錢 榮，續(xù)曉琪，許宗奇，徐 虹，李 莎，徐 錚，羅正山

（南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211816）

沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌作為常見的食源性致病菌，危害著公共食品安全[1]，尋找安全有效的抗菌物質(zhì)刻不容緩。脂肽作為一種來源于微生物的表面活性劑，具有抗菌、抗病毒等多種功效[2]。與傳統(tǒng)抗生素不同，抗菌脂肽具有易降解、熱穩(wěn)定性高、不易形成耐藥性、綠色安全等優(yōu)勢[3]。高曉平等[4]研究表明，表面活性素具有抑制乳中大腸埃希菌O157 的功效，延長乳的保質(zhì)期。具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌脂肽防腐劑可以抑制其本身對(duì)蛋白酶的敏感性，同時(shí)抑制病原菌如黃曲霉等生長繁殖[5]，有效控制食品中有害微生物的滋生，具有一定食品防腐保鮮功能[6]。

自然界中酵母菌、真菌、細(xì)菌等多種微生物都可以產(chǎn)生脂肽，目前已發(fā)現(xiàn)的主要有隱桿菌屬、類芽孢桿菌屬、梭菌屬、游動(dòng)放線菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、鐮孢霉屬、鏈霉菌屬、節(jié)桿菌屬、分支桿菌屬、短桿菌屬和解硫胺素芽孢桿菌屬[7?13]等，包含陸地和海洋微生物?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）能產(chǎn)生多種抗菌脂肽[14]，主要包括伊枯草菌素（Iturin）、芬薺素（Fengycin）和表面活性素（Surfactin）三大家族；其中Iturin 和Fengycin 相比于其他抗菌脂肽，有較強(qiáng)的抗菌活性；而Surfactin 在抑制病毒、支原體等方面有較好的效果[15?18]。這些抗菌脂肽大多可以通過發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)[19]。目前，喻鋼等[20]建立了基于制備型反相色譜柱分離純化枯草芽孢桿菌細(xì)菌素類抗菌活性物質(zhì)方法。抗菌脂肽的分離純化主要通過電荷差異、疏水性質(zhì)以及分子量不同實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)去除，從而達(dá)到純化的目的[21]。

抗菌脂肽作為一種天然的抗菌成分，目前仍面臨產(chǎn)率低、成本高等問題[22]，在食品、醫(yī)療的應(yīng)用缺少進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)自主篩選得到一株枯草芽孢桿菌KC-WQ 作為出發(fā)菌株，考察其胞外發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌特性，分離其中的抗菌脂肽并解析其結(jié)構(gòu)，通過耐高溫測試評(píng)價(jià)其用于食品加工[23]的潛力。最后優(yōu)化發(fā)酵條件，建立響應(yīng)面預(yù)測模型，旨在提高產(chǎn)量，并為生產(chǎn)流程、實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌KC-WQ 從發(fā)酵豆粕中分離得到，經(jīng)16S 鑒定后保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO：M 2021799）；BL21 大腸桿菌（Escherichia coliBL21）、鼠傷寒沙門氏菌TA97a（SalmonellaTA97a）和嗜水氣單胞菌ATCC35654（Aeromonas hydrophilaATCC35654）均由南京工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；三氯甲烷 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；甲醇 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；鹽酸 永華化學(xué)科技有限公司；Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司；LB 液體培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

D-78532 隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UNIVERSAL320（R）離心機(jī) 德祥科技有限公司；BKQ-B100II 高壓蒸汽滅菌鍋 賽鍶鈦氪貿(mào)易有限公司；ZQZY-88CN 振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；DH100-2 干式恒溫器 杭州瑞誠儀器有限公司；S210 pH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；752S 紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化和培養(yǎng) 將枯草芽孢桿菌KC-WQ接種于LB 液體培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 作為種子液，將種子液以3%濃度接種在Landy改良培養(yǎng)基[19]內(nèi)，37 ℃、200 r/min 條件下發(fā)酵48 h。Landy 改進(jìn)培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，谷氨酸鈉5.0 g，酵母提取物1.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eSO40.15 mg，MnSO40.5 mg，CuSO40.16 mg，蒸餾水定容至1.0 L。

1.2.2 牛津杯抑菌圈實(shí)驗(yàn) 取出提前制備的平板，劃分區(qū)域，將50 μL 活化接種量為1.5%的沙門氏菌作為指示菌液滴加于PDA 平板上，用一次性涂布棒涂布均勻。取出滅菌后的牛津杯放置在平板四個(gè)區(qū)域，設(shè)置只添加100 μL LB 培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，其余三個(gè)牛津杯中分別滴加除去菌體的KC-WQ 發(fā)酵液，加樣體積依次為50、100、150 μL。隨后平板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h 后，觀察并測量抑菌圈大小，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.3 抗菌脂肽的制備 在滅完菌的Landy 培養(yǎng)基里按照3%接種量接種，200 r/min，37 ℃發(fā)酵48 h，發(fā)酵液8000 r/min，4 ℃離心10 min，取上層清夜備用。用6 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上層清液pH 至4.0，4 ℃、12 h過夜沉淀，8000 r/min，4 ℃離心10 min。離心棄去上層清液，收集沉淀，將得到的沉淀加入過量甲醇溶解。將溶解后的液體過有機(jī)膜抽濾除去雜質(zhì)，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到甲醇粗提液。將粗提液用65 ℃烘箱烘干，收集黃色沉淀，即為抗菌脂肽粗提物[22]。

1.2.4 粗提物成分和結(jié)構(gòu)分析

1.2.4.1 TLC 薄層色譜分析 稱取脂肽粗提物50 mg，溶于1500 μL 甲醇作為待測樣品溶液。取一塊硅膠薄層板，在距離一邊1 cm 處用鉛筆畫線，作為樣品起始點(diǎn)，設(shè)置A、B 兩組平行實(shí)驗(yàn)。按照薄層色譜法，使用毛細(xì)管蘸取溶液，分別點(diǎn)于兩點(diǎn)上，每次10 μL，點(diǎn)樣5 次，每次點(diǎn)完用吹風(fēng)機(jī)吹干，備用。配置展開劑為甲醇:三氯甲烷:水=25:65:4。將展開劑、薄層板放入展缸中展開、揮干，觀察在紫外燈下的條帶。

1.2.4.2 高效液相色譜分析 本部分采用安捷倫1260 高效液相色譜儀和ZORBAX Eclipse XDBC18 色譜柱（5 μm，150 mm×4.6 mm）進(jìn)行分析，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品均溶于20%乙腈水溶液，流動(dòng)相A 為乙腈（含0.1% 三氟乙酸），流動(dòng)相B 為超純水（含0.1%三氟乙酸），流動(dòng)相比例A:B 為8:2，流速為1 mL/min，檢測波長為214 nm，樣品濃度為5 mg/mL，進(jìn)樣體積為60 μL。

1.2.4.3 MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜分析 質(zhì)譜檢測條件：粗提物10 mg 溶于10 mL 甲醇溶劑，正離子檢測，DHB 基質(zhì)。使用UltrafleXtreme MALDI-TOF質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics）在反射正離子模式下進(jìn)行MALDI 儀器質(zhì)譜分析。用智能束激光輻照產(chǎn)生的離子在100～1700 Da 的質(zhì)量范圍內(nèi)獲得了質(zhì)譜，照射頻率為1000 Hz，PIE 為120 ns，透鏡電壓為7 kV。第一離子源電壓為20 kV，第二離子源電壓為17.65 kV。每個(gè)光譜由平均1000 次激光發(fā)射產(chǎn)生，并且激光輻照度被設(shè)置為50%～55%。使用FlexAnalysis 軟件（version：3.3，Bruker）處理質(zhì)譜圖。

1.2.5 耐熱性測定 將用上述方法提取的抗菌脂肽配制成1.0 mg/mL 的溶液，在45、65、85、105 ℃條件下加熱20 min，以未經(jīng)處理的原樣品作為對(duì)照組，以沙門氏菌為指示菌評(píng)價(jià)其抑菌效果，測量抑菌圈直徑，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.6 最小抑菌濃度測定 將由方法1.2.3 提取的抗菌脂肽樣品做濃度遞減稀釋，分別為25、12.2、6.2、3.1、1.6、0.8、0.4 mg/mL，對(duì)沙門氏菌做抑菌試驗(yàn)，以抑菌圈大于10 mm 為依據(jù)確定最小抑菌濃度[21]，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.7.1 碳源優(yōu)化 根據(jù)初始發(fā)酵培養(yǎng)基，以添加2%碳源進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分別選取單一碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和混合碳源（葡萄糖1%+淀粉1%）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，保持其余發(fā)酵條件一致。使用紫外可見分光光度計(jì)測在600 nm 處測定OD 并按照方法1.2.3 所述測定抗菌脂肽粗提物產(chǎn)量，以O(shè)D600和抗菌脂肽粗提物產(chǎn)量作為實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7.2 氮源優(yōu)化 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.25%的不同氮源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取尿素，胰蛋白胨作為氮源，另外設(shè)計(jì)無氮源對(duì)照組同步進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)保持其余發(fā)酵條件一致。評(píng)價(jià)方法同上，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7.3 搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)化 選擇發(fā)酵溫度為37 ℃，pH 為7，裝液量為200 mL，發(fā)酵時(shí)間為48 h，選擇轉(zhuǎn)速分別為150、180、200、250 r/min，其余條件保持一致。評(píng)價(jià)方法同上，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7.4 發(fā)酵溫度優(yōu)化 選擇發(fā)酵pH 為7，裝液量為200 mL，發(fā)酵時(shí)間為48 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min，溫度分別為30、33、35、37 ℃，其余條件保持一致。評(píng)價(jià)方法同上，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7.5 發(fā)酵初始pH 優(yōu)化 選擇發(fā)酵溫度為37 ℃，裝液量為200 mL，發(fā)酵時(shí)間為48 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min，初始pH 為5.0、6.0、7.0、8.0，其余條件保持一致。評(píng)價(jià)方法同上，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)之上，以抗菌脂肽粗產(chǎn)量Y 作為響應(yīng)值，對(duì)初始pH（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、搖床轉(zhuǎn)速（X3）構(gòu)建三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化分析（表1）。

表1 各變量及其高低水平設(shè)計(jì)Table 1 Variables and their high and low level design

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分統(tǒng)計(jì)學(xué)析實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行分析，方差分析（ANOVA）判斷多重平均值的顯著性，顯著性水平P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性驗(yàn)證

如圖1 所示，枯草芽孢桿菌KC-WQ 發(fā)酵液對(duì)三種致病菌增殖具有明顯的抑菌效果。對(duì)比抑菌圈平均值直徑的大小發(fā)現(xiàn)（表2），發(fā)酵液抑菌效果與劑量呈正相關(guān)，相同劑量下的發(fā)酵液對(duì)沙門氏菌的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑最高達(dá)到了（16.50±2.18）mm；對(duì)大腸桿菌和嗜水氣單胞菌也有較好的抑制效果，最大抑菌圈直徑分別為（12.83±2.37）mm 和（15.77±1.57）mm。相比白杰等[21]報(bào)道的枯草B3菌株，KC-WQ 發(fā)酵液抑菌效果更為明顯，因此為進(jìn)一步驗(yàn)證抑菌效果，采用沙門氏菌作為指示菌進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

圖1 枯草芽孢桿菌KC-WQ 胞外發(fā)酵液抑菌圖Fig.1 Antibacterial diagram of extracellular fermentation broth of Bacillus subtilis KC-WQ

表2 枯草芽孢桿菌KC-WQ 抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of Bacillus subtilis KC-WQ

2.2 脂肽粗提物產(chǎn)量及結(jié)構(gòu)分析

將上述枯草菌株發(fā)酵培養(yǎng)，酸沉淀法制得抗菌脂肽，產(chǎn)量為（0.763±0.03）g/L。TCL 法對(duì)脂肽粗提物進(jìn)行初步分析，紫外燈下顯色后在a、b 之間有多段活性成分的顯色印跡（圖2），表明其組分較為復(fù)雜。

2.3 HPLC 結(jié)果分析

對(duì)比KC-WQ 的抗菌脂肽樣品和Surfactin 標(biāo)準(zhǔn)品的液相圖譜出峰時(shí)間（圖3）發(fā)現(xiàn)，該菌株粗提物的保留時(shí)間在9～20 min 之間。抗菌脂肽樣品在9～11 min，13～16 min 和19～21 min 的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，可以證實(shí)該抗菌脂肽中含有Surfactin 的同系物。

圖3 脂肽粗提物與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 保留時(shí)間對(duì)比Fig.3 Comparison of HPLC retention time between crude lipopeptide extract and standard product

表3 結(jié)果顯示，KC-WQ 菌株的脂肽粗提物在HPLC 中的保留時(shí)間范圍為9.977～20.897 min。與Surfactin 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，抗菌脂肽樣品中同樣保留時(shí)間的峰面積占據(jù)整個(gè)出峰面積的46.315%，表明該抗菌脂肽中有近50%的Surfactin 成分，其余脂肽尚無商品化純品做對(duì)照，進(jìn)一步采用MALDI-TOF-MS鑒定分析。

表3 脂肽粗提物樣品HPLC 保留時(shí)間及面積Table 3 HPLC retention time and area of crude lipopeptide extract sample

2.4 MALDI-TOF-MS 分析結(jié)果

進(jìn)一步采用質(zhì)譜分析抗菌脂肽組成，根據(jù)黃君[24]的文獻(xiàn)報(bào)道，采用m/z 對(duì)脂肽進(jìn)行分類。m/z 在1030.4～1059.4 的范圍屬于Iturin 族，在994.4～1036.4屬于Surfactin 族（圖4a），在1449.4～1491.4 為Fengycin 族（圖4b）。由于抗菌脂肽主要由1 個(gè)疏水脂肪烴鏈與7～10 個(gè)氨基酸構(gòu)成的環(huán)肽相連，其結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在脂肪烴鏈的碳原子個(gè)數(shù)[25]，而脂肪烴鏈的長短不同，導(dǎo)致了每增加或減少一個(gè)碳原子，m/z 相差14。本實(shí)驗(yàn)得到的抗菌脂肽的主要成分為C13～C16 Iturin、Iturin 族中的C13～C15 Bacillomycin D、C12～C15 Surfactin 以及少量的C15～C18 Fengycin A（表4）。結(jié)果證明這些粗提物的主要成分是三種抗菌脂肽的混合物，有良好的抑菌表現(xiàn)，同時(shí)該類抗菌脂肽已被證明具有生物安全性[26]，可開發(fā)應(yīng)用于食品加工環(huán)節(jié)中對(duì)有害微生物的控制、防腐保鮮等方面[27]。

表4 MS 結(jié)果分析Table 4 MS result analysis

圖4 脂肽粗提物MALDI-TOF 結(jié)果Fig.4 MALDI-TOF analysis results of crude lipopeptide extract

2.5 抗菌脂肽理化性質(zhì)分析

2.5.1 溫度對(duì)抗菌脂肽的影響 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），枯草KC-WQ 的脂肽粗提物經(jīng)45、65、85、105 ℃處理20 min 后，抑菌效果并未出現(xiàn)明顯變化。抑菌圈直徑隨著溫度的上升略有數(shù)值降低但不顯著（P<0.05），說明該脂肽粗提物中的抑菌成分可耐高溫。這些短鏈多肽具有熱穩(wěn)定性，可進(jìn)行噴干等涉及高溫處理的工藝[28]，具有較好的加工特性。

圖5 抗菌脂肽耐熱效果評(píng)價(jià)Fig.5 Evaluation of the heat resistance of lipopeptides

2.5.2 最小抑菌濃度測定 由表5 可知，該抗菌脂肽在較低濃度時(shí)仍對(duì)沙門氏菌有抑菌效果，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。

表5 不同濃度的KC-WQ 抗菌脂肽對(duì)沙門氏菌的抑菌效果Table 5 Inhibition of different concentrations of KC-WQ crude lipopeptide against Salmonella

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.6.1 碳源優(yōu)化結(jié)果 實(shí)驗(yàn)得到的脂肽粗產(chǎn)物及OD 值如圖6（a）所示。在對(duì)碳源的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和淀粉以1:1，共20 g/L 的濃度時(shí)抗菌脂肽粗產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)最大，同時(shí)在600 nm 波長處的吸光值也是同組實(shí)驗(yàn)最大值。在發(fā)酵過程中，碳源的選擇直接影響到細(xì)菌的繁殖及代謝速率，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵液菌群濃度與其在600 nm 波長處的吸光值成正比[29]，且在吸光度最大時(shí)，抗菌脂肽產(chǎn)量最高。根據(jù)以上結(jié)果，可以選取葡萄糖+淀粉作為最佳碳源。

圖6 碳源（a）、氮源（b）優(yōu)化對(duì)脂肽粗產(chǎn)量及OD600nm 的影響Fig.6 The influence of carbon source （a） and nitrogen source （b） optimization on the crude lipopeptide yield and OD600nm

2.6.2 氮源優(yōu)化結(jié)果 實(shí)驗(yàn)得到的粗產(chǎn)物質(zhì)量及OD值如圖6（b）所示。從結(jié)果中可以看出，添加胰蛋白胨時(shí)該菌的粗產(chǎn)物產(chǎn)量最高，并且發(fā)酵菌液在600 nm的吸光度為最高，由于氮源包含大量菌體在生長代謝過程中所需物質(zhì)，不僅影響菌體繁殖生長，也會(huì)影響后期的抗菌脂肽的產(chǎn)量。胰蛋白胨含有豐富的氮源和氨基酸，促進(jìn)菌體的生長代謝，因此可以作為KCWQ 枯草芽孢桿菌最佳氮源。

2.6.3 搖床發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果 搖床轉(zhuǎn)速是決定發(fā)酵過程中通氣量的關(guān)鍵因素，通氣量對(duì)菌體的氧化分解作用有著顯著的影響。優(yōu)化結(jié)果如圖7a 所示。在轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min 時(shí)，得到的粗產(chǎn)物產(chǎn)量及OD 值均為最大。當(dāng)轉(zhuǎn)速變高或者降低時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物及OD 值減少，枯草芽孢桿菌屬于好氧菌，適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速有利于其增殖和脂肽積累，因此選用200 r/min 的轉(zhuǎn)速作為適宜搖床轉(zhuǎn)速。

初始pH 對(duì)菌體生長有顯著的影響，pH 過高或過低都會(huì)影響發(fā)酵速度和發(fā)酵產(chǎn)量。優(yōu)化結(jié)果如圖7b 所示。當(dāng)pH 為5 時(shí)，脂肽粗產(chǎn)量最低；之后隨pH 的升高，產(chǎn)量上升；當(dāng)環(huán)境呈現(xiàn)略堿性時(shí)（pH8），產(chǎn)量反而下降，但仍高于pH5 時(shí)的產(chǎn)量。因此綜合考慮適宜發(fā)酵初始pH 為7.0 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

溫度是影響菌體發(fā)酵的重要因素，溫度過高會(huì)加快菌體的代謝反應(yīng)速率，縮短生長周期，菌體提前衰老影響發(fā)酵。溫度太低則會(huì)導(dǎo)致氧化還原速率降低，菌體生長周期變長，抗菌脂肽產(chǎn)量下降。優(yōu)化結(jié)果如圖7c 所示。隨著溫度的升高，粗產(chǎn)物產(chǎn)量和OD值穩(wěn)步提高，到達(dá)35 ℃時(shí)達(dá)到頂峰，隨后下降。因此可以選取35 ℃作為發(fā)酵的適宜溫度。

圖7 搖床發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimized results of shaker fermentation conditions

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 軟件建立回歸方程進(jìn)行結(jié)果分析，以抗菌脂肽粗產(chǎn)量Y 值作為響應(yīng)值，得出多元擬合二項(xiàng)式模型，并對(duì)模型的顯著性進(jìn)行評(píng)估，最終預(yù)測出最佳發(fā)酵條件，根據(jù)預(yù)測值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，判斷模型的契合度。

利用Design-Expert 軟件對(duì)表6 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析設(shè)計(jì)，得出脂肽粗產(chǎn)量（Y）對(duì)初始pH（X1）、發(fā)酵溫度（X2）和搖床轉(zhuǎn)速（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

表6 響應(yīng)值試驗(yàn)及結(jié)果Table 6 Response value test and results

從表7 得知，模型的F值為15.15，P值為0.0008，達(dá)到了顯著水平，失擬項(xiàng)為0.0954>0.05，不顯著。發(fā)酵條件X1的P<0.001，說明初始pH 對(duì)發(fā)酵影響非常顯著；X2的P<0.01，說明發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵高度顯著；X3表現(xiàn)出不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.9512>0.9，說明模型的線性關(guān)系顯著，校正決定系數(shù)R2Adj=0.8884，說明模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)契合度較高，因此可以用模型預(yù)測發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽產(chǎn)量的影響。

表7 二次多項(xiàng)回歸模型方差結(jié)果Table 7 Quadratic polynomial regression model variance results

2.7.1 構(gòu)建響應(yīng)面分析結(jié)果 根據(jù)回歸模型并利用Design-Expert 軟件繪制出響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，得到了發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH 三個(gè)因素之間的3D 模型圖，圖8a 反應(yīng)了搖床轉(zhuǎn)速與初始pH 對(duì)脂肽粗產(chǎn)量的交互關(guān)系，圖8b 反應(yīng)了發(fā)酵溫度與初始pH 對(duì)脂肽粗產(chǎn)量的交互關(guān)系，圖8c 反應(yīng)了搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵溫度對(duì)脂肽粗產(chǎn)量的交互關(guān)系。經(jīng)過軟件進(jìn)一步的結(jié)果分析，得出響應(yīng)面分析結(jié)果優(yōu)化后的預(yù)測發(fā)酵條件：初始pH=6.0，發(fā)酵溫度為36 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為208 r/min，預(yù)測產(chǎn)物產(chǎn)量為1.311 g/L。

圖8 脂肽粗產(chǎn)量的響應(yīng)面曲線圖及等高線圖Fig.8 Response surface curve and contour plot of crude lipopeptide yield

2.7.2 回歸模型的驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，對(duì)模型預(yù)測的數(shù)值進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)。為便于實(shí)驗(yàn)的操作性，所有預(yù)測值取整數(shù)，因此取發(fā)酵溫度為36 ℃，初始pH=6.0，搖床轉(zhuǎn)速為208 r/min。設(shè)置三個(gè)平行組，選用優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，最后得到抗菌脂肽粗產(chǎn)量為1.236 g/L，達(dá)到了預(yù)測值的94.28%，數(shù)值較為接近預(yù)測值，說明模型預(yù)測可靠性高，可以較好地反映發(fā)酵條件各個(gè)因素對(duì)產(chǎn)物的影響。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌是一種天然的益生菌，分泌純天然的抗菌脂肽，在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域有著較好的開發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)以篩選到的枯草KC-WQ 為研究對(duì)象，其胞外產(chǎn)物具有抑菌特性，對(duì)腸道類致病菌有著較好的抑菌效果；酸沉淀法獲得抗菌脂肽，結(jié)合TLC、MALDI-TOF-MSL 和HPLC，鑒定其主要成分為Iturin、Bacillomycin D、Surfactin 和Fengycin A。該抑菌脂肽具有較好的耐熱性，對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度為0.8 mg/mL。最后，針對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，設(shè)計(jì)響應(yīng)面和回歸方程，得到最適發(fā)酵條件：初始pH6.0，發(fā)酵溫度為36 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為208 r/min，預(yù)測產(chǎn)量為1.311 g/L，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最后實(shí)際得到的抗菌脂肽產(chǎn)量為1.236 g/L。本研究獲得的枯草芽孢桿菌KC-WQ，其胞外所產(chǎn)抗菌脂肽對(duì)Salmonellaentericasubsp.enterica、Aeromonas hydrophila和Escherichia coli等常見食源性污染菌具有顯著抑菌效果，理化性質(zhì)穩(wěn)定，在食品加工行業(yè)具備應(yīng)用潛質(zhì)。