張 琛，李佳麗，靳榮帥，白少成，姚 凡，趙博昊，陳 陽(yáng)，吳信生

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

【研究意義】毛囊是哺乳動(dòng)物特有的皮膚組織，毛囊發(fā)育存在周期性并具備自我再生能力。動(dòng)物的整體毛發(fā)發(fā)育與毛囊呈正相關(guān)[1]。目前，已有不少影響哺乳動(dòng)物家兔毛囊發(fā)育的基因因子被鑒定[2]，如表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、成纖維生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Factor, FGF)、角蛋白(Keratin)和角蛋白相關(guān)蛋白(Keratin Association Protein, KAPs)、類胰島素生長(zhǎng)因子(Insulion-Like Growth Factor, IGF)等。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)參與毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，BMP 信號(hào)通路在動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]?！厩叭说难芯窟M(jìn)展】骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4)隸屬于BMPs家族，其作用是抑制毛囊發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控毛囊形狀、大小和位置[4]。Shh和FGF4促進(jìn)BMP4的表達(dá)，但是BMP4會(huì)抑制毛囊發(fā)育，進(jìn)而阻礙FGF4和Shh的表達(dá)[5]。毛乳頭細(xì)胞(Dermal papilla cells, DPCs)是真皮源性細(xì)胞，是毛囊生長(zhǎng)、分化的必要信號(hào)因子，位于毛囊的基底部[6]，在毛囊周期變化過(guò)程中起著重要的作用[7]。【本研究切入點(diǎn)】毛乳頭細(xì)胞作為毛囊發(fā)育的信號(hào)中心，本文通過(guò)構(gòu)建BMP4基因過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至家兔毛乳頭細(xì)胞中，檢測(cè)其對(duì)下游相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而驗(yàn)證BMP4基因?qū)ο掠位虻恼{(diào)控作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為進(jìn)一步研究BMP4對(duì)兔毛乳頭細(xì)胞的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 家兔毛乳細(xì)胞的分離與鑒定

首先進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞的分離，用眼科剪將獺兔兩邊的觸須垂直與皮膚剪下，放入裝有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中進(jìn)行清洗；70%酒精浸泡1 min，用添加雙抗的PBS沖洗，除去不規(guī)則組織。將采集的樣品進(jìn)行裁剪，裁剪成長(zhǎng)條狀組織塊，并放置于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿里，緩慢加入0.25%中性蛋白酶，直至浸沒(méi)組織塊，4 ℃孵育16～24 h，移除蛋白酶液。在新培養(yǎng)皿中，用精細(xì)鑷和眼科剪分離毛囊，轉(zhuǎn)移到10 mm × 35 mm培養(yǎng)皿中。顯微鏡下用手術(shù)刀將毛球部分離，清除周圍其他組織。將分離的單個(gè)毛囊放入35 mm培養(yǎng)皿中，加入膠原酶2 mL，37 ℃孵育5～6 h，也可4 ℃過(guò)夜消化[8]。

細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶70%～80%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。設(shè)置pcDNA3.1空載組和pcDNA3.1-BMP4過(guò)表達(dá)組，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)10 h后進(jìn)行換液處理，48 h后收細(xì)胞。

1.2 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑和器材如表1～表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)所用的主要器材Table 2 Main equipment used in the experiment

1.3 兔BMP4基因CDS序列的擴(kuò)增與克隆

NCBI上查找兔BMP4基因序列(NP_001182652.1)。查找pcDNA3.1載體上的酶切位點(diǎn)。一步克隆軟件(CE Design V1.04)設(shè)計(jì)BMP4特異性擴(kuò)增引物。BMP4基因上游引物為：5′-tagtccagtgtggtggaattcATGATTCCTGGTAACCGAATGC-3′；下游為：5′-ggtttaaacgggccctctagaTCAGCGGCACCCAC ACCC-3′。

使用總RNA提取試劑盒提取兔皮膚組織RNA，再通過(guò)核酸蛋白分析儀對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為下一步高保真酶PCR擴(kuò)增的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：50 μL，上游引物和下游引物各2 μL、2 × Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、模版1 μL、ddH2O 18 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，65.5 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 BMP4生物信息學(xué)分析

ProtParam用于預(yù)測(cè)BMP4編碼蛋白的等電點(diǎn)、分子式、分子量和不穩(wěn)定性系數(shù)(http://web.expasy.org/protparam/)[9]。信號(hào)肽預(yù)測(cè)用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)[10]。分析分泌蛋白、定位信號(hào)和蛋白跨膜區(qū)域用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[11]。潛在的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[12]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)用Hopfield(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)[13]。推測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守域和三維同源性用SWISS-MODEL[14]。

1.5 BMP4過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將BMP4擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒用EcoI和XbaI快切酶進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中并均勻涂抹至含有氨芐青霉素的LB瓊脂板上，在37 ℃條件下，培養(yǎng)12 h。然后進(jìn)行選擇單菌落PCR，陽(yáng)性克隆液送擎科生物科技有限公司測(cè)序，用SeqBuilder軟件進(jìn)行序列分析。使用測(cè)序正確的克隆菌液提取質(zhì)粒備用。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

兔毛乳頭細(xì)胞在24孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞分別接種于4個(gè)96孔板內(nèi)以檢測(cè)0、24、48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖狀況。待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基。在每孔內(nèi)分別加入10 μL CCK-8溶劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度OD450值，記為0 h。以后每24 h用同樣的方法測(cè)量1次，共4次。

1.7 熒光定量PCR

提取兔毛乳頭細(xì)胞中的RNA。細(xì)胞在24孔板底部長(zhǎng)至95%，收集細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA。將提取的RNA進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)BMP4、ID1、ID2、SMAD7、FGF1、TGF-β基因引物。具體引物信息如表2所示(其中GAPDH為內(nèi)參基因)。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.8 數(shù)據(jù)分析

SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，方法為成對(duì)T檢驗(yàn)，采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，每組3個(gè)重復(fù)。*P<0.01為差異極顯著，**P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔毛乳頭細(xì)胞的鑒定

兔毛乳頭細(xì)胞分離培養(yǎng)后，用標(biāo)志性基因α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和波形蛋白(VIM)進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。特異性標(biāo)記物α-SMA及毛囊真皮源性細(xì)胞標(biāo)記物VIM均呈現(xiàn)綠色熒光，為陽(yáng)性表達(dá)，DAPI核染定位顯示，細(xì)胞核中有藍(lán)色熒光(圖1)。

圖1 兔毛乳頭細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定Fig.1 Identification of rabbit hair papilla cells by immunofluorescence staining

2.2 BMP4基因的克隆

對(duì)兔BMP4基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得與預(yù)期片段大小一致的明亮條帶，長(zhǎng)度為1230 bp(圖2-A)。菌液PCR的電泳分析(圖2-B)顯示，在目的基因處可見(jiàn)明亮條帶。

M.DL 5000 DNA 分子標(biāo)記。A.BMP4基因擴(kuò)增結(jié)果；1，2，3為目的基因BMP4基因條帶。B.BMP4基因菌液PCR結(jié)果；1，2，3，4，5，6為目的基因BMP4基因條帶M.DL 5000 DNA marker.A.BMP4 gene amplification results；1, 2 and 3 were both BMP4 gene bands of the target gene.B.PCR results of BMP4 gene bacterial；1,2,3,4,5,6 were the bands of the target gene BMP4圖2 BMP4基因克隆Fig.2 Cloning of BMP4 genesolution

2.3 BMP4基因生物信息學(xué)分析

兔BMP4基因CDS區(qū)序列全長(zhǎng)1230 bp，編碼409個(gè)氨基酸，2個(gè)外顯子，BLAST分析表明該序列與NCBI發(fā)布的序列(NP_001182652.1)完全一致，并位于第17號(hào)染色體上。BMP4蛋白的分子量為46 511.76，分子式為C2043H3205N623O592S17，pI理論值為8.73，帶正電荷的殘基總數(shù)為51，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為46，表明該蛋白整體上帶正電荷。親水性的總體平均值為-0.571，預(yù)計(jì)不穩(wěn)定性指數(shù)(II)為59.56，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族指數(shù)為77.46。具有穩(wěn)定的信號(hào)肽(圖3-A)，切割位點(diǎn)最高為0.554，位于第25個(gè)氨基酸殘基，而位于第16個(gè)氨基酸殘基處信號(hào)肽區(qū)域的最高值為0.953；信號(hào)肽得分(第1至24個(gè)氨基酸殘基)為0.872。不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞質(zhì)中N末端的總概率為0.10364(圖3-B)。

BMP4蛋白的11個(gè)絲氨酸、3個(gè)蘇氨酸和3個(gè)酪氨酸具有假定的磷酸化位點(diǎn)。在編碼的409個(gè)氨基酸中，有128個(gè)氨基酸(31.30%)形成了α-螺旋，76個(gè)氨基酸(18.58%)形成了一條延伸鏈，而205個(gè)氨基酸(50.12%)形成一個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(圖3-C)。預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)如3-D所示。

2.4 BMP4基因過(guò)表達(dá)對(duì)毛囊發(fā)育相關(guān)基因的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BMP4基因后其mRNA水平顯著提高(P<0.01，圖4-A)。

A.過(guò)表達(dá)后的BMP4 mRNA表達(dá)水平;B.下游基因表達(dá)水平A.mRNA expression level after overexpression;B.Downstream gene expression level圖4 BMP4過(guò)表達(dá)對(duì)相關(guān)基因的影響Fig.4 Effects of BMP4 overexpression on related genes

BMP4基因過(guò)表達(dá)后，其下游基因ID1、SMAD7和ID2的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)GF1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05，圖4-B)。

2.5 過(guò)表達(dá)BMP4會(huì)抑制細(xì)胞增值

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相比對(duì)照組pcDNA3.1，過(guò)表達(dá)BMP4組細(xì)胞增值能力逐漸減弱，在72 h時(shí)差異極顯著(P<0.01，圖5)。

圖5 過(guò)表達(dá)BMP4基因?qū)?xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of overexpression of BMP4 gene on cell proliferation

3 討 論

毛囊是哺乳動(dòng)物具有周期性再生功能的皮膚附屬器官，毛囊的結(jié)構(gòu)和性狀會(huì)影響毛用動(dòng)物的被毛質(zhì)量以及品質(zhì)。毛乳頭細(xì)胞是毛囊中重要的真皮成分，產(chǎn)生多種針對(duì)上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而形成毛囊[15]。在裸鼠中，將毛乳頭細(xì)胞與表皮細(xì)胞一起移植會(huì)誘導(dǎo)毛囊產(chǎn)生。當(dāng)毛乳頭細(xì)胞與毛囊上皮一起培養(yǎng)時(shí)，會(huì)促進(jìn)毛囊上皮的生長(zhǎng)[16]。

毛乳頭細(xì)胞與毛囊其他真皮細(xì)胞不同，毛乳頭細(xì)胞能表達(dá)特定的基因及蛋白[17]。α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，一種已知的毛乳頭細(xì)胞標(biāo)記物[18]。波形蛋白(VIM)是毛囊真皮源性細(xì)胞標(biāo)記物，用來(lái)鑒別真皮源性細(xì)胞與表皮源性細(xì)胞[19]。有研究采用中性蛋白酶與膠原酶兩步消化法及預(yù)鋪設(shè)鼠尾膠原促貼壁基質(zhì)相結(jié)合，檢測(cè)到α-SMA和VIM的表達(dá)，成功分離并純化家兔毛乳頭細(xì)胞[20]。有研究采用一步酶消化法對(duì)胎兒頭皮毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行分離，并使用雌二醇處理原代毛乳頭細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)雌二醇顯著調(diào)節(jié)人毛乳頭細(xì)胞生物鐘基因的表達(dá)水平[21]。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果顯示分離出的細(xì)胞表達(dá)α-SMA和VIM，表明分離的細(xì)胞為毛乳頭細(xì)胞。

BMP信號(hào)通路在皮膚的發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用[22-23]。BMP信號(hào)可以通過(guò)抑制皮膚形態(tài)發(fā)生過(guò)程中毛囊分化促進(jìn)表皮發(fā)育[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚受損愈合過(guò)程中，BMP4的表達(dá)受到抑制[26]。通過(guò)對(duì)鵝BMP4基因的部分進(jìn)行擴(kuò)增，并與其他動(dòng)物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BMP4基因可能是影響毛發(fā)形態(tài)的因素之一[27]。BMP4不僅會(huì)影響動(dòng)物的毛發(fā)形態(tài)，并且在毛囊和羽毛發(fā)生發(fā)育過(guò)程中有表達(dá)且主要起負(fù)調(diào)控作用[28]。BMP4基因在絨山羊毛囊發(fā)育過(guò)程中，退行期時(shí)表達(dá)量最高，并且隨著毛囊周期發(fā)育逐漸降低[29]。本研究通過(guò)對(duì)敲除和過(guò)表達(dá)BMP4基因細(xì)胞增殖情況進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BMP4基因會(huì)抑制毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究表明，F(xiàn)GF-1通過(guò)誘導(dǎo)毛囊生長(zhǎng)期毛囊數(shù)量和大小增長(zhǎng)，促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)[30]。本研究中，BMP4過(guò)表達(dá)對(duì)FGF-1有抑制作用，與BMP4在其他物種上的已知功能一致。Id基因家族中，ID1、ID2和ID3是典型BMP信號(hào)通路中磷酸SMADS的直接靶標(biāo)，對(duì)BMP刺激高度敏感[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在毛乳頭細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BMP4導(dǎo)致ID1、ID2、SAMD7的mRNA表達(dá)水平顯著升高，與已有研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

BMP4共編碼409個(gè)氨基酸，為親水性外分泌蛋白，含有1個(gè)信號(hào)肽序列，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。過(guò)表達(dá)BMP4可調(diào)控兔毛乳頭細(xì)胞中ID1、ID2、SMAD7的mRNA表達(dá)，抑制毛乳頭細(xì)胞增殖，參與家兔毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育。