范波 ,王鵬,韓穎,胡金祥,易宇文,3*
(1.成都工業(yè)學(xué)院,成都 610031;2.四川旅游學(xué)院,成都 610100;3.肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610106)
大蒜是百合科蔥屬植物蒜(AlliumsativumL.)鱗莖的統(tǒng)稱。歐洲是大蒜的發(fā)源地,后來在地中海及其附近區(qū)域廣泛種植。張騫通西域?qū)⒋笏?、葡萄、苜蓿等植物引種至中原地區(qū)。大蒜引入后,在我國關(guān)中地區(qū)得到廣泛栽培和傳播,后來遍及全國。大蒜味辛辣、性溫,具有抗氧化[1]、抗癌[2]、消炎殺菌[3]等功效,因而在調(diào)味品、醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛。大蒜良好的保健功能以及在調(diào)味品中的廣泛應(yīng)用主要得益于其含有豐富的含硫化合物。目前國內(nèi)對(duì)大蒜的研究主要集中在藥用[4]、調(diào)味品[5]等領(lǐng)域。近年來也有較多研究人員研究大蒜的揮發(fā)性物質(zhì)[6],但不同產(chǎn)地大蒜風(fēng)味的比較鮮有報(bào)道。大蒜風(fēng)味物質(zhì)的組成及含量受產(chǎn)地、土質(zhì)、雨水、溫度等環(huán)境因素的影響,造成大蒜品質(zhì)的差異。電子舌(electronic tongue,E-tongue)和電子鼻(electronic nose,E-nose)統(tǒng)稱智能感官,是一種模擬人類味覺和嗅覺的仿生儀器,其檢測(cè)結(jié)果具有客觀性,重復(fù)性好,結(jié)合數(shù)據(jù)模型可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化,是研究食品風(fēng)味的有效方法。目前電子舌和電子鼻在調(diào)味品[7]、水產(chǎn)[8]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是氣相色譜技術(shù)(GC)和質(zhì)譜技術(shù)(MS)的統(tǒng)稱。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一種在分子層面鑒定物質(zhì)的技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜有機(jī)物的分離、定性和定量,目前在調(diào)味品[9]、肉類加工[10]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
本文擬利用色差儀、智能感官、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合主成分、數(shù)據(jù)融合、維恩圖等研究方法分析不同產(chǎn)地的大蒜在色差、滋味、氣味維度方面的異同,為大蒜深加工及不同產(chǎn)地的大蒜指紋圖譜的構(gòu)建提供了參考。
1.1.1 樣品與耗材
紫皮大蒜:山東金鄉(xiāng)(A);云南洱源(B);江蘇新沂(C);遼寧鐵嶺(D)。
GC-MS頂空瓶蓋及保護(hù)墊片(均為金屬材質(zhì))、頂空瓶墊(PTFE(210 ℃)/Silicone(120 ℃))、頂空瓶(20 mL):美國PerkinElmer公司;電子鼻頂空瓶(10 mL)、瓶蓋及墊片:ALWSCI公司。
1.1.2 儀器設(shè)備
3nh NR200型色差儀 深圳市三恩馳科技有限公司;Astree型電子舌、FOX 4000型電子鼻 法國Alpha MOS公司;Clarus 680氣相色譜儀、Elite-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、Clarus SQ8T質(zhì)譜儀、HST40帶捕集阱的頂空進(jìn)樣器 美國PerkinElmer公司;SG9200T超聲儀 上海冠特超聲儀器有限公司;其他實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。
目前Alpha MOS公司的Astree型電子舌傳感器分為非專一性傳感器和部分專一性傳感器。實(shí)驗(yàn)采用Alpha MOS電子舌第6套傳感器(該套傳感器為部分專一性傳感器),包括AHS(酸)、PKS、CTS(咸)、NMS(鮮)、CPS、ANS、SCS共7根傳感器,選擇Ag/AgCl作為參比電極。該套傳感器對(duì)酸、咸、鮮具有專一性識(shí)別。通過傳感器獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合Alpha MOS電子舌分析軟件,能夠獲得樣品在0~12之間的酸味、咸味和鮮味的相對(duì)強(qiáng)度值。利用強(qiáng)度值可對(duì)樣品在酸味、咸味和鮮味維度上進(jìn)行滋味強(qiáng)度排序。由于甜味、苦味呈味機(jī)理比較復(fù)雜,該套傳感器無法直接獲得其滋味強(qiáng)度,需結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)現(xiàn)。Alpha MOS公司的FOX 4000型電子鼻由18根金屬氧化物傳感器組成,每根傳感器對(duì)一類或幾類揮發(fā)性物質(zhì)敏感。
3nh NR200型色差儀采用D65光源。D65光源是模擬人在近似太陽光下觀測(cè)到的照明效果,是較為通用的色差檢測(cè)光源。色差檢測(cè)前需進(jìn)行白板校正,以確保測(cè)量的精確性。3nh NR200型色差儀獲得的數(shù)據(jù)包括L*、a*、b*、c*、h*,其代表的具體意義見文獻(xiàn)[11]。每個(gè)樣品檢測(cè)3次,進(jìn)行主成分分析。
1.3.1 電子舌樣品處理及檢測(cè)
取大蒜50 g,用攪拌機(jī)攪碎。準(zhǔn)確稱取30.0 g,放入容量瓶中定容(蒸餾水)至250 mL,放入超聲儀超聲12 min(經(jīng)驗(yàn)值,55 kHz,不加熱)。過濾,取濾液80 mL,放入電子舌檢測(cè)專用燒杯。將A、B、C、D樣品分別放入電子舌自動(dòng)進(jìn)樣器的2,4,6,8位;1,3,5,7位放裝有85 mL的蒸餾水。在檢測(cè)樣品前,先清洗傳感器120 s,然后檢測(cè)120 s。每個(gè)樣品檢測(cè)5次,取后3次在100~120 s之間的穩(wěn)定值作為檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
1.3.2 電子鼻樣品處理及檢測(cè)
取大蒜50 g,用刀剁碎(約0.1 cm3)。準(zhǔn)確稱取1.0 g,裝入頂空瓶中,用電子鼻頂空瓶蓋密封,待測(cè)。將樣品置于50 ℃的保溫設(shè)備中孵化5 min,用進(jìn)樣針抽取500 μL,注入電子鼻檢測(cè)器,進(jìn)樣速度500 μL/s。電子鼻檢測(cè)120 s,檢測(cè)器清潔180 s,取傳感器在120 s時(shí)的穩(wěn)定值作為檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。每個(gè)樣品平行檢測(cè)7次,取后3次穩(wěn)定值作為檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
取大蒜50 g,用刀剁碎(約0.1 cm3)。準(zhǔn)確稱取1.0 g,裝入頂空瓶中,用GC-MS專用頂空瓶蓋(頂空瓶蓋裝配順序:頂空瓶蓋+頂空瓶保護(hù)墊+頂空瓶墊,頂空瓶墊PTFE深色一面朝向樣品)密封,放入自動(dòng)進(jìn)樣器,待測(cè)。
萃取溫度50 ℃,進(jìn)樣針55 ℃,傳輸線60 ℃,萃取20 min;干吹2 min,解吸0.1 min,加壓/釋壓2 min;捕集阱保持4 min;捕集阱循環(huán)次數(shù)2次。
GC條件:載氣(氦氣99.999%)流速1 mL/min,分流比15∶1。進(jìn)樣口溫度:250 ℃;升溫程序:40 ℃,保留2 min,以2 ℃/min升溫至 170 ℃,保留 5 min,以10 ℃/min升溫至 250 ℃,保留1 min。
MS條件:EI離子源,電子轟擊能量為70 eV,離子源溫度230 ℃;全掃描;質(zhì)量掃描范圍:45~450 m/z;掃描延遲66 s;標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧文件。
定性分析:揮發(fā)性成分的定性以檢索NIST 2011譜庫,選取正反匹配度均大于700,同時(shí)與文獻(xiàn)值進(jìn)行比對(duì)和結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖進(jìn)行確定。
定量分析:峰面積歸一化法,計(jì)算相對(duì)百分含量。
數(shù)據(jù)分析及制圖采用Origin 2018軟件。
4個(gè)樣品色差主成分分析結(jié)果見圖1。
由圖1可知,PC1+PC2為91.87%,說明在進(jìn)行線性變換時(shí),色差的主要信息被有效保留,能夠反映樣品的主要色差信息。圖1中A、B分別分布在Y軸的右、左,說明A、B差異明顯。C、D分布在Y軸上,且互有交叉,說明C、D差異小。
圖1 色差主成分分析Fig.1 Principal component analysis of color difference
2.2.1 電子舌酸、咸、鮮味比較分析
電子舌AHS(酸)、CTS(咸)和NMS(鮮)專一性傳感器檢測(cè)到的樣品酸、咸和鮮味的強(qiáng)度值見圖2。
圖2 電子舌檢測(cè)酸味、咸味、鮮味強(qiáng)度比較Fig.2 Comparison of sourness, saltiness and umami intensity detected by electronic tongue
由圖2可知,B酸味最強(qiáng),其次為C、A,D最弱;D咸味最強(qiáng),其次為A、C,B最弱;C鮮味最強(qiáng),其次為A、B,D最弱。
2.2.2 電子舌、電子鼻及數(shù)據(jù)融合主成分分析
電子舌(a)、電子鼻(b)及電子舌和電子鼻數(shù)據(jù)融合(c)的主成分分析圖見圖3。
圖3中a分析表明,PC1+PC2為85.44%,能夠反映樣品的主要滋味輪廓。有研究表明[12],在電子舌分析中,PC1+PC2大于80%即可反映樣品的整體滋味輪廓。電子舌(a)分析表明,A、B相似度高,C與A、B有一定差異,其差異主要來源于PC2,A、B、C與D差異大,其差異主要來源于PC1。有研究表明[13],如果PC1與PC2差異大,樣品差異主要體現(xiàn)在PC1上,則樣品差異大,相似度低;如果樣品差異體現(xiàn)在PC2上,則差異小,相似度高。圖3中電子鼻(b)分析表明,B、C相似度高,與D有一定相似度,與A差異大;A、D分別分布在Y軸的右、左,差異明顯(差異極大)。食品是滋味和氣味的綜合體,單獨(dú)從滋味或者氣味維度無法說明樣品整體差異性。數(shù)據(jù)融合是將電子舌和電子鼻傳感器獲得的數(shù)據(jù)聯(lián)用分析,從而獲得樣品滋味和氣味的綜合信息。數(shù)據(jù)融合的方法包括原始數(shù)據(jù)直接融合法、特征值提取后聯(lián)用法和分別建模后重組有效信息法。本文采用原始數(shù)據(jù)直接融合法。圖3中c是電子舌和電子鼻傳感器數(shù)據(jù)融合后主成分分析結(jié)果,可知PC1+PC2為86.50%,能夠反映樣品的總體風(fēng)味輪廓。4個(gè)樣品分布在二維圖的4個(gè)象限,A、D、B、C分別分布在第一、二、三和四象限。說明數(shù)據(jù)融合后,4個(gè)樣品在風(fēng)味上差異明顯。融合后的分析結(jié)果表明,B、C較為相似,差異主要來源于PC2;A、D相似度低,其差異主要來源于PC1;B、A較B、D相似度無法直觀判斷,需進(jìn)一步研究。圖3中c與圖3中a比較,差異大;圖3中c與圖3中b比較,趨勢(shì)基本一致,但具體細(xì)節(jié)有差異,這說明在評(píng)價(jià)大蒜風(fēng)味時(shí),大蒜氣味所占權(quán)重更大,而滋味所占權(quán)重相對(duì)較小。
2.2.3 聚類分析
將電子舌和電子鼻融合后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,其結(jié)果見圖4。
圖4 電子舌和電子鼻數(shù)據(jù)融合聚類分析Fig.4 Data fusion clustering analysis of electronic tongue and electronic nose
由圖4可知,B、C在155.45處聚類,這與數(shù)據(jù)融合主成分分析中B、C相似、一致;B、C與A在170.98處聚類;4個(gè)樣品在322.84處聚為一類,這與數(shù)據(jù)融合主成分分析中A、D相似度低一致。數(shù)據(jù)融合后的聚類分析和主成分分析均表明B、C相似度高。聚類分析還顯示A與B、C有一定相似度,D與A、B、C差異較大。
2.3.1 質(zhì)譜圖比較分析
GC-MS檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)譜圖見圖5。
由圖5可知,樣品A、B、C、D分別得到12,21,18,17種揮發(fā)性物質(zhì)。4個(gè)樣品的主要出峰時(shí)間均集中在2~30 min之間,40 min左右有個(gè)別有效峰出現(xiàn)。
2.3.2 4個(gè)樣品揮發(fā)性物質(zhì)比較。
4個(gè)樣品GC-MS檢測(cè)結(jié)果見表1。
表1 4個(gè)樣品揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 The volatile compounds of the four samples
續(xù) 表
由表1可知,4個(gè)樣品共鑒定出31種揮發(fā)性物質(zhì),其中含硫化合物19種,醛類物質(zhì)6種,其他物質(zhì)6種。A、B、C、D分別檢測(cè)到12,21,18,17種,占總含量的95.679%、95.357%、92.737%、88.893%。A檢測(cè)到含硫化合物11種,其他物質(zhì)1種。B檢測(cè)到含硫化合物13種,醛類物質(zhì)6種,其他物質(zhì)2種。C檢測(cè)到含硫化合物15種,醛類物質(zhì)2種,其他物質(zhì)1種。D檢測(cè)到含硫化合物13種,醛類物質(zhì)2種,其他物質(zhì)2種。含硫化合物是大蒜的主要揮發(fā)性物質(zhì),4個(gè)樣品的含硫化合物含量分別為95.045%、93.866%、92.209%、87.346%。
樣品A(山東)、B(云南)、C(江蘇)、D(遼寧)中含量最高的物質(zhì)均為二烯丙基二硫醚,其含量分別為46.597%、49.034%、50.503%和31.986%。二烯丙基二硫醚是不同產(chǎn)地大蒜的主要揮發(fā)性物質(zhì)。二烯丙基二硫醚具有生蒜的辛辣味,它是大蒜素受熱降解的產(chǎn)物。大蒜素受熱降解的產(chǎn)物主要包括二烯丙基二硫醚、二烯丙基硫醚等化合物。二烯丙基二硫醚的生成應(yīng)該與樣品在揮發(fā)性物質(zhì)富集時(shí)受熱有關(guān)。
2.3.3 樣品揮發(fā)性物質(zhì)差異分析
維恩圖分析結(jié)果見圖6。
圖6 樣品揮發(fā)性成分比較維恩圖Fig.6 Venn diagram for comparison of volatile components in samples
維恩圖是一種展示在不同的事物群組(集合)之間的“大致關(guān)系”的方法,它常常被用來幫助推導(dǎo)關(guān)于集合運(yùn)算的一些規(guī)律。由圖6可知,4個(gè)樣品共有物質(zhì)7種(均為含硫化合物),分別為烯丙基甲基硫醚、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基四硫醚、甲基丙烯基二硫醚、二烯丙基硫醚、二甲基二硫醚。共有物質(zhì)含量分別為80.264%、93.282%、91.357%、85.335%。A樣品特有物質(zhì)2種,為乙酸甲酯、甲硫醇。B樣品特有物質(zhì)6種,為丙醛、丁醛、順式-3-己烯醛、(E)-2-乙基-2-烯醛、1-環(huán)丁烯-1-甲醇、3,4-二甲基-2,5-二氫呋喃,含量均較低。 C樣品特有物質(zhì)3種,為1-丙-1-烯基磺?;?1-烯、甲基異丙基二硫醚、丁酮。D樣品特有物質(zhì)4種,為硫化丙烯、硼烷二甲硫醚、丙酸-2-丙烯酯、氧雜環(huán)丁烷,含量均較低。A、B,A、C,A、D,B、D,A、C、D無共有物質(zhì)。B、C共有物質(zhì)1種,為2,3-二甲基噻吩。C、D共有物質(zhì)1種,為二氧化硫。A、B、C共有物質(zhì)2種,為烯丙硫醇、丙基烯丙基硫醚;A樣品的烯丙硫醇(11.389%)含量高。B、C、D共有物質(zhì)4種,為二甲基三硫、3,4-二甲基噻吩、(E)-丁-2-烯醛、2-甲基丁醛。B、C、D共有物質(zhì)種類較多。A、B、D共有物質(zhì)1種,為甲基丙基二硫醚。
完整大蒜并不具有強(qiáng)烈的刺激性氣味。大蒜刺激性氣味的產(chǎn)生,是大蒜組織受到破壞時(shí),大蒜中蒜氨酸受蒜氨酸酶作用而生成了次磺酸、大蒜素等物質(zhì)。而大蒜素是一種高度不穩(wěn)定的化合物,會(huì)分解成硫醚類化合物(這些物質(zhì)大多數(shù)是硫代亞磺酸酯的衍生物),如二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基硫醚、二氧化硫等物質(zhì)[14-15]。二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基四硫醚是大蒜中最常見的4種特征硫化物[16]。
二烯丙基二硫醚在4個(gè)樣品中均為含量最高的物質(zhì),它是大蒜素降解的最主要化合物[17]。其含量分別為46.597%、49.034%、50.503%、31.986%。二烯丙基二硫醚屬于鏈狀含硫化合物,閾值低(4.3 μg/kg),具有強(qiáng)烈的洋蔥、芥末、大蒜香味,可用于多種食品的調(diào)香,是大蒜香精的主要成分;它們的存在對(duì)大蒜香味的形成貢獻(xiàn)大。有研究表明[18],二烯丙基二硫醚是新鮮大蒜的主要香氣物質(zhì)。比較而言,A、B、C中二烯丙基二硫醚含量比較接近;而D(遼寧)樣品的二烯丙基二硫醚含量較低,這可能與遼寧的地理環(huán)境等因素有關(guān)。
烯丙基甲基二硫醚在4個(gè)樣品中的含量分別為12.158%、18.393%、15.112%、14.407%,含量較高。烯丙基甲基二硫醚是大蒜的活性物質(zhì)之一,它也是甲基丙烯基二硫醚的同分異構(gòu)體[19]。劉建[20]的研究表明,山東金鄉(xiāng)大蒜中烯丙基甲基二硫醚含量占總含量的10%左右,這與本文的研究結(jié)果基本一致。烯丙基甲基二硫醚具有韭菜味和蒜香味。其香氣閾值為6.3 μg/L,對(duì)大蒜風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大。
二烯丙基硫醚在4個(gè)樣品中的含量分別為9.877%、3.739%、6.076%、6.934%。二烯丙基硫醚屬于鏈狀含硫化合物,具有強(qiáng)烈的洋蔥、大蒜和芥末香氣,它的形成可能是大蒜中含硫化合物發(fā)生了不穩(wěn)定的C-S鍵均裂,形成了丙烯基自由基和烷硫基,這些物質(zhì)與其他小分子揮發(fā)性物質(zhì)形成了二烯丙基硫化物。A(山東)樣品中的二烯丙基硫醚含量最高,B(云南)樣品含量最低,C(江蘇)、D(遼寧)含量相當(dāng)。
烯丙基甲基硫醚是一種具有蒜臭味的鏈狀含硫化合物,在4個(gè)樣品中含量分別為6.310%、2.521%、2.478%、4.299%。A(山東)樣品含量較高,其次為D(遼寧),B(云南)、C(江蘇)含量較低,且含量相當(dāng)。
二甲基二硫醚的含量是4個(gè)樣品中共有物質(zhì)相對(duì)較低的物質(zhì),其含量分別為4.044%、2.952%、1.376%、1.899%。二甲基二硫醚的香氣閾值為68 μg/L,考慮其含量,其對(duì)大蒜風(fēng)味的形成可能有一定貢獻(xiàn)。
二烯丙基四硫醚在4個(gè)樣品中的含量差異較大,其中A(山東)樣品含量最低(0.909%)。D(遼寧)樣品含量最高(21.087%),這與劉建的研究結(jié)論一致。B(云南)、C(江蘇)樣品中的二烯丙基四硫醚含量相當(dāng),均在13%左右。
甲基丙烯基二硫醚是烯丙基甲基二硫醚的同分異構(gòu)體,在不同產(chǎn)地的樣品中差異較大。A(山東)樣品含量低(0.369%),D(遼寧)樣品含量高(4.723%),B(云南)、C(江蘇)樣品中含量相當(dāng)。
總體來看,B(云南)、C(江蘇)共有物質(zhì)總體含量相當(dāng)(93.282%、91.357%),而A(山東)、D(遼寧)共有物質(zhì)含量差異較大。
為探究A(山東)、B(云南)、C(江蘇)、D(遼寧)產(chǎn)地大蒜品質(zhì)的差異,實(shí)驗(yàn)采用色差儀、電子舌、電子鼻、氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合主成分及數(shù)據(jù)融合、維恩圖分析不同產(chǎn)地的大蒜在色差、滋味、氣味、整體風(fēng)味輪廓以及具體風(fēng)味物質(zhì)方面的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,色差分析顯示A、B色差明顯,C、D差異較小。電子舌滋味強(qiáng)度分析表明B酸味最強(qiáng),其次為C、A,最弱的為D;D咸味最強(qiáng),其次為A、C,最弱的為B;C鮮味最強(qiáng),其次為A、B,最弱的為D。電子舌主成分分析表明A、B較為相似,與C有一定差異,與D差異大。電子鼻主成分分析表明B、C較為相似,與D有一定相似度,與A差異明顯。電子舌和電子鼻傳感器數(shù)據(jù)融合主成分分析表明B、C較為相似;數(shù)據(jù)融合主成分分析還表明在評(píng)價(jià)大蒜風(fēng)味時(shí),大蒜氣味所占權(quán)重更大,而滋味權(quán)重較?。粩?shù)據(jù)融合聚類分析結(jié)果與數(shù)據(jù)融合主成分分析結(jié)果基本一致,同時(shí)能夠進(jìn)一步說明A與B、C較D與B、C相似度更高。GC-MS分析結(jié)果表明4個(gè)樣品共檢測(cè)到31種揮發(fā)性物質(zhì),A、B、C、D分別檢測(cè)到12,21,18,17種,占總含量的95.679%、95.357%、92.737%、88.893%。維恩圖分析表明不同產(chǎn)地的大蒜共有物質(zhì)7種,均為含硫化合物。含硫化合物是不同產(chǎn)地大蒜的主要揮發(fā)性物質(zhì),分別占總含量的95.045%、93.866%、92.209%、87.346%;二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚是大蒜最主要的揮發(fā)性物質(zhì)。含硫化合物的種類和含量可能是不同產(chǎn)地大蒜的主要區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)不同產(chǎn)地大蒜的鑒別及指紋圖譜的構(gòu)建具有積極的參考價(jià)值。