孕婦外周血游離DNA 檢測用于胎兒16－三體篩查的臨床價值*

林穎，李航，周冉，梁棟，王艷，胡平，許爭峰（南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院＆南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004）

孕婦血漿游離DNA（cell-free DNA，cf-DNA）檢測技術用于評估胎兒罹患21－三體綜合征（21－三體）、18－三體和13－三體的風險，并獲得良好的臨床應用效果［1］。目前有學者提出該技術可擴展至其他染色體的篩查，包括罕見三體（除21－三體、18－三體和 13－三體以外的常染色體三體）等［2］。16－三體是cf-DNA 檢出的高頻罕見三體之一，但目前基于cf-DNA檢測的16－三體高風險的報道較少，臨床意義也不明確。因此，本研究回顧性分析了南京市婦幼保健院2017 年至2021 年cf-DNA 檢出結果為16－三體高風險的孕婦，對其產(chǎn)前診斷驗證結果和妊娠結局情況進行回訪，從而評估cf-DNA檢測用于胎兒16－三體篩查的臨床應用價值，以期為該類孕婦的妊娠咨詢和管理提供有價值的信息。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2017年1月至2021年12月于南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進行孕婦血漿cf-DNA檢測的孕婦。將其中cf-DNA 檢測結果為16－三體高風險且有完整回訪結果的孕婦作為研究對象，排除回訪信息不全或失訪的孕婦。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理批號：NFLZ2019-KY-004）。所有孕婦均進行詳細的檢測前咨詢，并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 核酸提取試劑盒、胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒、胎兒染色體非整倍體測序反應試劑盒（武漢華大生物科技公司）。BGIseq-500基因測序儀、SP-300自動化工作站（深圳華大智造科技公司），Qubit 2.0 熒光計（美國賽默飛世爾公司），ABI 9700 PCR 儀（美國 ABI 公司），CytoScan 750K array檢測平臺（美國Afymetrix公司）。

1.3 方法

1.3.1 血漿DNA提取及文庫制備 采集孕婦空腹靜脈血5 mL 于EDTA-K2抗凝的采血管中，8 h 內分離血漿，將分離好的血漿儲存于－80 ℃冰箱備用。采用SP-300 自動化工作站進行血漿DNA 提取及文庫制備，按照核酸提取試劑盒說明書操作，主要步驟包括：末端修復，接頭連接，接頭連接后純化，PCR 反應，PCR反應產(chǎn)物純化，Qubit 熒光定量檢測（文庫濃度＞3 ng／μL為合格）。

1.3.2 高通量測序 將以上合格文庫進行pooling，混勻后進行環(huán)化，環(huán)化后的文庫采用BGIseq-500基因測序儀測序。按照BGIseq-500 基因測序儀及試劑盒說明書進行操作，主要步驟包括：核酸納米球（DNB）制備，Qubit 熒光定量檢測（DNB 濃度≥3 ng／μL為合格），DNB 自動樣本加載系統(tǒng)操作，全自動樣品加載系統(tǒng)上機操作，測序儀清洗，新建測序。測序數(shù)據(jù)通過序列比對獲得每條染色體有效DNA序列條數(shù)，與參考值（hg19，NCBI build 37）進行比較，計算出胎兒患染色體異常的風險。采用BGI HALOS NIFTY項目信息分析系統(tǒng)進行自動化分析，當Z值介于－6～6時判定為16－三體低風險，當Z值＞6時則判定為16－三體高風險。主要質量控制要求，包括有效數(shù)據(jù)量≥3.5 Mb、GC 含量范圍為38%～42%、胎兒濃度≥3.5%。

1.3.3 羊水染色體核型分析和染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA） 取cf-DNA檢測結果為高風險的孕婦進行羊水染色體核型分析和CMA檢測，染色體核型分析采用傳統(tǒng)的G 顯帶法，CMA使用CytoScan 750K array檢測平臺及其配套的染色體分析軟件進行分析。

1.4 妊娠結局回訪及數(shù)據(jù)收集 回訪內容主要依據(jù)《孕婦外周血胎兒游離DNA 產(chǎn)前篩查與診斷技術規(guī)范》［3］，內容包括：胎兒細胞遺傳學結果、流產(chǎn)、引產(chǎn)、早產(chǎn)或足月產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎等情況，在分娩后3個月將通過電話對其妊娠結局進行回訪。孕婦的基本信息、cf-DNA檢測結果和檢測相關參數(shù)從BGI HALOS NIFTY 項目信息分析系統(tǒng)中收集。新生兒出生體重百分位數(shù)根據(jù)《胎兒生長受限專家共識（2019 版）》［4］計算，早產(chǎn)定義為分娩時妊娠孕周＜37周。所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2012軟件計算例數(shù)和比例。

2 結果

2.1 16－三體高風險的檢出情況 共56 247 例孕婦進行了外周血cf-DNA 檢測，檢出16－三體高風險22例，檢出率為 0.04%。22 例16－三體高風險中，孕婦年齡（31.2±4.1）歲，孕周（17.8±2.4）周，其中12 例（54.54%，12／22）為高齡或血清學篩查高風險，cf-DNA 檢出的平均胎兒濃度為（10.0±4.0）%，16 號染色體的平均 Z 值為 14.2±6.2。見表 1。

2.2 16－三體高風險的驗證情況 22 例 16－三體高風險孕婦中，8 例（36.4%，8／22）孕婦進行了羊水單核苷酸多態(tài)性微陣列分析（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）。SNP-array 結果顯示，2 例為 UPD（16），其中 1 例為 arr［hg19］16p 13.3p13.2（94，807-8，418，576）×2hmz，1 例為 arr［hg19］16q22.1q24.3（69，860，932-90，146，366）×2hmz（圖1）；其余6例SNP-array未檢出異常。8例中未發(fā)現(xiàn)胎兒16－三體真陽性，陽性預期值為0。

圖1 羊水單核苷酸多態(tài)性微陣列驗證結果

2.3 16－三體高風險的妊娠結局 22 例 16－三體高風險孕婦的妊娠結局全部隨訪成功，其中4 例（18.2%，4／22）發(fā)生流產(chǎn)或胎兒發(fā)育異常。其余 18例繼續(xù)妊娠的孕婦中，6 例（27.3%，6／22）在孕期患有妊娠期高血壓或重度子癇，11 例（50.0%，11／22）發(fā)生早產(chǎn)，13 例（59.1%，13／22）小于胎齡兒出生，3 例（13.6%，3／22）新生兒健康出生（足月分娩、新生兒無畸形以及新生兒體重正常）。見表1。

表1 22例cf-DNA檢測結果為16－三體高風險孕婦的臨床信息及妊娠結局

3 討論

本研究回顧性分析了2017 年1 月至2021 年12月基于cf-DNA檢出16－三體高風險的情況，證實16－三體高風險的檢出率為0.04%，與Benn等［5］報道類似（66／155 213）。盡管侵入性產(chǎn)前診斷驗證未發(fā)現(xiàn)胎兒16－三體真陽性，但筆者的回訪結果證實，約86.4%的16－三體高風險孕婦會發(fā)生胎兒發(fā)育異常以及流產(chǎn)、早產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥，提示cf-DNA檢出的16－三體高風險與不良妊娠結局有一定的關聯(lián)。

孕婦外周血中cf-DNA主要包括母源性和胎源性的cf-DNA，胎源性的cf-DNA 主要來源于胎盤滋養(yǎng)層細胞，因此，孕婦血漿cf-DNA檢測實際評估的是胎盤染色體非整倍體的風險。限制性胎盤嵌合（confined placental mosaicsm，CPM）是孕婦血漿cf-DNA檢測假陽性的主要原因之一［6-7］。Hartwig等［6］系統(tǒng)地闡述了1997 至2016 年間報道的有關cf-DNA檢測假陽性的文章，共60 例存在生物遺傳學原因分析的假陽性樣本中，19 例（32%）假陽性是 CPM 導致的。Malvestiti等［7］對 1 001 例產(chǎn)前診斷絨毛樣本進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)約87%的樣本是CPM，而罕見三體的 CPM 發(fā)生率則更高，可達97%。因此，盡管本研究中侵入性產(chǎn)前診斷未發(fā)現(xiàn)胎兒 16 －三體真陽性，但這并不能排除存在CPM16。

16－三體高風險孕婦有較高的不良妊娠結局風險。Benn 等［5］統(tǒng)計了近年來基于 cf-DNA 篩查報道的共31例16－三體高風險的妊娠結局，結果顯示64.5%的孕婦存在流產(chǎn)、宮內生長發(fā)育遲緩或真胎兒嵌合體。本研究回訪結果同樣提示cf-DNA檢出的16－三體高風險與不良妊娠結局有一定的關聯(lián)，22例高風險中18.2%（4／22）發(fā)生流產(chǎn)或胎兒發(fā)育異常，27.3%（6／22）在孕期患有妊娠期高血壓或重度子癇，50.0%（11／22）發(fā)生早產(chǎn)，59.1%（13／22）小于胎齡兒出生。因此，對于cf-DNA 篩查檢出的16－三體高風險孕婦建議進行相關的遺傳咨詢和妊娠管理，尤其要密切監(jiān)測胎兒的生長發(fā)育情況和可能的妊娠并發(fā)癥。

16號染色體是容易發(fā)生非整倍體的染色體之一，這也導致了16號染色體UPD 的高發(fā)。研究表明，在絨毛染色體結果為16－三體或16－三體嵌合體時，其中約15%的胎兒羊水染色體為 UPD（16）［7］。本研究納入的 8 例侵入性產(chǎn)前診斷驗證中有2例確診為UPD（16），其中1例為早產(chǎn)且出生體重小于第3百分位數(shù)，另1例為足月出生的健康新生兒。因此，對于cf-DNA 檢測提示16－三體高風險孕婦產(chǎn)前診斷時建議采用SNP-array 進行檢測以排除UPD，而UPD（16）導致印記基因的異常表達是否與胎兒生長發(fā)育遲緩有關尚存在爭議［8］。

綜上所述，cfDNA檢測的16－三體高風險中胎兒真正陽性的可能性很小，CPM是假陽性高的主要原因，因此對于該類孕婦進行產(chǎn)前診斷需慎重。由于16－三體高風險的孕婦比其他三體高風險有更高的不良妊娠結局，因此，有研究者提出16－三體是最值得cfDNA檢測的罕見三體［9］，但由于檢測精度、假陽性率尚不明確，目前國外一些指南并不支持cfDNA檢測擴展至胎兒罕見三體的篩查［10］。故而在cfDNA檢測前需做好檢測前的咨詢，對于需要擴展性篩查結果的孕婦要詳細告知檢測的局限性以及可能的風險。