吳 超, 熊 升, 武憶寒, 林思祖, 陳 宇

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息學(xué)院，福建 福州 350002；3.國家林草局杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.]具有速生、高產(chǎn)、材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，其人工林面積及蓄積量均位列我國用材樹種首位[1]。杉木澀籽屬于一類敗育種子，其外觀、大小、重量、色澤等表型特征與具備正常萌發(fā)能力的健籽極為相似，難以用簡單方法區(qū)分[2]。已有報(bào)道認(rèn)為，類黃酮類代謝物及其下游衍生物單寧類代謝物是澀籽的主要填充物質(zhì)[3-8]。類黃酮類代謝物是2個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過三碳鍵相連的一類代謝物的統(tǒng)稱[9]，廣泛存在于植物各組織器官中，具有影響組織色澤[10-11]、抵抗病原體[12-13]、抗氧化[14-15]、參與信號傳遞[16-17]等功能。類黃酮類代謝物對植物種子發(fā)育的影響主要體現(xiàn)在協(xié)同調(diào)控種胚生長素水平[18-22]、影響胚乳脂質(zhì)代謝[23-24]、調(diào)控microRNA表達(dá)[25-26]等方面，其異常積累可造成種胚敗育[8]。

杉木澀籽中類黃酮類代謝物約占38.3%，是健籽的2倍[7]，其種類超過140種，包括黃酮、黃烷酮、黃酮醇、異黃酮、黃酮碳糖苷、黃酮木脂素、花青素、兒茶素衍生物等多種類型[8]。目前，有關(guān)杉木澀籽發(fā)生過程中類黃酮類代謝物的合成、衍生及變化尚未明確。因此，本研究以澀籽率極高(90%)和極低(24%)的2個(gè)杉木家系種子為研究對象，比較種子發(fā)育過程中類黃酮類代謝物含量、酶活性及調(diào)控基因相對表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化與差異，以探明澀籽形成過程中類黃酮類代謝物的積累特征，為進(jìn)一步揭示杉木澀籽形成機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品取自福建省尤溪國有林場杉木3代種子園。根據(jù)本課題組前期對該種子園不同家系的種檢數(shù)據(jù)，篩選出澀籽率分別為24%(L家系)和90%(H家系)的2個(gè)家系。2019年3月進(jìn)行人工授粉，分別于授粉后70、80、90、100、110 d取樣。各家系隨機(jī)選取大小適中、無明顯病蟲害和機(jī)械損傷、位于樹冠中部同一朝向的球果30枚。清洗球果表面灰塵后迅速置入液氮中速凍15 min，置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室。在干冰上迅速剝出種胚，置入浸于液氮中的無菌離心管，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 類黃酮類代謝物含量 (1)總黃酮與花青素含量采用試劑盒法測定。分別稱取0.1 g種子樣品，充分研磨后加入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，1 000g離心20 min，取上清液。按照ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒說明書處理后測定450 nm處的光密度，以標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品濃度。(2)槲皮素、山奈酚和楊梅素含量采用高效液相色譜法測定。稱取0.5 g樣品置于添加甲醇∶25%鹽酸水溶液=4∶1(體積比)的研缽中，充分研磨成勻漿，經(jīng)80 ℃水浴1.5 h后進(jìn)行超聲提取，10 000g離心10 min，取上清液，過濾后進(jìn)樣檢測。液相色譜檢測條件為：C18色譜柱(4.6 nm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶0.2%磷酸=60∶40；流速0.8 mL·min-1，檢測波長360 nm，柱溫35 ℃。(3)兒茶素和表兒茶素采用高效液相色譜法測定。取0.5 g樣品充分研磨后，按液料比為35∶1(mL∶g)溶于5 mL 60%乙醇溶液中，在50 ℃下回流提取3 h，所得溶液過濾后冷凍干燥。將干燥后的粉末復(fù)溶于5 mL 50%甲醇溶液中，過0.45 μm濾頭后進(jìn)樣檢測。液相色譜檢測條件：A相為體積分?jǐn)?shù)為0.05%的硫酸水溶液，B相為甲醇；流速為0.5 mL·min-1；柱溫30 ℃。

1.2.2 酶活性 采用ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒法檢測查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶、黃烷酮3′羥基化酶、二氫黃酮醇4-還原酶、黃酮醇合成酶、無色花青素還原酶、花青素合成酶和花青素還原酶等8種關(guān)鍵酶活性。按照試劑盒說明書，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程。利用1.2.1中總黃酮含量測定試驗(yàn)所制備的提取液測定452 nm處光密度，并計(jì)算酶活性。

1.2.3 調(diào)控基因相對表達(dá)量 以天根多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取各樣品RNA，測定查爾酮合成酶基因(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮3′羥基化酶基因(F3′H)、二氫黃酮醇4-還原酶基因(DFR)、黃酮醇合成酶基因(FLS)、無色花青素還原酶基因(LAR)、花青素還原酶基因(ANR)等7個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因的相對表達(dá)量。以全式金TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備樣品cDNA，以primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因引物(表1)，并根據(jù)引物序列的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以Trans PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。以全式金TA克隆連接試劑盒進(jìn)行克隆連接，并將連接產(chǎn)物置于Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)。挑選白色單克隆體進(jìn)行PCR陽性克隆鑒定。以EasypureHiPureMaxiPrep Kit質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，全式金2xTransTap High Fidelity PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行熒光定量測定。以EF-1α標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為內(nèi)參，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法建立Rt-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以授粉后70 d時(shí)H家系各基因單位細(xì)胞拷貝數(shù)為參照，做歸一化處理得到各基因的相對表達(dá)水平。

表1 基因引物設(shè)計(jì)

1.3 數(shù)據(jù)處理

以O(shè)rigin V9.64軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理并繪圖；以RStudio軟件進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析；以TBtools的Heatmap功能繪制熱圖[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木澀籽類黃酮合成途徑代謝物含量比較

不同杉木家系種子類黃酮類代謝物含量及其變化趨勢差異明顯(圖1)。由圖1可知，授粉后70～110 d，L家系總黃酮含量變化不大；授粉后90～110 d，2個(gè)家系總黃酮含量差異逐漸擴(kuò)大，至110 d時(shí)H家系總黃酮含量為L家系的2.17倍，且差異達(dá)極顯著水平?；ㄇ嗨?、槲皮素、山奈酚、楊梅素和兒茶素等中間代謝物含量整體上表現(xiàn)為H家系明顯高于L家系。其中，H家系花青素含量隨時(shí)間變化呈上升趨勢，L家系則相反，授粉后70～80 d二者之間差異不顯著，90～110 d則呈極顯著差異，授粉后110 d差異最大，達(dá)6.45倍。H家系槲皮素和山奈酚含量均隨時(shí)間變化呈先下降后上升的趨勢，且授粉后70～90 d顯著或極顯著高于L家系。L家系楊梅素含量呈明顯的下降趨勢，授粉后70 d楊梅素含量高于H家系；隨后H家系楊梅素含量快速上升，至授粉后110 d達(dá)到L家系的7.84倍，差異達(dá)極顯著水平。H家系兒茶素含量呈明顯的上升趨勢，而L家系則先上升后下降，并在授粉后90 d達(dá)到最高值；授粉后70～90 d，2個(gè)家系兒茶素含量差異不顯著；授粉后110 d，H家系兒茶素含量為L家系的2.44倍，差異極顯著。表兒茶素含量表現(xiàn)與上述幾種代謝物相反，授粉后80～110 d，H家系表兒茶素含量極顯著低于L家系。

圖1 不同家系杉木種子類黃酮合成途徑代謝物含量比較

2.2 杉木澀籽類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶活性比較

2個(gè)家系間類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶活性存在差異(圖2)。由圖2可知，授粉后70 d，H家系查爾酮合成酶活性顯著低于L家系，查爾酮異構(gòu)酶和二氫黃酮醇4-還原酶活性則極顯著低于L家系；授粉后80～110 d二者無顯著差異。H家系黃烷酮3′羥基化酶、黃酮醇合成酶和無色花青素還原酶活性總體上高于L家系。其中，H家系黃烷酮3′羥基化酶活性隨時(shí)間變化呈明顯的上升趨勢，而L家系僅在授粉后70～90 d有所上升，之后活性水平趨于平穩(wěn)；授粉后70～80 d，2個(gè)家系黃烷酮3′羥基化酶活性水平差異不顯著，90～110 d則呈現(xiàn)顯著或極顯著的差異水平。L家系黃酮醇合成酶和無色花青素還原酶活性均隨時(shí)間變化而逐漸下降，授粉后100、110 d兩種酶活性信號均已十分微弱，而H家系中這兩種酶活性均較高；授粉后70～110 d，,2個(gè)家系間無色花青素還原酶活性差異均達(dá)極顯著水平，黃酮醇合成酶活性除授粉后70 d兩者無顯著性差異外，其他時(shí)間兩者差異均達(dá)極顯著水平。H家系花青素合成酶活性隨時(shí)間變化呈先上升后下降再上升的動(dòng)態(tài)變化趨勢；L家系則呈先上升后下降趨勢，授粉后80 d活性最高；授粉后70 d，H家系花青素合成酶活性極顯著低于L家系，授粉后100、110 d則極顯著高于L家系。H家系花青素還原酶活性隨時(shí)間變化呈逐漸升高趨勢，L家系則呈先下降后上升再下降的動(dòng)態(tài)變化趨勢，授粉后70～90 d，H家系花青素還原酶活性極顯著低于L家系，100、110 d則顯著高于L家系。

圖2 不同家系杉木種子類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶活性比較

2.3 杉木澀籽類黃酮合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)

2個(gè)家系類黃酮生物合成途徑關(guān)鍵基因相對表達(dá)量見圖3。2個(gè)家系種子的CHS、CHI相對表達(dá)量隨時(shí)間變化呈先下降后上升趨勢，且H家系均低于L家系。其中，兩個(gè)家系的CHI相對表達(dá)量在授粉后90 d差異顯著，其他處理差異均達(dá)極顯著水平；CHS相對表達(dá)量在授粉后90～110 d差異極顯著。H家系的F3′H相對表達(dá)量總體上隨授粉天數(shù)變化而逐漸升高，而L家系則呈先上升后下降的趨勢；授粉后70～90 d，H家系F3′H相對表達(dá)量極顯著低于L家系，授粉后110 d則極顯著高于L家系。2個(gè)家系DFR相對表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢，授粉后90 d最大，除授粉后70 d二者無顯著差異外，其他時(shí)間H家系均顯著或極顯著高于L家系。H家系FLS相對表達(dá)量隨時(shí)間變化呈“W”型變化趨勢，而在L家系中未檢測到FLS基因的表達(dá)信號。L家系LAR與ANR的相對表達(dá)量均高于H家系，授粉后70～80 d兩個(gè)家系的LAR相對表達(dá)量變化呈相反的趨勢，80～110 d則均呈上升趨勢，并在授粉后110 d差異達(dá)顯著水平；授粉后70～110 d，H家系A(chǔ)NR相對表達(dá)量均極顯著低于L家系。

圖3 不同家系杉木種子類黃酮合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)比較

2.4 類黃酮類代謝物含量與酶活性及調(diào)控基因相對表達(dá)的相關(guān)性

杉木澀籽類黃酮類代謝物含量與關(guān)鍵酶活性、調(diào)控基因相對表達(dá)的相關(guān)性分析如表2所示。綜合相關(guān)性系數(shù)和顯著性指標(biāo)，兩個(gè)家系中與主要代謝物含量變化顯著相關(guān)的酶活性及基因表達(dá)有所不同。L家系的總黃酮含量與查爾酮異構(gòu)酶活性及CHS、LAR和ANR的表達(dá)呈顯著正相關(guān)；H家系則與查爾酮異構(gòu)酶、二氫黃酮醇4-還原酶、花青素合成酶活性及ANR的相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。L家系的花青素含量與查爾酮合成酶活性及CHS、CHI和ANR相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，與黃酮醇合成酶、無色花青素還原酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；H家系則與查爾酮合成酶、黃烷酮3′羥基化酶、二氫黃酮醇4-還原酶、花青素還原酶活性及CHI和LAR相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。L家系的槲皮素含量與花青素合成酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；H家系則與酶活性和基因相對表達(dá)量的相關(guān)性均不顯著。L家系山奈酚含量與酶活性和基因表達(dá)的相關(guān)性均不顯著；H家系則與查爾酮異構(gòu)酶、花青素合成酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)。L家系楊梅素含量與二氫黃酮醇4-還原酶活性呈顯著正相關(guān)，與花青素還原酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；H家系則與查爾酮合成酶、黃烷酮3′羥基化酶、二氫黃酮醇4-還原酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)。L家系兒茶素含量與黃烷酮3′羥基化酶活性呈顯著正相關(guān)，與黃酮醇合成酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；H家系則與DFR的相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。兩個(gè)家系表兒茶素含量與酶活性和基因表達(dá)的相關(guān)性均不顯著。

表2 類黃酮類代謝物含量與酶活性及調(diào)控基因相對表達(dá)的相關(guān)性分析1)

2.5 類黃酮生物合成途徑差異性分析

通過比對可以看出(圖4)，上游的查爾酮合成酶和異構(gòu)酶活性在兩個(gè)家系間的差異不大，其編碼基因CHS和CHI則在H家系中呈相對下調(diào)表達(dá)。中游的3個(gè)關(guān)鍵酶及其調(diào)控基因中，黃酮醇合成酶及其編碼基因FLS在兩個(gè)家系中的差異最為明顯，在H家系中均為顯著上調(diào)表達(dá)，其產(chǎn)物槲皮素、山奈酚和楊梅素含量也呈明顯的上調(diào)趨勢。下游的3個(gè)關(guān)鍵酶及其調(diào)控基因中，無色花青素還原酶活性有明顯上調(diào)，其調(diào)控產(chǎn)物兒茶素含量也小幅上調(diào)，但編碼基因LAR相對表達(dá)量的變化幅度不大。花青素還原酶編碼基因ANR及其調(diào)控產(chǎn)物表兒茶素均有明顯的下調(diào)表現(xiàn)，但其酶活性差異不大。

色塊從左到右依次表示授粉后70～110 d H家系與L家系各代謝物含量比值的對數(shù)。

3 討論

杉木澀籽形成過程中存在種胚萎縮敗育和種腔被大量次生代謝物填充兩個(gè)明顯特征。早期研究認(rèn)為，澀籽內(nèi)的次生代謝物質(zhì)主要為單寧類及其衍生物[3-7]；而近期研究發(fā)現(xiàn)，在澀籽發(fā)生初期，包括黃酮、黃酮醇、黃酮炭糖苷、黃烷酮、異黃酮和花青素等類黃酮類代謝物及其衍生物的含量較高[8]。本研究表明，澀籽率較高的H家系種子發(fā)育過程中總黃酮和槲皮素、山奈酚、楊梅素、兒茶素、花青素等類黃酮生物合成途徑中的重要代謝物含量明顯高于L家系，表明澀籽發(fā)育初期類黃酮類次生代謝物質(zhì)出現(xiàn)異常積累，這與林小琴[28]的研究結(jié)果相符。

查爾酮合成酶是類黃酮生物合成途徑的第一個(gè)限速酶，其催化苯丙烷代謝途徑的產(chǎn)物丙二酰輔酶A與香豆酰輔酶A或咖啡酰輔酶A縮合形成類黃酮生物合成途徑的重要中間產(chǎn)物查爾酮[29]。在植物生殖發(fā)育系統(tǒng)中，查爾酮合成酶編碼基因CHS被認(rèn)為與雄性生殖成熟有關(guān)，通過干預(yù)CHS表達(dá)能夠阻礙雄配子體的發(fā)育，進(jìn)而影響胚胎形成[30]。杉木授粉期約在2月中旬至3月上旬，而受精期則在5月中旬[31]。授粉后小孢子將近2個(gè)月停留在大孢子珠孔附近[32]，加之杉木球果種鱗為半開放狀態(tài)，難以嚴(yán)密保護(hù)，使種胚發(fā)育易受外界環(huán)境的影響。H家系中CHS的下調(diào)表達(dá)反映了小孢子的異常發(fā)育可能與澀籽形成有關(guān)。

H家系中黃酮醇合成酶活性及其編碼基因FLS的相對表達(dá)量均出現(xiàn)較大幅度的上調(diào)，同時(shí)槲皮素、山奈酚和楊梅素含量也明顯增加，表明澀籽中二氫黃酮醇更趨向于向黃酮醇類代謝物方向衍化，尤其是楊梅素含量增加趨勢最為明顯，可見澀籽種胚內(nèi)細(xì)胞的應(yīng)激系統(tǒng)處于激活狀態(tài)。相關(guān)研究表明，澀籽形成初期種胚上部開始逐漸萎縮，細(xì)胞破損解體[31]，同時(shí)楊梅素已被證實(shí)參與多種植物逆境應(yīng)激生理活動(dòng)[33-34]，這也印證了本文的推斷。另外，黃酮醇類代謝物的其他下游產(chǎn)物，如兒茶素和花青素含量也有明顯增加，這可能與底物含量的增加有關(guān)，也可能是由于澀籽內(nèi)抗氧化酶系活性下降，相應(yīng)的抗氧化類次生代謝物結(jié)合活性氧能力下降而導(dǎo)致活性氧積累所造成。