李曉婷，張華英，李立軍，張永平，南海英，竇淑賢

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.呼倫貝爾農(nóng)林學(xué)院，內(nèi)蒙古海拉爾 021000)

植物內(nèi)生真菌是存在于植物組織和器官內(nèi)、在其生命周期內(nèi)可以無(wú)癥狀生活在植物體內(nèi)、且不會(huì)引起病癥的一類(lèi)微生物。自19世紀(jì)以來(lái)，植物內(nèi)生真菌就已成為研究熱點(diǎn)。前人研究認(rèn)為，植物中存在許多內(nèi)生真菌，植物內(nèi)生真菌與寄主植物在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中形成了互利共生的關(guān)系，能夠提高寄主植物在自然界中的競(jìng)爭(zhēng)力。內(nèi)生真菌通過(guò)促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分吸收利用調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，作為植物的共生微生物，能分泌或產(chǎn)生不同化合物，保護(hù)宿主免受病、蟲(chóng)、草害的侵襲，緩沖外界環(huán)境對(duì)宿主植物壓力。植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的作用。

對(duì)植物內(nèi)生菌多樣性研究，早期主要采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)并利用測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，而自然界中大量微生物是不可平板培養(yǎng)繁殖的，故此法不能充分反映植物內(nèi)生真菌的群落多樣性。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)因其通量、靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，能檢測(cè)到不可培養(yǎng)的微生物，真實(shí)反映樣本中的微生物結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于微生物多個(gè)領(lǐng)域的研究中。燕麥(L.)是禾本科的一年生草本作物，因其富含蛋白質(zhì)、氨基酸和葡聚糖等營(yíng)養(yǎng)成分，既可作為家畜的優(yōu)質(zhì)飼料，也可作為重要的糧食作物。燕麥具有耐寒、耐旱、耐瘠薄及適度耐鹽堿等特點(diǎn)，常種植在瘠薄、干旱及鹽堿地，不但能提高不良農(nóng)田的利用率，同時(shí)還可改良土壤，作為內(nèi)蒙古的特色作物，在糧飼結(jié)構(gòu)改革中起到重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌能在鹽脅迫下促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤養(yǎng)分及水分的吸收，緩解鹽脅迫的危害，從而提高植物生物量，維持植物生長(zhǎng)和群體結(jié)構(gòu)，顯著改變土壤微生物群落，改善土壤質(zhì)量。

目前，有關(guān)禾本科農(nóng)作物內(nèi)生真菌的研究主要集中在小麥和水稻上，有關(guān)燕麥內(nèi)生真菌的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鹽堿地燕麥根、莖、葉內(nèi)生真菌菌群多樣性進(jìn)行分析，旨在揭示燕麥內(nèi)生真菌多樣性，為探究鹽堿地燕麥與內(nèi)生真菌共生關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2020年9月30日在內(nèi)蒙古巴彥淖爾五原縣推廣中心試驗(yàn)地(41°16′45′′N(xiāo),107°35′70′′E)采集樣品，試驗(yàn)地位于河套灌區(qū)，土壤鹽堿化嚴(yán)重，土壤pH為8.7，含鹽量約為3.28 mg·g。

在長(zhǎng)勢(shì)均勻一致燕麥(白燕2號(hào))田中選4個(gè)樣點(diǎn)，樣點(diǎn)間隔50 m，每個(gè)樣點(diǎn)取10株健康無(wú)病癥植株(此時(shí)燕麥處于拔節(jié)期)，分別置于無(wú)菌塑料袋并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱保存，在24 h內(nèi)處理樣品。

1.2 樣品處理

將燕麥根部土壤抖掉，用流水沖洗30 min，去除表面沉積物；按根、莖和葉分開(kāi)；分別先用80%乙醇消毒，葉和莖消毒2 min，根消毒1 min，再用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，最后用80%乙醇溶液消毒1 min；用無(wú)菌水多次洗滌，用無(wú)菌濾紙擦干后置于無(wú)菌EP管中，保存在-80 ℃的冰箱中。

1.3 DNA提取

DNA采用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)試劑盒參照說(shuō)明書(shū)提取。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA,USA)進(jìn)行定量測(cè)定。提取的DNA于-20 ℃保存。

1.4 PCR擴(kuò)增和ITS測(cè)序

選取真菌ITS1區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。PCR擴(kuò)增采用的引物為ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR擴(kuò)增體系為：5×recation buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP(2.5 mM)2 μL，1 μL 10 μm ITS5F，1 μL 10 μm ITS2R，DNA Template 1 μL，ddHO 9.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)回收目標(biāo)片段。根據(jù)電泳結(jié)果，用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進(jìn)行熒光定量。根據(jù)定量結(jié)果，將各樣本按比例進(jìn)行混合后上機(jī)測(cè)序。測(cè)序委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用QIIME軟件(v1.8.0)檢查并剔除疑問(wèn)序列，調(diào)用UCLUST工具將獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。采用R(v4.0.5)繪制OTU數(shù)量韋恩圖，并且計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)和物種豐度，其中Chao1和richness指數(shù)反映物種豐富度，物種多樣性指數(shù)為Shannon_true_diversity和Simpson_true_diversity，分別是由Shannon和Simpson通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)換得到的。用Excel 2019繪制柱狀圖，采用Origin 2021b Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)Alpha多樣性指數(shù)及菌群豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。Beta多樣性分析利用R軟件中anosim函數(shù)比較組間差異，采用無(wú)量度多維標(biāo)定排序法(Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS)，對(duì)不同燕麥器官內(nèi)生真菌群落進(jìn)行排序。采用R中的pheatmap包繪制屬水平的聚類(lèi)熱圖，用R調(diào)取物種信息表進(jìn)行分析并繪制LDA值分布圖，在https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/上進(jìn)行LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size)分析并完成繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥不同器官內(nèi)生真菌OTU數(shù)量分析

在90%的置信區(qū)間內(nèi)，對(duì)各樣品Coverage 測(cè)序深度指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采集燕麥樣本中覆蓋率高于90%，表明所獲得的序列能很好地代表整個(gè)內(nèi)生真菌群落。測(cè)序結(jié)果顯示，從供試樣本中共獲得內(nèi)生真菌的有效序列37 612條，基于97%相似度的分類(lèi)水平，共注釋到950個(gè)OTUs。以燕麥各器官中的OTU數(shù)量作Venn圖，結(jié)果(圖1)顯示，根、莖、葉共有OTU為302個(gè)；根和莖中有37個(gè)共有OTU，根和葉中有43個(gè)共有OTU，莖和葉中有62個(gè)共有OTU；根、莖、葉特有的OTU分別為192、144和189個(gè)，說(shuō)明燕麥不同器官中內(nèi)生真菌OTUs組成存在一定差異。

L:葉；S:莖；R:根。下同。

2.2 燕麥不同器官內(nèi)生真菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)反映了微生物群落的豐富度、多樣性。如圖2所示，燕麥葉的Alpha豐富度指數(shù)(圖2A和B)最高，其次為莖，但各器官間的差異不顯著。各Alpha多樣性指數(shù)(圖2C和D)在燕麥不同器官中均表現(xiàn)為葉>莖>根，表明葉中內(nèi)生真菌數(shù)量較多，Shannon_true_diversity、Simpson_true_diversity在葉片和根部之間差異均顯著。

2.3 燕麥不同器官內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)分析

鑒定得到的950個(gè)內(nèi)生真菌OTUs分屬于4個(gè)門(mén)、12個(gè)綱、55個(gè)屬。不同器官內(nèi)生真菌的物種組成和相對(duì)豐度分析結(jié)果(圖3)表明，在門(mén)分類(lèi)水平上(圖3A)，燕麥根、莖和葉片檢測(cè)到的內(nèi)生真菌主要分布在子囊菌門(mén)(Ascomycota，99.70%)，僅有少量分布于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota,0.11%)。子囊菌門(mén)Ascomycota豐度在燕麥不同器官中表現(xiàn)為莖>葉>根，且莖部與根部豐度差異顯著(<0.05)。

從綱分類(lèi)水平看(圖3B)，內(nèi)生真菌主要分布在錘舌菌綱(Leotiomycetes，86.11%)、糞殼菌綱(Sordariomycetes，12.21%)和座囊菌綱(Dothideomycetes，0.58%)。其中，錘舌菌綱豐度表現(xiàn)為莖>葉>根；而糞殼菌綱和座囊菌綱豐富度呈相反的趨勢(shì)。此外，部分內(nèi)生真菌(豐度<0.5%)分屬于散囊菌綱(Eurotiomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、酵母綱(Saccharomycetes)、盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)。

圖柱上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖3 燕麥不同器官內(nèi)生真菌在不同分類(lèi)階元上的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of entophytic fungal community of the three oat organs at phylum(A),class(B),genus(C&D)

所有樣品序列中僅有10.69%的序列能夠被注釋到屬的水平。從屬分類(lèi)水平上的物種柱狀圖及豐度熱圖(圖3 C和 D)中可以看出，燕麥不同器官間內(nèi)生真菌相對(duì)豐度差異較大。相對(duì)豐度>0.05%的屬在根部、、、、、、、；葉部為、、、、；莖部為、、。

2.4 燕麥不同器官內(nèi)生真菌群落差異比較

對(duì)燕麥各器官中門(mén)到屬分類(lèi)水平群落進(jìn)行LEfSe分析(LDA閾值為2)，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，燕麥莖中，錘舌菌綱(Leotiomycetes)真菌富集程度最高，柔膜菌目(Helotiales)具有豐度優(yōu)勢(shì)；而根(R)中，豐度較高的微生物分屬于糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)，主要為格孢腔菌目(Pleosporales)、肉座菌目(Hypocreales)、糞殼菌目(Sordariales)，優(yōu)勢(shì)科為孢腔菌科(Pleosporaceae)、肉座菌科(Hypocre-ales_fam_Incer)、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)、Schizothecium。

門(mén)到屬水平，LDA=2，one-against-all策略，紅色、綠色分別代表R組和S組，即根部和莖部。

3 討 論

植物不同器官中的內(nèi)生真菌數(shù)量和種類(lèi)不同。本研究發(fā)現(xiàn)，燕麥地上部?jī)?nèi)生真菌多樣性高于地下，且葉與根間的多樣性指數(shù)Shannon_true_diveristy、Simpson_true_divesity差異顯著，這與對(duì)鹽生植物翅堿蓬和番茄不同部位內(nèi)生菌多樣性的研究結(jié)果不一致，后二者地下部器官內(nèi)生菌多樣性顯著高于地上部器官。地上部?jī)?nèi)生真菌高于地下，尤其是葉部?jī)?nèi)生菌較為豐富，可能是由于地上部?jī)?nèi)生真菌的來(lái)源較多，一方面是通過(guò)葉片蒸騰作用將根部的內(nèi)生真菌擴(kuò)散而來(lái)的，另一方面是由于地上部器官所處的環(huán)境較為多元化，空氣中的微生物通過(guò)多種途徑進(jìn)入植物體內(nèi)，定殖在地上部的不同組織中，造成地上部?jī)?nèi)生菌群落多樣性較高。本研究中，燕麥的內(nèi)生真菌多樣性均較其他作物低，可能與作物種類(lèi)、生長(zhǎng)環(huán)境、地理位置及生育時(shí)期有關(guān)，本研究中燕麥種植在鹽堿農(nóng)田，鹽堿條件會(huì)降低植物的帶菌率。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)燕麥內(nèi)生真菌主要屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)。前人利用ITS rRNA基因技術(shù)分析野生大麥內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌主要為子囊菌門(mén)，與本研究結(jié)果一致。本研究中，子囊菌門(mén)在根、莖、葉中的占比均高于99%，而擔(dān)子菌門(mén)的占比僅為0.04%～ 0.19%，較其他作物的占比較低，這可能是微生物-植物協(xié)同進(jìn)化造成的。子囊真菌在燕麥各器官中分布不均，在莖中分布較豐富，可能和不同部位中的養(yǎng)分、組織結(jié)構(gòu)有關(guān)。燕麥內(nèi)生真菌在綱水平主要包括錘舌菌綱(Leotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)。這與鹽生作物鹽角草內(nèi)生真菌和新疆鹽堿植物可培養(yǎng)內(nèi)生真菌一致。本研究中，燕麥的優(yōu)勢(shì)菌綱為錘舌菌綱，可能是鹽堿環(huán)境下該類(lèi)群真菌耐鹽堿脅迫。

本研究中，燕麥各器官屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬為，而前人研究發(fā)現(xiàn)，許多作物內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為鐮刀菌屬()和鏈格孢屬()，說(shuō)明不同作物在不同環(huán)境下內(nèi)生微生物種類(lèi)有一定的差異性。本研究中，在根部的豐度最高，可能在鹽堿農(nóng)田中，燕麥根系分泌物濃度升高以降低病原微生物的豐度，提高根部的豐度以提高作物抵抗逆境的能力。

本研究初步分析了燕麥中內(nèi)生真菌多樣性，接下來(lái)將采用平板培養(yǎng)法分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌，并進(jìn)行抗旱促生長(zhǎng)特性研究，為燕麥內(nèi)生真菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。