譚彬彬，張彥，張紅霞，陳君

（天津大學(xué)附屬天津市環(huán)湖醫(yī)院 麻醉科，天津 300350）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischaemic encephalopathy, HIE）是指圍生期發(fā)生窒息，導(dǎo)致胎兒缺氧缺血帶來的腦損傷[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，高危妊娠產(chǎn)婦生產(chǎn)的新生兒HIE 發(fā)病率明顯高于正常妊娠產(chǎn)婦[2]，此外胎兒宮內(nèi)窘迫等也會(huì)增加HIE 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。妊娠期時(shí)，胎兒大腦仍處于發(fā)育期，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激異常敏感，HIE 會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)發(fā)生腦癱、癲癇等癥狀，對(duì)患兒生活造成嚴(yán)重影響。丙泊酚是一種溶于脂質(zhì)乳劑的烷基酚衍生物，作為麻醉劑和催眠劑廣泛應(yīng)用于臨床，具有起效快、恢復(fù)時(shí)間短的特點(diǎn)[4]。除麻醉作用之外，臨床中也利用丙泊酚的神經(jīng)保護(hù)作用，與右美托咪定聯(lián)合治療腦缺血再灌注損傷[5]。有研究表明，丙泊酚可以抑制炎癥通路的激活，對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠模型的神經(jīng)功能發(fā)揮保護(hù)作用[6]。因此，本研究將胎鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行缺氧處理，探究丙泊酚后處理對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探究，為HIE 治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 只健康SD 孕鼠（孕16～18 d），購自上海睿太莫斯生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2021-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：2021-SYDWLL-00489。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑丙泊酚注射液（國藥準(zhǔn)字H20030115，10 mg/mL，四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司），胰蛋白酶-EDTA 處理液（浙江聯(lián)碩生物科技有限公司），DMEM/F-12 培養(yǎng)基（南京建成生物工程研究所），BrainPhys 神經(jīng)元培養(yǎng)基（北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司），胎牛血清（德國默克公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），丙二醛（Malondialdehyde, MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）免疫組織化學(xué)試劑盒（上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司），蛋白提取試劑盒、MTT 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Hifair?ⅢOne Step RT-qPCR SYBR Green Kit（貨號(hào)：11143ES50）（上海翌圣生物科技股份有限公司），兔抗大鼠經(jīng)典型蛋白激酶Cγ（classical protein kinase Cγ ,cPKCγ）、生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43）單抗、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（美國Abcam 公司）。

1.2.2 主要儀器生物安全柜BSC-1000IIA2（蘇州蘇潔醫(yī)療器械有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），Attune 流式細(xì)胞儀（賽默飛世爾科技中國有限公司），倒置生物顯微鏡MI52-M（廣州市明美光電技術(shù)有限公司），Odyssey 近紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR Biosciences 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用1%異氟醚麻醉孕鼠，在無菌條件下剖腹手術(shù)取出胎鼠。迅速將胎鼠斷頭，在立體顯微鏡下分離腦組織中海馬體并剪碎，置于離心管中，加入等體積0.25%胰蛋白酶-EDTA 處理液37℃消化15 min，加入無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基終止消化，200 目尼龍網(wǎng)過濾，離心棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液按5×105個(gè)/mL 的密度接種到涂有聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，在37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 時(shí)將培養(yǎng)基全部換為BrainPhys 神經(jīng)元培養(yǎng)基，每3 天更換1 次培養(yǎng)基。取培養(yǎng)第7 天的神經(jīng)元細(xì)胞爬片，用NSE 免疫組織化學(xué)試劑盒鑒定神經(jīng)元，加入1∶400 稀釋NSE 抗體孵育后，DAB 顯色劑顯色，在顯微鏡下觀察到海馬神經(jīng)元呈棕褐色。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組將鑒定過的神經(jīng)元隨機(jī)分為對(duì)照組、缺氧組和丙泊酚組。缺氧組和丙泊酚組放置于90%二氧化氮NO2+10% CO2無氧培養(yǎng)箱中缺氧處理30 min。丙泊酚組在缺氧處理后立即吸出原培養(yǎng)基，加入終濃度為50 μmol/L 的丙泊酚新培養(yǎng)基；對(duì)照組和缺氧組換等體積的新培養(yǎng)基，放回37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h[7]。

1.3.3 MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率孵育2 h 后，取各組細(xì)胞加入胰蛋白酶-EDTA 處理液進(jìn)行消化，將消化后的細(xì)胞加入1.5 mL EP 管，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，用培養(yǎng)基將EP 管底部細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)。取96孔板加入各組細(xì)胞（180 μL/孔，5 000個(gè)細(xì)胞），并設(shè)置調(diào)零孔（無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基、MTT、Formazan 溶解液），以上每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。各孔中加入90 μL無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，吸去上清液，各孔加入110 μL Formazan 溶解液，搖床上震蕩10 min 使孔中結(jié)晶物質(zhì)完全溶解[8]。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的吸光值（optical density, OD）。按照公式：神經(jīng)元存活率=樣品孔OD 值/對(duì)照組OD 值×100%，計(jì)算各組神經(jīng)元存活率。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率加入胰蛋白酶-EDTA 處理液消化細(xì)胞，1 200 r/min 離心5 min收集細(xì)胞，用PBS 洗 滌細(xì)胞2 次，1 200 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，吸去PBS 加 入100 μL Bingding Buffer 將細(xì)胞重懸，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI Staining Solution，輕搖混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min，加入400 μL Bingding Buffer 混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率[9]。

1.3.5 比色法檢測(cè)神經(jīng)元SOD 活性和MDA 含量用胰蛋白酶-EDTA處理液消化各組細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min后棄上清液，加入1 mL提取液，在超聲機(jī)中破碎細(xì)胞，具體參數(shù)：200 W，3 s/次，超聲30次，間隔10 s，冰浴下進(jìn)行。5 000 r/min 離心10 min，取上清液，檢測(cè)SOD 活性和MDA 含量[10]。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢 測(cè)cPKCγ、GAP-43 mRNA 的表達(dá)取1.3.2 中細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，提取細(xì)胞中總RNA，42℃、10 min 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。cPKCγ 正向引物序列：5'-GCCGTACCAATAACAT-3'，反向引物序列：5'-CAGATACATGACATAG-3'，長度411 bp； GAP-43 正向引物序列： 5'-GTTACATAGCATAAGAC-3'，反向引物序列：5'-TAACATAGCATTGACAT-3'，長度138 bp。以βactin 作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 Western blotting 檢測(cè)cPKCγ、GAP-43 蛋白的表達(dá)吸去各組細(xì)胞培養(yǎng)基，分別加入200 μL 細(xì)胞裂解液，用移液器吸頭混合15 min，吸出至1 mL EP管中，4℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度。向每個(gè)細(xì)胞裂解物樣品中加入上樣緩沖液800 μL，100℃煮沸5 min，加入12% SDS-PAGE 凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（厚0.22 μm）上，5%脫脂牛奶封閉1 h。4℃條件下1∶500 稀釋的兔抗大鼠cPKCγ、GAP-43 單抗孵育過夜，TBST 緩沖液沖洗膜，HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗孵育2 h[11]。在Odysse 系統(tǒng)下觀察蛋白條帶，并用Image J 軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析，以β-actin 為內(nèi)參蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SSPS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離體培養(yǎng)神經(jīng)元鑒定結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，神經(jīng)元胞漿及突觸呈棕褐色，細(xì)胞形態(tài)良好且飽滿，軸突清晰，神經(jīng)元生長狀況良好。見圖1。

圖1 培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)元（免疫組織化學(xué)染色×400）

2.2 3組海馬神經(jīng)元存活率比較

對(duì)照組、缺氧組、丙泊酚組海馬神經(jīng)元存活率分別為（100.00±0.00）%、（68.83±1.16）%和（80.17±1.66）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=910.339，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組相比，缺氧組和丙泊酚組海馬神經(jīng)元存活率降低（P＜0.05）；與缺氧組比較，丙泊酚組海馬神經(jīng)元存活率升高（P＜0.05）。

2.3 3組海馬神經(jīng)元凋亡率比較

對(duì)照組、缺氧組、丙泊酚組海馬神經(jīng)元凋亡率分別為（7.18±0.11）%、（11.31±1.11）%和（9.02±0.19）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.157，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組相比，缺氧組和丙泊酚組海馬神經(jīng)元凋亡率升高（P＜0.05）；與缺氧組比較，丙泊酚組海馬神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05）。

2.4 3組海馬神經(jīng)元SOD活性和MDA含量比較

對(duì)照組、缺氧組、丙泊酚組海馬神經(jīng)元SOD 活性和MDA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組相比，缺氧組和丙泊酚組海馬神經(jīng)元SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 含量增加（P＜0.05）；與缺氧組相比，丙泊酚組海馬神經(jīng)元SOD 活性升高（P＜0.05），MDA 含量減少（P＜0.05）。見表1。

表1 3組海馬神經(jīng)元SOD活性、MDA含量比較 （±s）

表1 3組海馬神經(jīng)元SOD活性、MDA含量比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組缺氧組丙泊酚組F 值P 值MDA/（μmol/L）0.31±0.07 0.56±0.12①0.40±0.09①②8.777 0.004 SOD/（KU/mL）25.41±2.71 5.86±1.03①16.57±2.13①②111.083 0.000

2.5 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、缺氧組、丙泊酚組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組比較，缺氧組和丙泊酚組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與缺氧組相比，丙泊酚組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表2。

表2 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組缺氧組丙泊酚組F 值P 值GAP-43 mRNA 1.33±0.19 0.61±0.10①1.10±0.16①②28.291 0.000 cPKCγ mRNA 1.07±0.21 0.58±0.08①0.81±0.11①②14.401 0.001

2.6 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、缺氧組、丙泊酚組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組相比，缺氧組和丙泊酚組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與缺氧組比較，丙泊酚組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ、GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與缺氧組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組缺氧組丙泊酚組F 值P 值GAP-43蛋白1.17±0.21 0.38±0.09①0.81±0.14①②32.681 0.000 cPKCγ蛋白0.84±0.14 0.31±0.05①0.66±0.10①②33.941 0.000

圖2 3組海馬神經(jīng)元cPKCγ，GAP-43蛋白的表達(dá)

3 討論

丙泊酚是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中使用最廣泛的靜脈麻醉劑之一。除麻醉作用外，丙泊酚對(duì)腦缺血大鼠還有神經(jīng)保護(hù)作用。有研究顯示，丙泊酚可以降低NMDA 受體的磷酸化程度，減少興奮的傳遞，從而抑制鈣離子通道開放，導(dǎo)致鈣超載，減輕神經(jīng)元損傷[12]。16～18 d 孕期的胎鼠神經(jīng)系統(tǒng)最為敏感。因此，本研究選取該時(shí)間段的胎鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，并進(jìn)行缺氧處理。

筆者在正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同濃度梯度的丙泊酚，分析其對(duì)正常海馬神經(jīng)元的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μmol/L 丙泊酚可以發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的作用，升高濃度后，神經(jīng)元活性開始降低，因此選取50 μmol/L 作為正式研究濃度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組和丙泊酚組神經(jīng)元存活率降低，凋亡率上升；缺氧神經(jīng)元經(jīng)丙泊酚后處理后，神經(jīng)元存活率升高，凋亡率下降，說明丙泊酚后處理可以保護(hù)神經(jīng)元。既往研究顯示，丙泊酚可以抑制海馬神經(jīng)元凋亡，對(duì)持續(xù)癲癇大鼠模型具有治療作用[13]。丙泊酚后處理還可以減弱谷氨酸誘發(fā)的PC12 細(xì)胞凋亡，緩解細(xì)胞自噬[14]。SOD 是抗氧化酶，可以消除過量氧自由基發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[15]；MDA 是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，兩者對(duì)氧化應(yīng)激具有指示作用[16]。與對(duì)照組比較，缺氧組和丙泊酚組SOD 活性降低，MDA 含量增加；與缺氧組比較，丙泊酚組SOD 活性增加，MDA 含量減少，提示丙泊酚可以提高海馬神經(jīng)元抗氧化能力。有研究顯示，丙泊酚對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠模型具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)可以增加受損心肌細(xì)胞SOD 活性，降低MDA 含量[17]。一定劑量的丙泊酚與二甲雙胍聯(lián)合使用可顯著提高小鼠腦組織SOD 活性并降低血清MDA 含量，促進(jìn)自由基及其代謝物的清除[18]。結(jié)合以上研究與本研究結(jié)果，進(jìn)一步說明丙泊酚后處理可以提高海馬神經(jīng)元抗氧化能力，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧組和丙泊酚組cPKCγ、GAP-43 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低；與缺氧組比較，丙泊酚組cPKCγ、GAP-43 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高。cPKCγ 是經(jīng)典PKC 亞家族的成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍表達(dá)，是參與神經(jīng)保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分[19]。上調(diào)cPKCγ 可以減輕小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺血性損傷。GAP-43 是cPKCγ 的底物，在神經(jīng)元中廣泛表達(dá)。在反應(yīng)性突觸發(fā)生、突觸前末端的生長、軸突形成和再生，以及突觸可塑性的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[20]。有研究顯示中風(fēng)和外傷性腦損傷會(huì)導(dǎo)致GAP-43 下調(diào)[21]，并且上調(diào)GAP-43 的表達(dá)可以改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能，增加海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量[22]。因此結(jié)合本研究結(jié)果，缺氧處理的神經(jīng)元經(jīng)丙泊酚后處理后，可以上調(diào)cPKCγ、GAP-43 mRNA 和蛋白的表達(dá)，減輕缺氧帶來的神經(jīng)損傷。

綜上所述，丙泊酚后處理可以保護(hù)離體培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)元，減輕神經(jīng)損傷程度，該保護(hù)作用可能與激活cPKCγ/GAP-43 信號(hào)通路有關(guān)。這一結(jié)果為臨床治療HIE 提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但丙泊酚激活cPKCγ/GAP-43 信號(hào)通路的具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究闡明。