與釋放有關(guān)［22，29-30］。唐杉等［31］通過多年定位試驗研究了紫云英還田對水稻（Oryza sativa）田種子庫密度和多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)多年紫云英還田可以顯著減少雜草種子庫密度并顯著提高了雜草種子庫物種多樣性及均勻度，這表明還田紫云英有控草的效果，同時，提高雜草種子庫物種多樣性及均勻度有利于稻田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。通過4 個時間段腐解液處理綜合評價可以看出，紫云英中含有對牛筋草種子萌發(fā)和生長存在抑制作用的物質(zhì)，其含量隨著腐解時間的增加而增加。低濃度短時間腐解的腐解液對牛筋草的生長表現(xiàn)為化感促進(jìn)作用，這可能是腐解物中對牛筋草生長不利的化感物質(zhì)含量較少，對牛筋草種子的傷害小或者是低濃度腐解液提高了相關(guān)酶活性。莊宇等［32］在研究棉花（Gossypiumspp）水浸提液對西瓜（Citrullus lanatus）、大豆（Glycine max）種子萌發(fā)與幼苗生長的影響也認(rèn)為低濃度的浸提液可以顯著促進(jìn)供試植物的生長。

牛筋草對紫云英15 d 腐解液保護(hù)酶體系的響應(yīng)各不相同，其中SOD 活性呈快速下降的趨勢，且變化趨勢在3個酶當(dāng)中最大，這說明SOD 對腐解液敏感度最高。POD 活性在低濃度（≤5%）腐解液條件下先下降，當(dāng)腐解液濃度升高到80%時活性顯著高于對照組，POD 活性變化與萌發(fā)試驗及幼苗試驗牛筋草長勢變化呈負(fù)相關(guān)，這說明POD 可能是牛筋草抵御紫云英腐解液中有害物質(zhì)的關(guān)鍵酶。張金云［30］在研究山核桃（Carya cathayensis）外果皮化感物質(zhì)對早熟禾（Poa annua）種子POD 活性的影響中也認(rèn)為一些化合物濃度的提高會持續(xù)顯著提高POD活性。CAT 在2%濃度腐解液處理下活性提高不顯著（P>0.05），而在濃度提高時活性先增后減，說明CAT 能在一定程度上起到清除過氧化氫的作用，但是隨著濃度的升高，CAT 活性極顯著下降，表明高濃度腐解液可以抑制該酶活性，這與前人研究棉花浸提液對作物生長結(jié)論相似［32］。

植物器官組織在逆境下遭受傷害或衰老時，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，生成過氧化脂質(zhì)，后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括MDA，積累MDA 對膜和細(xì)胞能造成傷害，其含量能用來反映植物受逆境傷害的程度［33］。試驗牛筋草植株葉片MDA 含量隨著腐解液濃度的升高而升高，即使是在低濃度腐解液條件下，MDA 水平也極顯著高于對照組，這與牛歡歡［29］在研究光葉紫花苕子（Vicia angustifolia）對牧草的化感作用試驗結(jié)論一致。這表明腐解液中存在的物質(zhì)對牛筋草細(xì)胞脂膜具有氧化性，低濃度下腐解液對牛筋草的傷害較低，能促進(jìn)牛筋草的生長，這可能是低濃度腐解液對牛筋草種子起到引發(fā)的作用，促進(jìn)保護(hù)酶活性提高，起到煉苗的作用，因此總體上表現(xiàn)為促進(jìn)作用。這與朱迎樹等［34］研究引發(fā)對老化大麥（Hordeum vulgare）種子的影響結(jié)論相似。

當(dāng)植物遭受滲透脅迫，造成生理性缺水時，植物體內(nèi)脯氨酸大量累積。腐解液濃度為2%時對牛筋草幼苗脯氨酸含量影響不顯著，可能是因為腐解液濃度低，沒達(dá)到滲透脅迫所需濃度。當(dāng)腐解液濃度大于5%時，隨著腐解液濃度升高，牛筋草體內(nèi)脯氨酸含量逐漸升高，這表明濃度大于5%的腐解液能對牛筋草造成脅迫，這與古龍［35］研究黃菊（Chrysanthemum morifolium）浸提液對單子葉雜草及油茶（Camellia oleifera）的化感作用的結(jié)論一致。從牛筋草葉片過氧化氫組織定位鏡檢圖可以看出，高濃度的腐解液處理下牛筋草葉片過氧化氫含量明顯增加，這可能是導(dǎo)致MDA 含量以及POD 活性提高的原因。

4 結(jié)論

通過利用紫云英腐解液對牛筋草種子及幼苗進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)腐解時間>3 d，濃度為80%及腐解時間為15 d濃度≥30%的腐解液可以完全抑制牛筋草的萌發(fā)。試驗設(shè)計的4 個腐解時間和腐解濃度中，最適的紫云英腐解時間為15 d，最適的抑制牛筋草的腐解液濃度為80%。隨著腐解液濃度的提高，腐解液對幼苗SOD 活性的抑制作用增強(qiáng)。低濃度（<30%）的腐解液會降低POD 活性，但會提高CAT 活性；相反，高濃度（80%）的腐解液會提高POD 活性，但會降低CAT 活性。紫云英腐解液可使牛筋草細(xì)胞脂膜發(fā)生氧化作用，對幼苗生長造成滲透脅迫。紫云英腐解液對牛筋草種子的萌發(fā)與幼苗的生長存在抑制作用，對牛筋草種子及幼苗生長的影響呈現(xiàn)“低促高抑”的規(guī)律，結(jié)果可為發(fā)掘紫云英中抗雜草活性物質(zhì)提供參考。