“高劑量/庇護(hù)所”策略在Bt玉米靶標(biāo)害蟲抗性治理中的應(yīng)用及成效

楊曉偉, 李云河, 韓蘭芝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

1996年,表達(dá)蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物在美國商業(yè)化種植,隨后轉(zhuǎn)Bt作物在全球范圍內(nèi)連續(xù)種植,取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。僅2019年,全球種植的Bt抗蟲作物(含Bt基因的單性狀/復(fù)合性狀)已超過1.07億hm2,其中約5 600萬hm2為Bt玉米[1]。為解決我國玉米生產(chǎn)中面臨的重大蟲害、草害及國家糧食安全等問題,2021年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部開展了抗蟲、耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的產(chǎn)業(yè)化試點(diǎn)工作,試點(diǎn)種植呈現(xiàn)增產(chǎn)增效和生態(tài)效果顯著的優(yōu)勢。2022年中央一號(hào)文件《中共中央國務(wù)院關(guān)于做好2022年全面推進(jìn)鄉(xiāng)村振興重點(diǎn)工作的意見》提出,“全面實(shí)施種業(yè)振興行動(dòng)方案;啟動(dòng)農(nóng)業(yè)生物育種重大項(xiàng)目”(http:∥www.gov.cn/zhengce/2022-02/22/content_5675035.htm)。這表明,我國轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植正在有序推進(jìn)。

然而,長期、大規(guī)模種植Bt作物可能導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生Bt抗性,這是影響轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米可持續(xù)應(yīng)用的關(guān)鍵因素。為了延緩害蟲對(duì)Bt作物的抗性演化,“高劑量/庇護(hù)所”策略在全球被廣泛應(yīng)用[2-3]。雖然“高劑量/庇護(hù)所”策略的基本原理已被普遍接受,但不同國家實(shí)施的具體政策和法規(guī)因Bt作物種類、基因類型、種植區(qū)域、靶標(biāo)害蟲等不同而呈現(xiàn)較大差異,抗性治理的成效也存在較大差異?；诖?本文簡單介紹了“高劑量/庇護(hù)所”策略的理論基礎(chǔ)及庇護(hù)所實(shí)施的主要形式,概述了全球五大Bt玉米種植國美國、巴西、阿根廷、南非和加拿大“高劑量/庇護(hù)所”策略的政策與法規(guī)制定、庇護(hù)所實(shí)施的具體要求和種植者的履行情況;總結(jié)了“高劑量/庇護(hù)所”策略在一些國家實(shí)施的成功經(jīng)驗(yàn),分析了害蟲抗性治理失敗案例的主要原因。這些 “高劑量/庇護(hù)所”策略實(shí)施的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)可望為我國轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和害蟲抗性管理提供重要技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。

1 “高劑量/庇護(hù)所”策略的理論基礎(chǔ)及庇護(hù)所的三種形式

1.1 “高劑量/庇護(hù)所”策略的理論基礎(chǔ)

“高劑量/庇護(hù)所”策略是在高劑量表達(dá)Bt殺蟲蛋白的Bt作物區(qū)域附近,種植非Bt作物,作為敏感害蟲種群的庇護(hù)所,Bt作物區(qū)域存活下來的少量抗性個(gè)體,與庇護(hù)所提供的敏感種群自由交配,所產(chǎn)生的抗性雜合子后代能夠被高劑量表達(dá)Bt殺蟲蛋白的Bt作物殺死,進(jìn)而減少昆蟲抗性基因的累積,延緩害蟲抗性的發(fā)展[4]。從理論上講,該策略包含以下幾個(gè)基本要求和假設(shè):1)假設(shè)昆蟲Bt抗性為隱性遺傳,且初始抗性基因頻率較低;2)Bt作物表達(dá)高劑量Bt殺蟲蛋白能殺死Bt作物上所有的敏感個(gè)體和幾乎所有Bt抗性雜合子;3)庇護(hù)所中存活的大量敏感個(gè)體與Bt作物上存活的少數(shù)抗性個(gè)體能夠自由交配[5]。

1.2 “高劑量”的含義及庇護(hù)所的三種形式

“高劑量/庇護(hù)所”的理論基礎(chǔ)包括“高劑量”和“庇護(hù)所”兩部分?！案邉┝俊笔侵皋D(zhuǎn)基因抗蟲作物表達(dá)的殺蟲蛋白劑量很高,理論上能夠殺死靶標(biāo)害蟲種群中100%的敏感個(gè)體和95%的敏感/抗性雜合子個(gè)體。對(duì)此,各國要求較為一致,以敏感靶標(biāo)害蟲99%致死劑量的25倍為標(biāo)準(zhǔn),超過此濃度視為高劑量?！氨幼o(hù)所”是指在Bt作物附近,為靶標(biāo)害蟲的敏感個(gè)體提供存活空間的非轉(zhuǎn)基因植物寄主。它的形式較為多樣,現(xiàn)階段主要有3種不同形式的庇護(hù)所:1)結(jié)構(gòu)庇護(hù)所:在轉(zhuǎn)基因抗蟲作物附近種植的一定比例(如20%)的同種非轉(zhuǎn)基因作物;2)自然庇護(hù)所:轉(zhuǎn)基因作物附近的其他非抗蟲寄主作物,可以作為敏感害蟲的天然庇護(hù)所,適用于靶標(biāo)昆蟲為雜食性害蟲的抗性治理;3)種子混合庇護(hù)所:又稱為“袋中庇護(hù)所”,將轉(zhuǎn)基因抗蟲作物種子和非抗蟲作物種子按照一定比例預(yù)混在一起種植,播種后隨機(jī)分布在轉(zhuǎn)基因抗蟲植株周圍的非抗蟲植株為靶標(biāo)害蟲的敏感個(gè)體提供庇護(hù)所。

2 主要Bt玉米種植國“高劑量/庇護(hù)所”策略應(yīng)用的法規(guī)要求

2.1 美國

美國是最早推行Bt作物商業(yè)化應(yīng)用的國家,也是世界上最大的轉(zhuǎn)基因作物種植國。2019年美國轉(zhuǎn)基因玉米種植面積全球第一,為3 317萬hm2,占美國玉米總種植面積的92%[1]。在種植Bt作物的同時(shí),美國嚴(yán)格執(zhí)行“高劑量/庇護(hù)所”策略,是全球執(zhí)行該策略最好的國家之一。

美國環(huán)境保護(hù)署(U.S. Environmental Protection Agency, US EPA)對(duì)所有進(jìn)入市場的Bt作物有著嚴(yán)格的規(guī)定,對(duì)所有轉(zhuǎn)Bt基因產(chǎn)品發(fā)放注冊證書,并確保其處于被監(jiān)管狀態(tài),保障進(jìn)入市場的Bt作物種子均表達(dá)高劑量的Bt殺蟲蛋白。EPA在各方面對(duì)注冊人均有嚴(yán)格要求。注冊前,注冊人需提交以下信息:1)靶標(biāo)生物的生物學(xué)與生態(tài)學(xué)特征;2)靶標(biāo)生物對(duì)Bt蛋白的敏感性如致死劑量、死亡率;3)作用機(jī)理、抗性遺傳學(xué)、是否有交互抗性;4)作物和靶標(biāo)害蟲的抗性管理模型。這些資料主要用于抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,建立田間抗性管理制度。注冊后,注冊人還需要提供以下信息:5)田間抗性監(jiān)測計(jì)劃;6)緊急補(bǔ)救措施;7)庇護(hù)所按規(guī)定履行的保障計(jì)劃;8)農(nóng)民相關(guān)知識(shí)教育培訓(xùn)計(jì)劃。第5～第8條需要每年向EPA提交年度完成報(bào)告[6]。在庇護(hù)所種植方面,EPA要求注冊人傳授農(nóng)民相關(guān)抗性管理知識(shí)并檢查農(nóng)民庇護(hù)所種植情況。注冊的產(chǎn)品有嚴(yán)格的時(shí)間限制,如果在注冊有效期內(nèi)沒有執(zhí)行相應(yīng)要求,則取消產(chǎn)品注冊資格[7]。產(chǎn)品注冊人或種子公司按照EPA的要求,與農(nóng)民簽訂Bt作物種植合同,如果農(nóng)民違反庇護(hù)所或其他抗性管理規(guī)定,種子公司必須取消與農(nóng)民的合同[7]。整個(gè)過程中注冊人對(duì)所有過程負(fù)責(zé),與農(nóng)民、種植協(xié)會(huì)、科學(xué)家和種子公司交流協(xié)作,制定、改進(jìn)和執(zhí)行抗性管理策略,并收集所有資料向EPA匯報(bào)[7]。從1996年Bt作物進(jìn)入市場以來,EPA對(duì)每種Bt玉米轉(zhuǎn)化體制定了詳細(xì)的庇護(hù)所要求,隨著技術(shù)的進(jìn)步和相關(guān)理論的完善,現(xiàn)階段不同類型Bt玉米的庇護(hù)所要求如下(表1)。

表1 美國當(dāng)前Bt玉米庇護(hù)所的要求1)Table 1 Current refuge strategies for Bt corn in the United States

1) 結(jié)構(gòu)庇護(hù)所中涉及的百分?jǐn)?shù):指結(jié)構(gòu)庇護(hù)所的種植面積占Bt作物及其庇護(hù)所總面積的百分比。種子混合庇護(hù)所中涉及的百分?jǐn)?shù):指庇護(hù)所種植所用的種子量占Bt作物及其庇護(hù)所種植總用種量的百分比。共用庇護(hù)所:指一個(gè)地塊同時(shí)作為鱗翅目和鞘翅目的庇護(hù)所。玉米產(chǎn)區(qū):指以種植玉米為主的地區(qū)。棉花產(chǎn)區(qū):特指美國以種植棉花為主的8個(gè)州(阿拉巴馬州、阿肯色州、佐治亞州、佛羅里達(dá)州、路易斯安那州、北卡羅來納州、密西西比州、南卡羅來納州和俄克拉荷馬州)以及來自5個(gè)州(俄克拉荷馬州、田納西州、德克薩斯州、弗吉尼亞州和密蘇里州)的部分縣,同時(shí)該地區(qū)也可種植玉米。由于Bt棉花和玉米有共同的靶標(biāo)害蟲,這些地區(qū)同時(shí)種植Bt棉花和玉米時(shí),為避免靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生交互抗性,需要履行特殊的庇護(hù)所種植要求。復(fù)合性狀是將靶標(biāo)害蟲為不同物種(例如鱗翅目螟蟲和玉米根螢葉甲)的兩個(gè)或多個(gè)Bt基因轉(zhuǎn)入同一植株。Bt聚合是將靶標(biāo)害蟲為同一物種的兩個(gè)或多個(gè)Bt基因轉(zhuǎn)入同一植株。本表引用自美國EPA網(wǎng)站(https:∥www.epa.gov/regulation-biotechnology-under-tsca-and-fifra/insect-resistance-management-bt-plant-incorporated)。

Percentage referred in structured refuge: The ratio of the planting area of the structured refuge in the total planting area of Bt crop and its structured refuge. Percentage referred in seeds blend refuge: The ratio of seeds used for refuge planting in the total seeds used for both Bt crops and its refuge planting. Combined refuge: A single refuge for both lepidopteran and coleopteran target pests. Corn belt: The region in which the corn is mainly planted. Cotton region: the cotton production areas in the following eight states (Alabama, Arkansas, Georgia, Florida, Louisiana, North Carolina, Mississippi, South Carolina and Oklahoma) and some counties from the five states (Oklahoma, Tennessee, Texas, Virginia and Missouri). Simultaneously, the corn also be planted in this region. Sine there are common target pests in both Bt cotton and corn, special refuge requirements should be executed to avoid the cross-resistance of the target pests, when the maize is cultivated in these areas. “Stacked” means two or more Bt genes targeting multiple pests (e.g., lepidopteran stalk borers and corn rootworm) were transferred into the same plant. “Pyramids” means two or more Bt genes targeting the same pest were transferred into the same plant. This table was cited from US EPA website (https:∥www.epa.gov/regulation-biotechnology-under-tsca-and-fifra/insect-resistance-management-bt-plant-incorporated).

簡單來說,對(duì)單價(jià)Bt基因的玉米,需20%的結(jié)構(gòu)庇護(hù)所或10%的種子混合庇護(hù)所(靶標(biāo)害蟲為鱗翅目不能使用種子混合庇護(hù)所)。對(duì)Bt基因聚合玉米,庇護(hù)所面積比例可降為5%(結(jié)構(gòu)或種子混合庇護(hù)所)。轉(zhuǎn)基因玉米的靶標(biāo)害蟲為鱗翅目時(shí),一般要求庇護(hù)所和Bt作物間隔小于800 m;如果為鞘翅目害蟲,則要求庇護(hù)所緊鄰Bt作物。當(dāng)轉(zhuǎn)基因玉米在Bt棉產(chǎn)區(qū)種植時(shí),要求必須有結(jié)構(gòu)庇護(hù)所,且對(duì)庇護(hù)所面積比例要求更高。

美國對(duì)Bt作物庇護(hù)所策略執(zhí)行較好。2002年的一項(xiàng)調(diào)查表明,美國85%的玉米種植者按照要求種植了庇護(hù)所;2001年-2006年,Bt作物庇護(hù)所達(dá)標(biāo)率為72%～96%;雖然隨后的兩年達(dá)標(biāo)率為74%～80%,略有下降,但整體比例仍處于較高水平[8]。

2.2 巴西

2007年巴西開始批準(zhǔn)種植轉(zhuǎn)基因玉米,2019年巴西有91.0%的玉米為轉(zhuǎn)基因玉米,共計(jì)1 630萬hm2,位居全球第二[1]。在巴西,害蟲抗性評(píng)價(jià)與管理工作不是強(qiáng)制性的。Bt作物的害蟲抗性管理歸屬于農(nóng)藥法規(guī)管理,和化學(xué)農(nóng)藥一樣,由農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部和環(huán)境部門負(fù)責(zé)注冊和審查。對(duì)于重要害蟲,Bt作物注冊人和科學(xué)家合作,提出害蟲抗性管理辦法,建立害蟲敏感基線,并對(duì)害蟲抗性進(jìn)行監(jiān)測。在Bt玉米種植初期,害蟲Bt抗性管理策略在巴西并未得到重視,當(dāng)害蟲對(duì)Bt殺蟲蛋白的抗性發(fā)展到一定水平,Bt玉米對(duì)害蟲防治效果顯著下降之后,巴西政府和種植者才開始重視這一問題[9-11]。巴西生物技術(shù)信息委員會(huì)(Council for Information on Biotechnology in Brazil, CIB Brazil)、抗性管理科技小組(Technical-Scientific Group for Resistance Management, GTMR)和農(nóng)藥抗性行動(dòng)委員會(huì)(Insecticide Resistance Action Committee, IRAC)等組織先后參與相關(guān)的研究和政策制定。2015年,巴西開始啟動(dòng)害蟲抗性管理政策,鼓勵(lì)農(nóng)民采用庇護(hù)所策略,對(duì)于大豆和棉花,推薦種植20%的庇護(hù)所,但玉米僅要求種植10%的庇護(hù)所。如果種植結(jié)構(gòu)庇護(hù)所,和Bt玉米田之間的距離要小于800 m[12],對(duì)結(jié)構(gòu)庇護(hù)的形狀沒有強(qiáng)制要求,但官方建議最好使用條帶形(巴西學(xué)者認(rèn)為該種形式的結(jié)構(gòu)庇護(hù)所效果最好),建議種植能夠表達(dá)兩種或兩種以上殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米品種。在蟲害壓力不大的情況下,不建議使用農(nóng)藥,僅在必要情況(蟲害壓力大)下使用農(nóng)藥,且不建議在庇護(hù)所上使用Bt類農(nóng)藥。建議使用多作物輪作,Bt作物種植后,下一輪播種應(yīng)當(dāng)為非寄主作物或者常規(guī)玉米(https:∥croplife.org/case-study/brazil-managing-insect-resistance-in-biotech-crops/)。但值得注意的是,這些要求均以建議為主,沒有官方的強(qiáng)制執(zhí)行。巴西庇護(hù)所策略整體執(zhí)行情況并不樂觀,相關(guān)數(shù)據(jù)并未公布,但是預(yù)期完成率小于20%[13]。

2.3 阿根廷

阿根廷從1998年開始種植Bt玉米,隨后種植了轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和苜蓿。2019年種植了598萬hm2轉(zhuǎn)基因玉米(大部分為Bt玉米),是世界第三大轉(zhuǎn)基因玉米種植國[1]。2012年-2013年,阿根廷Bt玉米上出現(xiàn)了第一個(gè)靶標(biāo)害蟲田間抗性案例[14-15]。農(nóng)民觀察到田間蟲害損失后,聯(lián)系種子供應(yīng)商。種子公司(陶氏益農(nóng)、杜邦先鋒和孟山都公司)聯(lián)合種子協(xié)會(huì)、農(nóng)民和其他相關(guān)政府機(jī)構(gòu)(農(nóng)業(yè)工業(yè)部生物技術(shù)管理局Directorate of Biotechnology、國家種子研究所National Seed Institute和國家食品衛(wèi)生和質(zhì)量服務(wù)部監(jiān)督監(jiān)測局Directorate of Surveillance and Monitoring),合作進(jìn)行了一系列的害蟲抗性治理工作。治理措施主要包括抗性監(jiān)測和檢測、化學(xué)防治和相應(yīng)的庇護(hù)所策略。庇護(hù)所種植方面,最初要求種植結(jié)構(gòu)庇護(hù)所,2014年頒布相關(guān)法規(guī),允許使用種子混合庇護(hù)所替代結(jié)構(gòu)庇護(hù)所(http:∥servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=230560),即在售賣Bt種子時(shí)預(yù)先加入10%的非Bt玉米種子。這是因?yàn)榘⒏t玉米的靶標(biāo)害蟲為小蔗桿草螟Diatraeasaccharalis,其幼蟲在不同玉米植株間移動(dòng)能力較差,符合種子混合庇護(hù)所種植要求,且種子混合庇護(hù)所對(duì)農(nóng)民而言,更易操作。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,2013年-2014年阿根廷75%的Bt玉米均種植了結(jié)構(gòu)庇護(hù)所,2014年-2015年庇護(hù)所種植比例提高到87%,2015年-2016年又增加了種子庇護(hù)所。結(jié)合其他抗性管理策略,小蔗桿草螟的Bt抗性得到有效緩解,Bt玉米在阿根廷可持續(xù)應(yīng)用,農(nóng)民繼續(xù)受益。這說明害蟲抗性管理措施在阿根廷取得較大成功,且庇護(hù)所策略發(fā)揮了積極作用[15]。

2.4 南非

1997年,南非批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米種植,成為非洲首個(gè)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物種植的國家。2019年南非種植了194萬hm2的轉(zhuǎn)基因玉米,種植面積位居世界第四[1]。最初的數(shù)年間種植的均為表達(dá)單一Bt殺蟲蛋白(Cry1Ab)的‘MON810’抗蟲玉米轉(zhuǎn)化體。2005年,南非多地報(bào)道了亞澳白裙夜蛾Busseolafusca對(duì)Cry1Ab的抗性事件[16]。隨后,南非批準(zhǔn)了多基因聚合抗蟲玉米轉(zhuǎn)化體‘MON89034’(表達(dá)Cry1.105和Cry2Ab2)的種植,‘MON810’幾乎全部被淘汰[17]。南非是一個(gè)轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管體系相對(duì)完善的國家。1997年,其頒布了《轉(zhuǎn)基因法案》;2006年頒布了《轉(zhuǎn)基因修正法案》,由農(nóng)業(yè)、土地改革和鄉(xiāng)村發(fā)展部的轉(zhuǎn)基因注冊機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)管理該法案,獨(dú)立的第三方科學(xué)顧問委員會(huì)(Advisory Committee, AC)負(fù)責(zé)審查轉(zhuǎn)基因玉米品種的申請,并向最終的決策機(jī)構(gòu)執(zhí)行委員會(huì)(Executive Council, EC)提供建議[18]。南非同樣采用“高劑量/庇護(hù)所”策略進(jìn)行害蟲Bt抗性治理,允許農(nóng)民選擇種植5%的庇護(hù)所(不施用農(nóng)藥)或者20%的庇護(hù)所(可以施用化學(xué)農(nóng)藥和除Bt制劑以外的生物農(nóng)藥)。但一項(xiàng)早期研究顯示,農(nóng)民很少采用20%的庇護(hù)所。1998年僅有7.7%的農(nóng)民依照法規(guī)種植了庇護(hù)所[19-20]。2005年,害蟲產(chǎn)生抗性后,南非開始重視庇護(hù)所的種植。2007年符合條件的庇護(hù)所種植情況得到顯著改善。2011年,南非開始種植多基因聚合玉米。在2013年-2014年,完全符合要求的庇護(hù)所種植率為75%,另有17%的農(nóng)民種植了部分庇護(hù)所,僅8%(4.9萬hm2)的農(nóng)民未種植任何庇護(hù)所[18]。

2.5 加拿大

加拿大種植了160萬hm2的轉(zhuǎn)基因玉米,位居全球第五,同樣執(zhí)行了“高劑量/庇護(hù)所”政策[21]。加拿大食品檢驗(yàn)局(Canadian Food Inspection Agency,CFIA)主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理,其中包括害蟲抗性管理(Insect Resistance Management,IRM)工作。CFIA規(guī)定了IRM過程中各參與者的職能(圖1)[21]。要求Bt玉米商業(yè)化需長期遵循以下原則:1)庇護(hù)所面積至少為Bt玉米的20%,且必須緊靠Bt作物,庇護(hù)所地塊的管理方式(農(nóng)藥施用、耕作方式等)需要確保靶標(biāo)害蟲的敏感種群存活;2)需要開發(fā)IRM培訓(xùn)工具,并提供給所有種植者和公司田間推廣人員;3)必須盡早開展害蟲抗性田間檢測工作,并立即將檢測結(jié)果匯報(bào)給CFIA;4)推廣害蟲的綜合治理措施,如輪作或害蟲治理的其他替代方案;5)繼續(xù)研究庇護(hù)所為主的害蟲抗性管理計(jì)劃,并將結(jié)果提供給CFIA。

圖1 加拿大害蟲抗性管理參與者及其職責(zé)[21]Fig.1 IRM-roles and responsibilities in Canada

加拿大采取了和美國類似的庇護(hù)所要求(表1)。2005年,加拿大有超過80%的農(nóng)民按照要求種植了庇護(hù)所,與2001年的達(dá)標(biāo)率持平。2009年的數(shù)據(jù)顯示庇護(hù)所種植達(dá)標(biāo)率為61%,另外有23%的農(nóng)戶種植了部分未達(dá)標(biāo)的庇護(hù)所,大約為Bt作物面積的15%～20%,僅17%的農(nóng)戶未種植任何庇護(hù)所?？傮w而言,加拿大庇護(hù)所策略的實(shí)施比例較高[8]。

3 “高劑量/庇護(hù)所”策略在轉(zhuǎn)Bt基因玉米靶標(biāo)害蟲抗性治理的實(shí)施成效

目前全球轉(zhuǎn)Bt基因玉米的種植面積達(dá)5 600萬hm2,種植Bt玉米的國家已達(dá)14個(gè),主要包括美國、巴西、阿根廷、南非和加拿大等國家[1]。這些國家Bt玉米上的主要靶標(biāo)害蟲有歐洲玉米螟Ostrinianubilalis、玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera、美洲棉鈴蟲Helicoverpazea、草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、中東蛀莖夜蛾Sesamianonagrioides、西南玉米桿草螟Diatraeagrandiosella等[22]。因此相關(guān)害蟲抗性治理也主要圍繞這些靶標(biāo)害蟲開展。到目前為止,全球抗性監(jiān)測數(shù)據(jù)表明:轉(zhuǎn)cry1Ab和cry1F基因玉米對(duì)歐洲玉米螟[23-25]、轉(zhuǎn)vip3A基因玉米對(duì)草地貪夜蛾[26-27]和美洲棉鈴蟲[27]、轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米對(duì)中東蛀莖夜蛾[28-29]和西南玉米桿草螟[30]仍保持敏感水平;但目前也已明確草地貪夜蛾、玉米根螢葉甲、美洲棉鈴蟲、亞澳白裙夜蛾、小蔗桿草螟、豆紋緣夜蛾Striacostaalbicosta等害蟲在田間對(duì)Bt玉米產(chǎn)生了抗性[31]。

3.1 抗性治理成功案例

1996年轉(zhuǎn)cry1Ab基因的抗蟲玉米轉(zhuǎn)化體‘Bt176’‘MON810’和‘Bt11’率先在美國和加拿大商業(yè)化種植。由于歐洲玉米螟和西南玉米桿草螟對(duì)Cry1Ab殺蟲蛋白高度敏感,所以cry1Ab玉米對(duì)這兩種害蟲具有較高的防效,但其對(duì)美洲棉鈴蟲和草地貪夜蛾防效不高[32]。2003年,為提高對(duì)草地貪夜蛾、美洲棉鈴蟲和玉米根螢葉甲的防效,美國商業(yè)化種植了表達(dá)Cry1F殺蟲蛋白的‘TC1507’轉(zhuǎn)化體,該轉(zhuǎn)化體同時(shí)對(duì)歐洲玉米螟、草地貪夜蛾和西南玉米桿草螟展現(xiàn)了極高的防效[33]。2006年波多黎各種植區(qū)檢測到草地貪夜蛾高水平抗性種群后,美國強(qiáng)制召回該轉(zhuǎn)化體并及時(shí)對(duì)玉米品種進(jìn)行了更新?lián)Q代[34-35]。2010年孟山都公司研發(fā)的表達(dá)Cry1A.105+Cry2Ab2 蛋白的雙基因抗蟲玉米‘MON89034’在美國和加拿大商業(yè)化種植,用以提高對(duì)草地貪夜蛾和美洲棉鈴蟲的防效[36]。此后,又相繼將‘MON89034’ ‘TC1507’ ‘MON863’(表達(dá)Cry3Bb1)和‘MON88017’ (表達(dá)Cry3Bb1)等多個(gè)抗蟲轉(zhuǎn)化事件聚合,擴(kuò)大了殺蟲譜和延緩了靶標(biāo)害蟲抗性的發(fā)展[37]。由于草地貪夜蛾對(duì)Cry1類、美洲棉鈴蟲對(duì)Cry1/2類殺蟲蛋白相繼產(chǎn)生抗性,生物育種研發(fā)公司又推出了殺蟲機(jī)制不同于cry類的新殺蟲基因vip3A。表達(dá)Vip3A殺蟲蛋白的抗蟲玉米轉(zhuǎn)化體‘MIR162’和與該轉(zhuǎn)化體進(jìn)行多基因聚合的‘MON89034’× ‘TC1507’× ‘MIR162’和‘Bt11’× ‘MIR162’抗蟲玉米品種相繼商業(yè)化種植,以控制草地貪夜蛾的為害[38]。

在美國和加拿大,Bt玉米抗蟲轉(zhuǎn)化體商業(yè)化應(yīng)用的初期,Bt殺蟲蛋白對(duì)歐洲玉米螟、西南玉米桿草螟和草地貪夜蛾這3種靶標(biāo)害蟲均能達(dá)到高劑量要求;又由于Bt玉米品種的及時(shí)更新?lián)Q代,所以歐洲玉米螟和西南玉米桿草螟對(duì)Cry1Ab殺蟲蛋白一直處于敏感水平;除了北卡羅來納州、佛羅里達(dá)州和波多黎各地區(qū)外,美國其他地區(qū)的草地貪夜蛾種群對(duì)Bt玉米仍處于敏感水平。靶標(biāo)害蟲對(duì)Bt玉米保持敏感性的更重要原因是庇護(hù)所策略的有效實(shí)施。在玉米種植區(qū),對(duì)早期單基因抗蟲玉米,政府要求種植20%的結(jié)構(gòu)庇護(hù)所;而對(duì)后來更新?lián)Q代后的雙基因/多基因抗蟲玉米,要求種植5%的結(jié)構(gòu)庇護(hù)所或5%的種子混合庇護(hù)所(表1)。據(jù)調(diào)查,這些庇護(hù)所策略在當(dāng)?shù)鼐玫接行?shí)施[30]。

3.2 抗性治理失敗案例

3.2.1美國波多黎各、巴西、阿根廷草地貪夜蛾對(duì)Cry1F的抗性

2003年,美屬波多黎各地區(qū)開始種植表達(dá)Bt Cry1F殺蟲蛋白的抗蟲玉米轉(zhuǎn)化體‘TC1507’。該轉(zhuǎn)化體種植4年后,即2006年,田間出現(xiàn)高抗Cry1F(1 000倍)的草地貪夜蛾抗性種群,Bt玉米‘TC1507’被草地貪夜蛾嚴(yán)重為害。隨后‘TC1507’迅速被召回,這是因?yàn)榭剐苑N群的產(chǎn)生導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物品種被強(qiáng)制召回的第一個(gè)事件[34-35]。

草地貪夜蛾寄主范圍廣,在玉米、水稻、棉花、大豆等作物上都可以存活,在這些作物上其生活史相近,繁殖能力較高,遷移能力較強(qiáng)。美屬波多黎各島地處熱帶生態(tài)系統(tǒng),島內(nèi)玉米周年種植,草地貪夜蛾年發(fā)生10代左右,地理環(huán)境較為獨(dú)特,植物結(jié)構(gòu)比較單一,草地貪夜蛾種群相對(duì)隔離,主要取食玉米,在大規(guī)模商業(yè)化種植表達(dá)Cry1F殺蟲蛋白的‘TC1507’后,沒有種植足夠的庇護(hù)所,而草地貪夜蛾在高劑量Cry1F殺蟲蛋白汰選壓力下可較快產(chǎn)生抗性突變,又因長距離飛行迅速擴(kuò)散。此外,草地貪夜蛾對(duì)Cry1F的抗性為不完全隱性,且其幼蟲在玉米上的適合度代價(jià)較低,這些因素都導(dǎo)致抗性的快速擴(kuò)散和傳播。

2013年,美國東南部的佛羅里達(dá)州和北卡羅來納州草地貪夜蛾種群對(duì)Cry1F抗性基因頻率顯著增高,田間的Bt玉米上出現(xiàn)了存活幼蟲。同時(shí),巴西和阿根廷也分別監(jiān)測到草地貪夜蛾對(duì)Cry1F的抗性[39],推測這些地區(qū)的草地貪夜蛾的抗性種群可能來源于美屬波多黎各島,隨后遷飛擴(kuò)散至該地域。這是因?yàn)?美國東南沿海和巴西、阿根廷均具有相似的地理環(huán)境,同樣種植了表達(dá)Cry1F殺蟲蛋白的抗蟲玉米轉(zhuǎn)化體‘TC1507’,波多黎各的草地貪夜蛾抗性個(gè)體遷飛到該地后,抗性種群可以在遷入地迅速地繁衍擴(kuò)散。

3.2.2玉米根螢葉甲對(duì)Cry3Bb等Bt殺蟲蛋白的抗性

2003年,美國cry3Bb1玉米開始商業(yè)化種植。2009年,美國愛荷華州農(nóng)民觀察到田間玉米根螢葉甲對(duì)cry3Bb1玉米產(chǎn)生抗性,次年發(fā)現(xiàn)更多的抗性案例。2011年,觀察到玉米根螢葉甲為害cry3Bb1和mCry3A玉米,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)二者存在交互抗性。2012年,田間玉米根螢葉甲對(duì)這兩種Bt蛋白的交互抗性擴(kuò)展到了eCry3.1Ab。玉米根螢葉甲的抗性對(duì)玉米造成了15%～17%的產(chǎn)量損失[40]。同時(shí),在美國伊利諾伊州、明尼蘇達(dá)州、內(nèi)布拉斯加州和北達(dá)科他州抽樣調(diào)查,也表現(xiàn)出了對(duì)Cry3Bb1、mCry3A和eCry3.1Ab的交互抗性,表明玉米根螢葉甲抗性在幾個(gè)地點(diǎn)呈現(xiàn)相互獨(dú)立的進(jìn)化。

多個(gè)因素可能影響玉米根螢葉甲對(duì)Bt玉米的抗性。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對(duì)玉米根螢葉甲未達(dá)到高劑量是導(dǎo)致其抗性產(chǎn)生的最主要原因。此外,成蟲交配前后在不同植株間的移動(dòng)距離有限,可能降低種子混合庇護(hù)所對(duì)抗性演化的控制效率,導(dǎo)致抗性產(chǎn)生。有數(shù)據(jù)顯示,玉米根螢葉甲成蟲每天的移動(dòng)距離只有40 m,“高劑量/庇護(hù)所”策略理論上要求Bt作物和庇護(hù)所上的成蟲能夠自由交配,當(dāng)使用結(jié)構(gòu)庇護(hù)所時(shí),成蟲有限的移動(dòng)距離限制了Bt作物和庇護(hù)所中的成蟲自由交配,降低了庇護(hù)所延緩抗性的效率。2003年-2010年美國多個(gè)州均種植了結(jié)構(gòu)庇護(hù)所,2011年開始使用種子混合庇護(hù)所或多種庇護(hù)所策略相結(jié)合來延緩抗性。另外,玉米根螢葉甲是一化性昆蟲,一年只有一代,雌蟲大部分在玉米地下產(chǎn)卵,以滯育卵越冬,次年在同一地區(qū)孵化生長。如果田間連續(xù)種植含有相同Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米,考慮到玉米根螢葉甲成蟲有限的移動(dòng)能力,不可避免導(dǎo)致Bt抗性產(chǎn)生。

3.2.3其他害蟲Bt抗性案例

2006年,南非亞澳白裙夜蛾對(duì)表達(dá)Cry1Ab蛋白的玉米產(chǎn)生抗性[16]。2015年,阿根廷小蔗桿草螟對(duì)表達(dá)Cry1A.105蛋白的Bt玉米產(chǎn)生抗性[14-15]。這些抗性案例均是在Bt玉米釋放初期缺乏庇護(hù)所種植導(dǎo)致的。抗性事件發(fā)生后,南非和阿根廷均實(shí)施了一系列積極的補(bǔ)救措施,如加強(qiáng)害蟲抗性管理,重視庇護(hù)所的種植等,這些措施的應(yīng)用顯著提高了庇護(hù)所的成效,延緩了害蟲抗性。

此外,美國小蔗桿草螟對(duì)cry1Ab玉米、菲律賓亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis對(duì)cry1Ab玉米均產(chǎn)生了早期預(yù)警抗性,即害蟲種群在室內(nèi)可以檢測到對(duì)Bt蛋白的敏感性顯著降低,但田間未觀察到害蟲種群對(duì)Bt玉米的顯著為害[31]。

4 國外抗性治理的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)對(duì)我國Bt玉米害蟲抗性管理的啟示

對(duì)各國轉(zhuǎn)基因玉米靶標(biāo)害蟲抗性治理成效的分析表明,大多數(shù)害蟲抗性管理失敗的原因均是“高劑量/庇護(hù)所”策略未制定或者未嚴(yán)格落實(shí)。首先,轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對(duì)靶標(biāo)害蟲的控制效率未達(dá)到“高劑量”標(biāo)準(zhǔn)。例如,表達(dá)Cry3Bb1和mCry3A的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對(duì)玉米根螢葉甲[41-42]和表達(dá)Cry1Ab蛋白的Bt玉米對(duì)草地貪夜蛾均未達(dá)到高劑量標(biāo)準(zhǔn)[11]。其次,庇護(hù)所策略未嚴(yán)格落實(shí)?？赡茉?國家未制定嚴(yán)格的庇護(hù)所種植要求或未嚴(yán)格執(zhí)行庇護(hù)所種植。例如,巴西和阿根廷Bt抗蟲玉米種植初期,缺乏庇護(hù)所強(qiáng)制種植的法律法規(guī),在出現(xiàn)田間抗性后才開始重視“高劑量/庇護(hù)所”策略的應(yīng)用,制定相關(guān)法規(guī)并嚴(yán)格執(zhí)行,后期對(duì)靶標(biāo)害蟲的抗性進(jìn)行了有效管理[12,15]。在美國本土,雖然抗蟲玉米對(duì)草地貪夜蛾沒有達(dá)到高劑量要求,但庇護(hù)所得到了較好的落實(shí),Bt玉米種植20年后仍未產(chǎn)生明顯抗性,這是十分成功的抗性治理案例[39]。因此,在轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米商業(yè)化種植時(shí),必須嚴(yán)格執(zhí)行“高劑量/庇護(hù)所”策略,這是保障轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米可持續(xù)應(yīng)用和健康發(fā)展的關(guān)鍵。

害蟲Bt抗性管理從來不是簡單、單一的方法和手段,而是一套系統(tǒng)的管理體系。除了執(zhí)行“高劑量/庇護(hù)所”策略外,及時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲作物品種的更新?lián)Q代和長期進(jìn)行抗性監(jiān)測均是抗性管理策略的重要組成部分。

根據(jù)我國玉米產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)和玉米主要害蟲種類、害蟲區(qū)域性發(fā)生規(guī)律和害蟲遷飛擴(kuò)散能力等生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特點(diǎn),結(jié)合我國國情和農(nóng)業(yè)發(fā)展新趨勢,借鑒國外抗性治理的成功經(jīng)驗(yàn),汲取不同國家抗性治理失敗的教訓(xùn),在此基礎(chǔ)上,我們應(yīng)提出適合我國國情的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米靶標(biāo)害蟲抗性治理策略,以期為我國Bt玉米的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和健康發(fā)展保駕護(hù)航[43]。