唐青松 王 麗 徐 娥 劉春艷 肖明飛 肖 昊 吳綺雯 蔣宗勇 易宏波*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；2.貴州大學動物科學學院，動物營養(yǎng)與飼料研究所，貴陽 550025)

仔豬早期斷奶易引起腸道功能受損和生長遲緩，腸道健康問題導致的斷奶后仔豬死亡率為6%～10%，有時甚至高達20%[1]。過去數(shù)十年，科學研究者們對腸道功能的研究主要聚焦于腸黏膜上層(上皮細胞、緊密連接蛋白、黏液素、分泌型免疫球蛋白和抗菌肽等)，然而對腸道黏膜下層細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的變化知之甚少。ECM主要由膠原蛋白(collagen)、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層黏連蛋白(laminin)、肌腱蛋白(tenascin，TN)以及蛋白聚糖/氨基聚糖等組成[2]。其中，膠原蛋白分子通過1/4的錯位排布構(gòu)成纖維狀結(jié)構(gòu)，與ECM分子相互連接構(gòu)成復雜的三維矩陣網(wǎng)絡(luò)[3]，構(gòu)成黏膜下層重要的物理屏障。整合素(integrin)是一種普遍存在于動物細胞表面的跨膜異質(zhì)二聚體，由α和β亞基組成，是ECM之間、細胞與ECM之間的相互識別和黏附的關(guān)鍵分子[4]。ECM為組織形態(tài)提供重要的結(jié)構(gòu)支撐，且參與細胞黏附、趨化、組織修復和維持動物機體正常穩(wěn)態(tài)等生理過程[5]。此外，ECM是宿主細胞和病原體之間的重要屏障，且大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)均在ECM網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的宿主細胞微環(huán)境中進行[6-7]。研究報道，破壞秀麗隱桿線蟲基底膜ECM會加劇上皮細胞自噬[8]。果蠅腸道基底層Ⅳ型膠原蛋白突變會引起腸上皮細胞變性和腸功能異常[9]。此外，小鼠腸道整合素基因的敲除會引發(fā)腸道炎癥[10-11]。由此可見，ECM對動物腸道功能及健康有著重要的調(diào)控作用。然而，ECM在仔豬腸道上的研究還未被引起重視，尤其是仔豬斷奶的關(guān)鍵階段的變化規(guī)律至今還未見相關(guān)報道。因此，本試驗旨在研究不同日齡斷奶仔豬腸道ECM的表達規(guī)律，為斷奶仔豬腸道ECM的調(diào)控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和樣品采集

試驗選用24頭健康和體況相近的21日齡“杜洛克×長白×大白”三元雜交斷奶仔豬，隨機分配到6個欄中，每欄4頭。試驗期間所有仔豬自由采食商品飼糧和自由飲水，免疫程序與保健等程序均保持一致。分別于試驗開始時(斷奶后0 d)、斷奶后7 d、斷奶后14 d、斷奶后28 d從每個重復欄中隨機選擇1頭仔豬進行麻醉后處死。剖開仔豬腹腔后仔細收集近端十二指腸、中段空腸和遠端回腸約1.5 cm的組織樣品，完全浸泡于4%的多聚甲醛中，用于制作Masson染色切片。取近端十二指腸、中段空腸和遠端回腸腸段剪開，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗內(nèi)容物后保存于2 mL凍存管，液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測。

1.2 Masson染色

保存于固定液(4%多聚甲醛)的腸道組織樣品經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟后，切片經(jīng)Masson染液套裝(Servicebio，中國)進行染色，然后脫水和中性樹膠封片成片。使用Axio Scope A1顯微鏡(Zeiss，德國)觀察切片圖像，采用Image-Pro軟件(Media Cybernetics，美國)采集40倍和200倍放大的圖像。

1.3 免疫熒光

Masson染色中制作的蠟塊經(jīng)切片、脫水、抗原修復和畫圈后，用牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)孵育30 min，棄掉封閉液后滴加已稀釋的一抗[Ⅰ型膠原蛋白α2鏈(COL1A2)、Ⅳ型膠原蛋白α2鏈(COL4A2)、Ⅵ型膠原蛋白(collagen Ⅵ)]4 ℃孵育過夜，玻片置于PBS中在脫色搖床上洗滌3次，每次5 min。稍甩干后滴加已稀釋的二抗，室溫孵育50 min，滴加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染液后避光孵育10 min，滴加自發(fā)熒光淬滅劑后沖洗10 min，洗滌3次后的切片用抗熒光淬滅封片劑封片。使用Zeiss LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss，德國)獲取圖像。

1.4 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)說明提取十二指腸、空腸和回腸組織樣品總RNA，用超微量紫外分光光度計NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific，美國)評估總RNA的濃度和純度。將1 μg的總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)逆轉(zhuǎn)錄得到20 μL的第1鏈cDNA，加入180 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水10倍稀釋用于qRT-PCR。qRT-PCR(CFX System，Bio-Rad，美國)體系為10.0 μL：5.0 μL的iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國)，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，4.0 μL的cDNA。擴增程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)。引物序列根據(jù)NCBI中豬的基因序列，使用Primer Premier 5.0(Premier，加拿大)進行設(shè)計，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究檢測的靶基因和管家基因——β-肌動蛋白(β-actin)的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算靶基因的mRNA相對表達量，0 d表達量設(shè)為1.0。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot分析

將大約100 mg的空腸組織樣加入1 mL的放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)裂解液，裂解液中提前加入100×的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。冰上放置30 min，10 000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液。稀釋10倍的上清液使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)檢測蛋白濃度。等量的蛋白中加入5×上樣緩沖液(Biosharp，中國)，100 ℃變性8 min。取大約30 μg的蛋白質(zhì)使用7%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PDVF)膜上，使用5%BSA封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h。一抗COL1A2(ab96723)、COL4A2(ab125208)、Ⅵ型膠原蛋白(ab6588)、層黏連蛋白(ab11575)、纖維黏連蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)(ab6328)和β-肌動蛋白(ab8226)購至Abcam公司。使用Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad，美國)檢測蛋白條帶，采用ImageJ軟件(National Institutes of Health，美國)分析條帶蛋白灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用最小顯著性(LSD)法進行多重比較，結(jié)果以“平均值和標準誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡斷奶仔豬腸道膠原蛋白的分布

本試驗使用Masson染色分析了斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的膠原蛋白纖維分布情況。結(jié)果表明，十二指腸中膠原蛋白纖維主要存在于腸黏膜下層，呈纖維狀穿插于彌散淋巴組織之間，黏膜上層膠原蛋白纖維含量較少(圖1)；空腸膠原蛋白纖維主要分布于腸黏膜下層，腸黏膜上層有少量膠原蛋白纖維存在(圖2)；回腸具有比十二指腸和空腸更加豐富的膠原蛋白纖維，整體呈樹狀且主要分布于集合淋巴結(jié)之間(圖3)。

0 d：斷奶后0 d；7 d：斷奶后7 d；14 d：斷奶后14 d；28 d：斷奶后28 d。下圖同。

圖2 斷奶仔豬空腸膠原纖維Masson染色

2.2 不同日齡斷奶仔豬十二指腸ECM相關(guān)基因的表達規(guī)律

如圖4所示，與0 d相比，7、14和28 d斷奶仔豬十二指腸COL1A2、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(COL3A1)、COL4A2、Ⅴ型膠原蛋白α1鏈(COL5A1)、Ⅵ型膠原蛋白α1鏈(COL6A1)和肌腱蛋白C(TNC)的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)；28 d十二指腸COL1A2和COL3A1的mRNA相對表達量極顯著高于14 d(P<0.01)；14 d十二指腸COL3A1的mRNA相對表達量顯著低于7 d(P<0.05)。與0 d相比，7和14 d斷奶仔豬十二指腸FN1和整合素α1(ITGA1)的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，28 d十二指腸FN1和ITGA1的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；28 d十二指腸FN1的mRNA相對表達量顯著高于14 d(P<0.05)。與0 d相比，14 d斷奶仔豬十二指腸整合素β2(ITGB2)的mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)；14和28 d十二指腸ITGB2的mRNA相對表達量分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)高于7 d。

圖3 斷奶仔豬回腸膠原纖維Masson染色

與0 d相比，數(shù)據(jù)柱標記*表示差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標記**表示差異極顯著(P<0.01)；#表示7、14和28 d之間差異顯著(P<0.05)，##表示7、14和28 d之間差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 不同日齡斷奶仔豬空腸ECM相關(guān)基因的表達規(guī)律

如圖5所示，與0 d相比，7 d斷奶仔豬空腸COL1A2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，14和28 d空腸COL1A2的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)；7、14和28 d空腸COL3A1的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，且28 d空腸COL3A1的mRNA相對表達量顯著低于7 d(P<0.05)；7和14 d空腸COL4A2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，且28 d空腸COL4A2的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)；7 d空腸COL5A1和COL6A1的mRNA相對表達量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)降低，28 d空腸COL5A1和COL6A1的mRNA相對表達量顯著高于7 d(P<0.05)；14和28 d空腸FN1的mRNA相對表達量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)降低，且28 d空腸FN1的mRNA相對表達量顯著低于7 d(P<0.05)；28 d空腸TNC和ITGB2的mRNA相對表達量極顯著高于7 d(P<0.01)，且28 d空腸ITGB2的mRNA相對表達量極顯著高于14 d(P<0.01)；7和14 d空腸ITGA1的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，28 d空腸ITGA1的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，且顯著低于7和14 d(P<0.05)。

圖5 斷奶仔豬空腸ECM相關(guān)基因的表達規(guī)律

2.4 不同日齡斷奶仔豬回腸ECM相關(guān)基因的表達規(guī)律

如圖6所示，與0 d相比，7 d斷奶仔豬回腸FN1的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，且14 d和28 d回腸FN1的mRNA相對表達量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)高于7 d。斷奶仔豬回腸COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1、TNC、ITGA1和ITGB2的mRNA相對表達量在各個時間點之間均無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 斷奶仔豬回腸ECM相關(guān)基因的表達規(guī)律

2.5 不同日齡斷奶仔豬空腸ECM相關(guān)蛋白的表達規(guī)律與免疫熒光分析

不同腸段中，斷奶對仔豬十二指腸ECM相關(guān)蛋白的影響最大，其次是空腸，對回腸影響最小。本試驗采用空腸組織測定ECM相關(guān)蛋白的表達規(guī)律，如圖7所示，與0 d相比，14和28 d斷奶仔豬空腸COL1A2、COL4A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，7 d空腸COL1A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白相對表達量分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)降低；14和28 d空腸層黏連蛋白的蛋白相對表達量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)降低，且28 d空腸層黏連蛋白的蛋白相對表達量顯著低于7 d(P<0.05)；14和28 d空腸FN1的蛋白相對表達量極顯著降低(P<0.01)，且14 d空腸FN1的蛋白相對表達量顯著低于7 d(P<0.05)。

3 討 論

ECM為組織形態(tài)提供重要的結(jié)構(gòu)支撐，且參與細胞黏附、趨化、組織修復和維持機體正常穩(wěn)態(tài)等生理過程。研究報道，ECM的過度沉積會導致腸道纖維化、炎癥以及癌細胞轉(zhuǎn)移增加等病理現(xiàn)象[5,12-14]。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)腅CM有助于動物的腫瘤免疫[15-16]。因此，ECM是斷奶仔豬腸道功能的重要評價指標。本試驗結(jié)果顯示，斷奶會降低仔豬十二指腸和空腸膠原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型膠原蛋白)、FN1、層黏連蛋白、TNC、ITGA1和ITGB2的表達和分泌，并且降低了斷奶后7 d回腸FN1的表達。

膠原蛋白是ECM的主要組成成分，占哺乳動物體內(nèi)總蛋白的25%～35%[17]。迄今為止，脊椎動物已發(fā)現(xiàn)28種不同類型的膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白是動物最豐富的膠原蛋白，約占總膠原蛋白的90%[17-18]。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型和Ⅵ型膠原蛋白是典型的纖維形成膠原蛋白，能夠組裝形成具有特征性的1/4交錯排列的纖維矩陣網(wǎng)絡(luò)[3]。Ⅳ型膠原蛋白是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膠原蛋白，負責穩(wěn)定整體ECM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3]。本試驗利用Masson染色分析了斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的膠原蛋白纖維分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)十二指腸、空腸和回腸中膠原蛋白纖維主要分布于腸黏膜下層，腸黏膜上層膠原蛋白纖維分布較少，且回腸具有比十二指腸和空腸更加豐富的膠原蛋白纖維，整體呈樹狀且主要分布于集合淋巴結(jié)之間。本試驗空腸的免疫熒光顯示，COL1A2主要呈小點狀分布于腸道黏膜上層，COL4A2呈纖維狀分布于腸黏膜下層，而Ⅵ型膠原蛋白在腸黏膜上層和下層均有較多分布，我們猜測Ⅵ型膠原蛋白可能是仔豬腸道中存在的主要膠原蛋白類型。Ⅵ型膠原蛋白是由3條不同的α鏈組成的三聚體，具有獨特的微纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3]；Ⅵ型膠原蛋白中還存在參與蛋白質(zhì)互作的von Willebrand結(jié)構(gòu)域[19]，但其具體的生物學功能至今仍然還未見報道。

A為空腸蛋白條帶；B、C、D、E和F依次分別為COL1A2、COL4A2、Ⅵ型膠原蛋白、層黏連蛋白和FN1的蛋白條帶灰度值分析；G為空腸免疫熒光，圖片放大倍數(shù)為200。

膠原蛋白能夠調(diào)節(jié)動物腸道形態(tài)和腸道屏障功能，并在腸道組織免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[20]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型膠原蛋白突變會引起果蠅腸上皮細胞變性、腸功能腸道障礙和形態(tài)異常[9]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后7、14和28 d十二指腸COL4A2、COL5A1和COL6A1的mRNA相對表達量均極顯著降低，且COL1A2和COL3A1的mRNA相對表達量均在斷奶后14 d最低，呈現(xiàn)出隨著時間的推移先降低后升高的趨勢。在空腸中，COL1A2、COL3A1和COL4A2的mRNA相對表達量均隨著斷奶后時間的推移而更為顯著降低，但COL5A1和COL6A1的mRNA相對表達量在斷奶后7 d最低，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。研究報道，對160個豬場的12 034頭仔豬進行28 d的統(tǒng)計調(diào)查發(fā)現(xiàn)，斷奶后3～4 d仔豬開始腹瀉，斷奶后7～9 d腹瀉最為嚴重，斷奶后21 d仍然有很高的腹瀉率[21]。這與本試驗?zāi)c道膠原蛋白的變化較為一致，尤其是十二指腸中的COL1A2和COL3A1和空腸中的COL5A1和COL6A1的mRNA表達變化，這可能是導致ECM變化的一個重要原因。然而，仔豬斷奶對回腸膠原蛋白mRNA表達沒有顯著性影響，這可能與回腸末端組織較為鈍化有關(guān)。此外，空腸COL1A2、COL4A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白表達結(jié)果顯示，仔豬斷奶后7～28 d空腸COL1A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白相對表達量均顯著降低，而空腸COL4A2的蛋白相對表達量僅在斷奶后14和28 d顯著降低，這與基因表達結(jié)果基本相似。以上結(jié)果表明，斷奶應(yīng)激可能會降低斷奶仔豬空腸膠原蛋白的表達和分泌。

FN和層黏連蛋白是ECM的重要組成部分，屬于非膠原糖蛋白，它們具有既可與細胞結(jié)合，又可與ECM其他大分子結(jié)合的共同特點[3]。TNC是一種六聚體大分子ECM糖蛋白，是動物組織炎癥、機械應(yīng)變、損傷和形成之間的匯聚節(jié)點[22-23]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后十二指腸FN1和TNC的mRNA相對表達量顯著降低，斷奶后14和28 d空腸FN1的mRNA相對表達量顯著降低，回腸FN1的mRNA相對表達量在斷奶后4 d降到最低后在14和28 d恢復到未斷奶時的水平?？漳cFN1蛋白表達與mRNA表達結(jié)果趨勢相似。另外，本研究還檢測了層黏連蛋白的蛋白表達，其相對表達量同樣是在斷奶后14和28 d顯著降低。以往研究表明，F(xiàn)N1的表達上調(diào)會通過增加甲基化而降低蛋白酪氨酸磷酸酶受體M型，進而導致轉(zhuǎn)錄蛋白信號轉(zhuǎn)導器和激活子3磷酸化增加，促進惡性膠質(zhì)腫瘤細胞增殖[24]。此外，TNC被成纖維細胞和免疫細胞廣泛分泌會引起動物炎癥疾病[25]，且通過激活細胞因子參與組織損傷[26]。即使目前大多研究表明，F(xiàn)N1、層黏連蛋白和TNC的表達增多會導致組織損傷和腫瘤等疾病，但本試驗中膠原蛋白、FN1、層黏連蛋白和TNC的表達在斷奶后卻降低了，這提示斷奶仔豬腸道ECM的降低另有其因，這仍需未來加以深入研究。

整合素是ECM分子之間和ECM與細胞之間的重要連接分子。整合素是具有二聚體的跨膜蛋白，一端連接胞內(nèi)的微絲，另一端跨膜連接胞外已固定在膠原蛋白纖維上的FN[27]。ITGA1和ITGB2是整合素的2個重要配體。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斷奶后7～28 d十二指腸ITGA1的mRNA相對表達量均顯著降低，但斷奶后14 d十二指腸ITGB2的mRNA相對表達量卻顯著提高。此外，斷奶后7～28 d空腸ITGA1的mRNA相對表達量均顯著降低，斷奶沒有引起空腸ITGB2的mRNA表達的變化，但相比斷奶后28 d與7 d和14 d相比極顯著提高。以往研究表明，敲除小鼠整合素基因會引起腸道炎癥和腸通透性增加[11]。此外，整合素與FN、層黏連蛋白等ECM相關(guān)蛋白在限制和促進豬流行性腹瀉病毒感染中具有重要調(diào)控作用[28]。由此可見，整合素與ECM分子相互依存并發(fā)揮屏障和免疫調(diào)控作用，這與本試驗?zāi)z原蛋白和FN、層黏連蛋白和TNC的表達較為一致。

4 結(jié) 論

① 不同日齡斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸中膠原蛋白纖維主要分布于腸黏膜下層，腸黏膜上層膠原蛋白纖維分布較少，且回腸具有比十二指腸和空腸更加豐富的膠原蛋白纖維。

② 仔豬斷奶后十二指腸和空腸的膠原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型膠原蛋白)、FN1、層黏連蛋白、TNC、ITGA1和ITGB2的表達和分泌降低；十二指腸COL1A2、COL3A1和FN1的mRNA相對表達量在斷奶后14 d降到最低，空腸COL5A1和COL6A1的mRNA相對表達量在斷奶后7 d降到最低；仔豬斷奶后7 d回腸FN1的mRNA相對表達量顯著降低，但斷奶對其他ECM相關(guān)基因表達無顯著影響。