迷迭香脂溶性抗氧化劑活性及抑制食用植物油脂氧化作用研究

王瑩，曾祥輝，鄧慧，王瑛，楊夢(mèng)男

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000)

油脂在貯存過程中容易發(fā)生氧化變質(zhì)，其主要原因是油脂本身由大量不飽和脂肪酸構(gòu)成[1]，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間貯藏時(shí)，受外界因素及微生物影響，極易氧化生成氫過氧化物，進(jìn)一步分解產(chǎn)生許多構(gòu)成油脂異味的不良成分[2-4]。油脂氧化變質(zhì)不僅會(huì)造成味道、色澤、品質(zhì)的下降，而且嚴(yán)重威脅了人體健康[5-6]。長(zhǎng)期以來，人們習(xí)慣于在油脂中加入人工合成抗氧化劑來抑制氧化反應(yīng)進(jìn)行保鮮，但隨著人工合成抗氧化劑的缺點(diǎn)越來越明顯，選擇天然抗氧化劑在油脂中的應(yīng)用已成為一種趨勢(shì)[7-8]。

迷迭香是一種高效的天然抗氧化劑，在迷迭香提取物中，二萜類化合物是發(fā)揮抗氧化作用的主要物質(zhì)，其高活性抗氧化成分鼠尾草酸、鼠尾草酚在防止油脂氧化方面具有顯著效果，可有效抑制細(xì)菌的生理活性，起到抑菌防腐的作用[9-10]，促進(jìn)油脂在防腐保鮮及抗氧化方面的發(fā)展[11-12]。國(guó)內(nèi)外均研究發(fā)現(xiàn)，添加迷迭香提取物能夠有效抑制食用植物油脂和動(dòng)物油脂在加工儲(chǔ)藏過程中的氧化作用，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期[13-15]。本研究不使用化學(xué)試劑，對(duì)以食用油為提取劑提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑進(jìn)行體外抗氧化活性研究，再將提取液加入到食用油中分析其抗氧化性能，提供一種全新的天然抗氧化劑，解決食用油在加工運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過程中發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)的問題。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

迷迭香葉；食用油：邵陽(yáng)市純香榨油坊；2,2-聯(lián)氨基-雙-二銨鹽、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼：純度≥97%，上海如吉生物科技有限公司；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等：食品級(jí)；冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、硫代硫酸鈉、三氯化鐵、三氯乙酸等：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-II電熱恒溫水浴鍋、202-0A電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；VELOCITY 14R離心機(jī) Dynamica Scientific Ltd.；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 迷迭香提取液的制備與處理

準(zhǔn)確稱取一定量使用水蒸氣蒸餾法去精油的迷迭香粉末于錐形瓶中，以食用油為提取劑[16-17]，選取最優(yōu)提取條件，采用恒溫水浴浸提法進(jìn)行提取，離心過濾后得迷迭香脂溶性抗氧化劑提取液，分別進(jìn)行乙腈萃取旋蒸凍干后的體外抗氧化活性測(cè)定與將迷迭香脂溶性抗氧化劑提取液加入食用油中的油脂抗氧化試驗(yàn)。

1.3.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考Chen等[18]的方法并稍作改動(dòng)，取不同濃度梯度(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香樣品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.135 mmol/L的DPPH工作液，混合均勻，于室溫條件下避光反應(yīng)30 min。以溶劑校零，測(cè)定其在517 nm處的吸光度。

消除率(%)=[1-(AS-AB)/A0]×100%。

式中：AS為樣品反應(yīng)組的吸光度值；AB為陰性對(duì)照組的吸光度值；A0為空白對(duì)照組測(cè)定的吸光度值，下式同。

1.3.3 ABTS自由基清除率測(cè)定

取不同濃度梯度(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香樣品溶液2.0 mL，參考Re等[19]的方法并稍作改動(dòng)，加入2.0 mL(在734 nm處吸光度值為0.7±0.02)的ABTS工作液，混合均勻，于室溫條件下避光反應(yīng)30 min。以無水乙醇或去離子水校零，測(cè)定其在734 nm處的吸光度，同時(shí)按照相同的方法作空白對(duì)照以及陰性對(duì)照。

消除率(%)=[1-(AS-AB)/A0]×100%。

1.3.4 OH自由基清除率測(cè)定

參考Liu等[20]的方法，取(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香樣品溶液1.0 mL，先加入1.0 mL的FeSO4溶液，再依次加入1.0 mL的水楊酸溶液和1.0 mL的H2O2溶液，置于37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min，測(cè)定其在510 nm處的吸光度。

消除率(%)=[1-(AS-AB)/A0]×100%。

1.3.5 Fe3+還原力測(cè)定

參考楊明非等[21]的方法并稍作修改，取(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香樣品溶液1.0 mL，依次向反應(yīng)體系中加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液與鐵氰化鉀溶液，混合均勻后置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸溶液進(jìn)行終止反應(yīng)，于5000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液2.5 mL，按順序加入2.5 mL蒸餾水與0.5 mL三氯化鐵溶液，充分搖勻，室溫條件下反應(yīng)10 min，在700 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定。

吸光度值=AS-A0。

1.3.6 油脂抗氧化試驗(yàn)

采用Schaal烘箱法，按GB 2760-2014標(biāo)準(zhǔn)添加不同的抗氧化劑，混合均勻，同時(shí)以不添加任何抗氧化劑的油樣作空白，將所有試樣敞口放置于(60±1) ℃電熱恒溫干燥箱中強(qiáng)化保存，并交換其位置，每隔3 d分別取平行樣，參考GB 5009.227-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》測(cè)定食用油的過氧化值，分析迷迭香脂溶性抗氧化劑的抗氧化性能。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 迷迭香脂溶性抗氧化劑體外抗氧化活性

2.1.1 清除DPPH自由基能力

由圖1可知，在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，采用不同食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除率均呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算可以得出，采用大豆油、花生油、芝麻油、菜籽油和葵花籽油為提取劑,提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度分別為0.103，0.044，0.032，0.037，0.033 mg/mL，采用芝麻油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力略高于同質(zhì)量濃度的花生油、菜籽油、葵花籽油提取劑，明顯高于同質(zhì)量濃度的大豆油提取劑。

圖1 迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of rosemary fat-soluble antioxidants on DPPH radicals

2.1.2 清除OH自由基能力

由圖2可知，采用不同食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)OH自由基具有一定的清除能力，在0.02～0.64 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，由5種食用油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑的OH自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算得出由大豆油、花生油、芝麻油、菜籽油、葵花籽油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑清除OH自由基的IC50值分別為0.551，0.595，0.453，0.265，0.638 mg/mL，在相同質(zhì)量濃度下，菜籽油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)OH自由基的清除能力最高。雖然整體迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)OH自由基清除活性不高，但依舊具有有效清除的能力，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用。

圖2 迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)OH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of rosemary fat-soluble antioxidants on OH radicals

2.1.3 清除ABTS自由基能力

由圖3可知，采用5種食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)ABTS自由基都具有較強(qiáng)的清除效果，ABTS自由基清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，在0.02～0.08 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增幅極顯著。其中，以大豆油、花生油、芝麻油、菜籽油和葵花籽油為提取劑提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑清除ABTS自由基的IC50值分別為0.261，0.123，0.060，0.097，0.203 mg/mL，芝麻油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)ABTS自由基的清除作用最好，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率為31.21%，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率達(dá)到69.65%，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性能力。

圖3 迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.3 The scavenging effect of rosemary fat-soluble antioxidants on ABTS radicals

2.1.4 Fe3+還原力

Fe3+還原力是抗氧化物質(zhì)提供電子能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，自由基通過抗氧化物質(zhì)提供的電子而失活，通常情況下，抗氧化活性與抗氧化物質(zhì)的還原能力有顯著的相關(guān)性，測(cè)定的吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)，樣品的抗氧化活性也越強(qiáng)[22]。

由圖4可知，樣品在700 nm處的吸光度值與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，F(xiàn)e3+還原力隨著迷迭香脂溶性抗氧化劑質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。在相同的質(zhì)量濃度下，采用葵花籽油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑的Fe3+還原力>芝麻油>菜籽油>花生油>大豆油。由此表明，迷迭香脂溶性抗氧化劑具有一定的Fe3+還原能力，且葵花籽油提取的效果最佳。

圖4 迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)Fe3+的還原力Fig.4 Reducing power of rosemary fat-soluble antioxidants to Fe3+

2.2 迷迭香脂溶性抗氧化劑抑制食用油氧化效果

2.2.1 大豆油

由圖5可知，添加迷迭香提取液及迷迭香提取液與Vc復(fù)配的大豆油樣過氧化值隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢上升，抗氧化能力強(qiáng)于BHT、TBHQ化學(xué)合成抗氧化劑，從第12天開始，兩組油樣之間增幅變大，與Vc復(fù)配后的迷迭香提取液抗氧化能力有所增強(qiáng)，說明迷迭香提取液與Vc復(fù)配對(duì)大豆油具有協(xié)同增效的作用。

圖5 抗氧化劑對(duì)大豆油的抗氧化作用Fig.5 Antioxidant effect of antioxidants on soybean oil

2.2.2 花生油

由圖6可知，對(duì)比空白對(duì)照組，4種抗氧化劑添加到花生油中均起到較好的抗氧化作用，延緩了花生油的氧化，相比較而言，添加迷迭香提取液的油樣過氧化值總體低于加入化學(xué)合成抗氧化劑BHT與TBHQ的，對(duì)花生油的抗氧化作用由大到小為：迷迭香提取液+Vc>迷迭香提取液>TBHQ>BHT。

圖6 抗氧化劑對(duì)花生油的抗氧化作用Fig.6 Antioxidant effect of antioxidants on peanut oil

2.2.3 芝麻油

由圖7可知，除空白對(duì)照組外，其余添加了抗氧化劑的4組油樣過氧化值增幅緩慢并且差距不大，均明顯小于空白對(duì)照組。在高溫加速氧化過程中，芝麻油中含有大量的不飽和脂肪酸，本應(yīng)易氧化，但空白對(duì)照組過氧化值整體增幅比其他食用油小，這是由于芝麻油中含有木脂素類化合物和生育酚類物質(zhì)。

圖7 抗氧化劑對(duì)芝麻油的抗氧化作用Fig.7 Antioxidant effect of antioxidants on sesame oil

2.2.4 菜籽油

由圖8可知，添加BHT、TBHQ、迷迭香提取液和迷迭香提取液+Vc的油樣，過氧化值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增長(zhǎng)，在6 d之前，各組之間過氧化值差距不大，遠(yuǎn)小于空白對(duì)照組，誘導(dǎo)時(shí)間大于6 d后，4組油樣之間增幅出現(xiàn)差異，其中，添加了迷迭香提取液+Vc組的菜籽油樣表現(xiàn)出最好的抗氧化效果。

圖8 抗氧化劑對(duì)菜籽油的抗氧化作用Fig.8 Antioxidant effect of antioxidants on rapeseed oil

2.2.5 葵花籽油

由圖9可知，在烘箱法處理中，5組油樣的過氧化值隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，試驗(yàn)組的葵花籽油過氧化值均低于空白對(duì)照組，在一定程度上提高了葵花籽油的氧化穩(wěn)定性，其中，添加了迷迭香提取液的葵花籽油氧化速率較平緩，迷迭香提取液+Vc復(fù)配的油樣組在氧化15 d后過氧化值還未達(dá)到20 meq/kg，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

圖9 抗氧化劑對(duì)葵花籽油的抗氧化作用Fig.9 Antioxidant effect of antioxidants on sunflower seed oil

綜上可知，添加了抗氧化劑的5種食用油的過氧化值始終小于空白對(duì)照組，這表明使用人工合成抗氧化劑BHT、TBHQ與迷迭香脂溶性抗氧化劑提取液，以及迷迭香脂溶性抗氧化劑提取液與Vc復(fù)配均可延緩食用油的氧化，但抗氧化性能強(qiáng)弱不一。由圖5和圖9可知，4種抗氧化劑加入多不飽和脂肪酸油(大豆油、葵花籽油)的過氧化值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)大致相同，從第3天開始，加入抗氧化劑的食用油與空白對(duì)照組的抗氧化能力開始產(chǎn)生差別，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，迷迭香脂溶性抗氧化劑提取液在食用油中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，抗氧化能力大小在這兩種油中有著相同的順序，依次為迷迭香提取液+Vc>迷迭香提取液>TBHQ>BHT；由圖7和圖8可知，4種抗氧化劑在單不飽和脂肪酸油(菜籽油)和油酸、亞油酸基本各占50%的芝麻油中沒有明顯的抗氧化作用差異，迷迭香脂溶性抗氧化劑提取液與Vc復(fù)配效果略強(qiáng)于其他3類抗氧化劑；由圖6可知，在單不飽和脂肪酸(花生油)中，迷迭香提取液同樣表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。這是由于多不飽和脂肪酸不穩(wěn)定，在加速貯藏過程中極易發(fā)生氧化變質(zhì)，另外，其自身內(nèi)源性抗氧化成分對(duì)食用植物油的氧化穩(wěn)定性也會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響[23]。由此可見，迷迭香脂溶性抗氧化劑屬于一類具有較強(qiáng)抗氧化性能的物質(zhì)，可進(jìn)行深度開發(fā)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)以食用油為提取劑提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化劑進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定，并采用Schaal烘箱法研究迷迭香脂溶性抗氧化劑與其他不同抗氧化劑對(duì)食用油的油脂抗氧化作用。結(jié)果表明，在樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，迷迭香脂溶性抗氧化劑的Fe3+還原能力、清除DPPH、ABTS、OH自由基能力均隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，綜合比較可知，采用芝麻油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，其對(duì)DPPH、ABTS、OH自由基的IC50值分別為0.032，0.060，0.453 mg/mL；經(jīng)15 d的誘導(dǎo)氧化，迷迭香脂溶性抗氧化劑對(duì)食用油的氧化穩(wěn)定性呈現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用，在多不飽和脂肪酸油中的抗氧化效果更明顯，顯著優(yōu)于化學(xué)合成抗氧化劑，且其與Vc的二元復(fù)配效果更佳。經(jīng)初步判斷，采用食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化劑可有效延緩食用油腐敗變質(zhì)并延長(zhǎng)食用油的保質(zhì)期。