李 巖, 柳啟航, 黃 葳, 段 濤, 陳朝霞, 何明霞， 熊 宇*

1. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院口腔科， 重慶 400038

2. 天津大學(xué)精密測試技術(shù)及儀器國家重點實驗室， 天津 300072

3. 天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院， 天津 300072

引 言

齲病是一種牙體硬組織在口腔微生物作用下緩慢脫礦并逐漸崩解破壞的疾病， 我國5歲兒童乳牙患齲率為70.9%， 35～44歲成人患齲率高達(dá)89.0%， 65～74歲人群根面齲患病率為39.4%[1]。 齲病進(jìn)展至牙本質(zhì)即為牙本質(zhì)齲， 其進(jìn)展程度及齲損范圍與牙髓感染狀態(tài)及活力密切相關(guān)， 并影響臨床診療決策和實施。 牙本質(zhì)齲的早期診斷及其病損范圍的精確辨識一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點。

目前， 齲病的臨床檢測及診斷仍缺乏可靠、 有效的方法[2]。 國際齲病檢測與評估系統(tǒng)將臨床最常用的視診、 探診作為齲病評估的標(biāo)準(zhǔn)[3]， 但其較為主觀且過于依賴臨床醫(yī)生經(jīng)驗。 常用放射診斷技術(shù)如根尖X線片、 牙合翼片等不僅存在電離輻射危害， 其靈敏度亦較低， 牙體硬組織脫礦常需達(dá)40%以上時才能在X線上確切顯示病變[4]。 光鏡觀察?？删_辨識牙本質(zhì)齲損結(jié)構(gòu)與齲損范圍， 但其只能在離體牙磨片上進(jìn)行， 無法用于臨床診斷。

然而， 上述太赫茲檢測方法仍然存在成像分辨率低， 齲損邊界辨識不清晰等不足， 牙本質(zhì)齲的高分辨率太赫茲成像以確定牙本質(zhì)齲損范圍的研究尚未見報道。

本文評價不同太赫茲成像方法及光譜參數(shù)下的牙本質(zhì)齲損組織圖像及其準(zhǔn)確性， 從而為探索精確、 靈敏且無電離輻射危害的早期牙本質(zhì)齲損臨床檢測技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 太赫茲時域光譜系統(tǒng)

太赫茲時域光譜系統(tǒng)主要為德國Menlo Systems公司生產(chǎn)的太赫茲時域光譜儀TeraSmart， 搭配二維平移載物臺構(gòu)成， 系統(tǒng)原理圖如圖1所示。 飛秒激光在被分光鏡分為兩束光束后， 其中的泵浦光束通過發(fā)射器產(chǎn)生太赫茲光， 探測光束經(jīng)過延遲系統(tǒng)后與透射過樣本或樣本反射的太赫茲光同時到達(dá)探測器， 探測器產(chǎn)生電信號， 經(jīng)放大器和A/D轉(zhuǎn)換處理后， 獲得太赫茲時域光譜信號， 經(jīng)傅里葉變換可轉(zhuǎn)化為樣品的頻域光譜。

圖1 太赫茲時域光譜系統(tǒng)原理示意圖

1.2 樣本制備

隨機(jī)選取因阻生齒齲壞而在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科完整拔除的新鮮第三磨牙15顆， 其中窩溝齲12顆， 平滑面齲3顆， 平均年齡20～35歲。 立刻刮除牙周軟組織， 超聲波潔牙機(jī)清潔后置于去離子水中4 ℃冷藏下備用， 1周內(nèi)使用。 測試以前環(huán)氧樹脂包埋離體牙， 低速齒科技工打磨機(jī)(401A型， 上海齒科器械廠， 上海)流水冷卻下沿牙體長軸縱切成約1 mm薄片， 180， 360， 600， 800， 1 200， 2 000和3 000目水砂紙在流水冷卻下打磨成100～500 μm牙磨片， 游標(biāo)卡尺記錄磨片厚度。 去離子水超聲清洗5 min×3次。

所有的樣本經(jīng)太赫茲平臺及X線影像檢測后， 充分干燥置于載玻片上， 中性樹脂封片后制成光鏡磨片。

1.3 方法

1.3.1 透射模式與反射模式下的太赫茲光譜檢測

記錄太赫茲時域光譜系統(tǒng)空載時的時域信號作為參考信號。 制備好的離體牙磨片置于室溫25 ℃， 濕度35%的環(huán)境下2 h[8]以模擬口腔環(huán)境。 隨后固定于二維平移載物臺， 使太赫茲光束(直徑1.5 mm)聚焦于樣本。 載物支架帶動樣本移動(步徑為0.2 mm)完成掃描探測。

1.3.2 X線影像檢測

牙科X射線機(jī)(西諾德， HellodentPlusD3507德國)對離體牙磨片垂直投照， 得到離體牙磨片X線圖像。 電流7 mA， 電壓60 kV， 曝光時間0.03 s。

1.3.3 掃描式光鏡檢測

使用掃描式光鏡(Magscanner， KF-PRO-005-EX中國)在40×倍率下掃描， 得到牙磨片的數(shù)字化光鏡圖像。

1.4 圖像擬合與齲損面積評價

反射模式下僅能識別樣本大體輪廓， 因此未進(jìn)行圖像擬合與面積計算。 透射模式下， 對樣本光譜信號處理并重構(gòu)生成太赫茲圖像。 將太赫茲圖像與X線圖像、 光鏡圖像擬合， 觀察牙體硬組織形貌特征重疊情況。 由同一名工作3年以上的牙體牙髓病科醫(yī)師， 使用Image J測量太赫茲圖像、 光鏡圖像中的牙本質(zhì)齲損區(qū)域面積， 每個樣本， 每種方法各測量3次取其平均值并記錄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

由于樣本牙本質(zhì)齲損面積波動大， 存在極端值， 本文使用非參數(shù)統(tǒng)計方法。 使用SPSS 23.0軟件對15個樣本太赫茲圖像及光鏡圖像中齲損面積進(jìn)行配對樣本的Wilcoxon符號秩和檢驗， 檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣本的光鏡及X線圖像

圖2A①為樣本的數(shù)字化光鏡圖像， 可見樣本包含健康牙釉質(zhì)、 牙本質(zhì)及牙本質(zhì)齲。 圖2A②為局部牙本質(zhì)齲損圖像， 齲損為“月牙狀”黃棕色深染區(qū)域， 齲損兩側(cè)、 底部可見均質(zhì)、 透明的條帶狀透明層。 藍(lán)色曲線描記牙本質(zhì)齲損范圍， 測得該樣本平均牙本質(zhì)齲損面積為： 10.69 mm2。 體視光鏡是研究牙本質(zhì)齲病理結(jié)構(gòu)的常用手段， 可以明確牙本質(zhì)齲損邊界。 掃描式光鏡可獲得樣本的數(shù)字化圖像， 從而在數(shù)字化圖像中測量、 編輯， 并可以和太赫茲圖像進(jìn)行數(shù)字化擬合。 透明層被認(rèn)為是與健康牙本質(zhì)臨界的齲病最深層， 此層無致齲菌， 臨床去齲時保留完整的透明層有重要的意義， 是臨床去齲的病理止點[9]。

圖3A①為樣本的X線圖像， 可見樣本整體輪廓與光鏡對應(yīng)。 牙合面“月牙”狀密度減低影為牙本質(zhì)齲損。 圖3A②為局部牙本質(zhì)齲損圖像， 可見牙本質(zhì)齲損的低密度影像與健康牙本質(zhì)高密度影像界限較模糊， 不易區(qū)分。

2.2 樣本的反射式太赫茲圖像

圖4A①是利用時域信號最小值對應(yīng)的時間成像， 圖像上牙釉質(zhì)、 牙本質(zhì)及牙本質(zhì)齲未能表現(xiàn)出形態(tài)上的區(qū)分， 僅能顯示出樣本的輪廓， 其對應(yīng)的灰度圖4A②表現(xiàn)出相似的特征。 圖4B①是利用頻域1 THz相位差進(jìn)行成像， 其效果相較于圖4A①而言更佳， 其對應(yīng)的灰度圖4B②牙本質(zhì)齲相對于其他部分顏色要深， 形態(tài)上有一定的區(qū)分度。 圖4C①是利用頻域1 THz功率進(jìn)行成像， 該圖像上僅能顯示出樣本的輪廓， 其對應(yīng)的灰度圖效果相似。

圖2 A①樣本光鏡圖像； A②光鏡下牙本質(zhì)齲損輪廓

圖3 A①樣本X線圖像； A②X線下牙本質(zhì)齲損輪廓

圖4(A—C)是采用90°垂直入射的反射系統(tǒng)獲得的圖像， 僅能呈現(xiàn)樣本輪廓， 不能有效區(qū)分牙釉質(zhì)、 牙本質(zhì)及牙本質(zhì)齲， 這可能與反射信號較弱， 容易受到樣品厚度、 表面平整度[10]以及系統(tǒng)噪聲等影響。

2.3 離體牙磨片的透射式太赫茲圖像

圖5A①是利用時域信號最小值對應(yīng)的時間成像， 可見牙釉質(zhì)區(qū)域為0～60色階染色的深藍(lán)色區(qū)域， 牙本質(zhì)為70～110色階染色的淡藍(lán)色區(qū)域， 牙合面140～170色階染色的綠色、 黃色及橙色區(qū)域為一“月牙”狀區(qū)域。 圖5A②是對應(yīng)灰度圖， 齲損區(qū)域表現(xiàn)為淺灰色染色， 裸眼視覺效果較X線圖像對比度更佳， 對齲損的顯示靈敏度高， 分辨率相對較差。 藍(lán)色曲線為牙本質(zhì)齲損范圍， 測量該樣本牙本質(zhì)齲損平均面積為： 8.11 mm2。

圖5B①是利用頻域1.4THz下相位差進(jìn)行成像， 表現(xiàn)出與圖5A①相似的形態(tài)特征， 齲損區(qū)域是50～110色階染色的淡藍(lán)色區(qū)域。 裸眼視覺效果較圖5A①相似。 圖5B②是對應(yīng)的灰度圖， 齲損區(qū)域顯示為深灰色染色， 裸眼視覺對比度較X線及圖5A①相似， 靈敏度較X線高， 分辨率相對較差。 圖5C①是透射模式頻域1.4 THz的功率成像， 牙釉質(zhì)、 牙本質(zhì)及牙本質(zhì)齲并未表現(xiàn)出形態(tài)上的區(qū)分， 僅能顯示樣本輪廓， 對應(yīng)灰度圖5C②表現(xiàn)出相似的特征。

由于太赫茲的寬帶特性， 使得太赫茲光譜信息十分豐富， 透射模式下可以使用： 電場強度、 飛行時間、 相位差、 折射率及吸收系數(shù)等參數(shù)成像[11]。 本文僅列舉了成像效果較好的三種方式。 其中時域最小值對應(yīng)的時間成像效果最佳。

2.4 樣本的光鏡、 X線及透射式太赫茲圖像擬合及齲損面積評價

圖6為樣本光鏡、 X線及透射式太赫茲成像重疊圖， 可見三種成像方式下樣本形貌特征基本重疊一致， X線與光鏡圖像牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)重疊較好。 太赫茲與光鏡圖像牙本質(zhì)齲損重疊較好。

圖4 A① 反射模式時域最小值對應(yīng)的時間成像； A②： 反射模式時域最小值對應(yīng)的時間成像灰度圖； B① 反射模式頻域1 THz相位差成像； B② 反射模式頻域1 THz相位差成像灰度圖； C① 反射模式頻域1 THz的功率成像； C② 反射模式頻域1 THz的功率成像灰度圖

圖5 A① 透射模式時域最小值對應(yīng)的時間成像； A② 透射模式時域最小值對應(yīng)的時間成像灰度圖； B① 透射模式頻域1.4 THz相位差成像； B② 透射模式頻域1.4 THz相位差成像灰度圖； C① 透射模式頻域1.4 THz的功率成像； C② 透射模式頻域1.4 THz的功率成像灰度圖

圖6 樣本光鏡、 X線及透射式太赫茲成像重疊圖

表1 太赫茲圖像與光鏡圖像中齲損面積(mm2)比較

由于樣本牙本質(zhì)齲損面積波動大， 存在極端值， 本文采用非參數(shù)統(tǒng)計方法。 使用配對樣本W(wǎng)ilcoxon符號秩和檢驗統(tǒng)計方法對15個樣本掃描式光鏡方法下測得的齲損面積與太赫茲時域最小值對應(yīng)的時間圖像中測得的齲損面積進(jìn)行檢驗， 結(jié)果p>0.05， 尚不能拒絕H0， 即尚不能認(rèn)為掃描式光鏡測量牙本質(zhì)齲損面積的方法與太赫茲測量齲損面積的方法有差別。 兩種方法測得的齲損面積差異主要來源于系統(tǒng)誤差。

因此， 認(rèn)為可以使用太赫茲時域最小值對應(yīng)的時間圖像鑒別牙釉質(zhì)、 牙本質(zhì)及牙本質(zhì)齲， 并且能獲得牙本質(zhì)齲損大小和范圍信息， 為指導(dǎo)臨床精確、 微創(chuàng)去齲提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

本研究不足之處在于： (1)本文成像分辨率仍顯不足， 使得齲損部分的識別存在一定誤差。 有研究表明， 近場太赫茲技術(shù)[12]利用近場探針作為信號接收器可實現(xiàn)≤20 μm， 甚至10 nm級別的空間分辨率。 故太赫茲技術(shù)在齲病成像方面仍有巨大潛力； (2)本研究中反射式平臺采用更接近臨床的垂直投照方式且未使用石英窗輔助固定樣本， 故成像效果未達(dá)到預(yù)期， 有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

利用太赫茲光譜成像技術(shù)對離體牙磨片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行二維重構(gòu)， 獲得了不同參數(shù)的太赫茲反射和透射圖像并與光鏡及X線圖像擬合、 對比。 結(jié)果表明透射情況下時域信號最小值對應(yīng)的時間成像在區(qū)分牙釉質(zhì)， 牙本質(zhì)和牙本質(zhì)齲方面具有最佳效果并且與掃描式光鏡圖像重疊一致， 其圖像測得齲損面積與光鏡測得的齲損面積尚不能認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)， 我們認(rèn)為太赫茲時域最小值對應(yīng)的時間圖像可以獲得牙本質(zhì)齲損范圍、 大小等信息為臨床數(shù)字化、 微創(chuàng)去齲提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

太赫茲技術(shù)因為其： (1)無電離輻射； (2)無損可在體檢測； (3)對齲病高靈敏度的特性作為新的齲病輔助檢查手段有巨大應(yīng)用潛力， 但如何獲得三維空間信息及高分辨率數(shù)字化圖像， 仍有待進(jìn)一步研究。