曹依敏, 周 恒, 蘭 嵐, 苗 水, 胡 青,毛秀紅, 張紅梅, 季 申*,
(1. 上海中醫(yī)藥大學 中藥學院,上海 201203;2. 上海市食品藥品檢驗研究院,上海 201203)
生物堿 (alkaloid) 是指主要來源于植物界的一類含氮有機化合物,多呈堿性,具有顯著的抗腫瘤、抗菌消炎等生物活性,是中藥材中重要的有效成分之一[1]。延胡索 Rhizoma Corydalis,又稱元胡,是罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T. Wang 的干燥塊莖[2]。黃連 Rhizoma Coptidis,是毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall. 的干燥根莖[2]。黃柏Cortex Phellodendri,是蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮[2]。這3 種中藥材作為典型含生物堿類中藥材在臨床廣泛使用,近幾年對其需求量迅速增長,規(guī)?;斯しN植已成為其主要獲取方式。在種植過程中發(fā)生病蟲害,需要使用農(nóng)藥進行防治,但超劑量、超范圍使用農(nóng)藥的現(xiàn)象較為普遍,給中藥材農(nóng)藥殘留安全防控帶來嚴峻挑戰(zhàn)[3-4]。因此,有必要建立適用于含生物堿類中藥材的農(nóng)藥多殘留快速篩查方法,以保證其用藥安全。
目前中藥材中農(nóng)藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-8],其中串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于靈敏度高、選擇性好,在中藥材農(nóng)藥殘留檢測中應用范圍較為廣泛[9-11]。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜一般采用多反應監(jiān)測掃描模式,但受限于分辨率和掃描速率,在復雜中藥樣本分析中仍可能受到基質(zhì)干擾成分影響,出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。近幾年,高分辨質(zhì)譜 (HRMS) 技術(shù)快速發(fā)展,已廣泛應用于蔬菜水果[12-14]、豆類雜糧[15]、辣椒粉[16]、茶葉[17]以及葡萄酒[18]等食品基質(zhì)的農(nóng)藥殘留風險監(jiān)測,而將HRMS 應用于中藥材中農(nóng)藥多殘留檢測分析的報道相對較少[19-22]。靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜具有高分辨率和高質(zhì)量精度等特點,采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴型二級掃描模式 (Full MS/ddMS2),可同時獲得目標物母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)等質(zhì)譜信息,具有更強的抗基質(zhì)干擾能力,并能實現(xiàn)非目標物的回溯分析,對復雜基質(zhì)的農(nóng)藥殘留高通量快速篩查具有更廣闊的應用前景。
本研究針對含生物堿類中藥材的基質(zhì)特點,通過改良QuEChERS 前處理方法,首次引入陽離子交換型吸附劑作為分散固相萃取凈化填料,以去除生物堿類等干擾物質(zhì),結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 (UPLC-Q-Orbitrap HRMS) 建立了3 種含生物堿類中藥材中193 種農(nóng)藥殘留的定性定量檢測方法。
超高效液相色譜-四極桿/靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀:Acquity 超高效液相色譜儀 (美國Waters 公司) + Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜儀 (美國Thermo 公司);Agilent 1260 型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司);KS 260 control 振蕩器 (德國IKA 公司);MINI VORTEXER 渦旋儀 (美國Fisher Scientific 公司); MULTIVAP 113 型氮氣吹干儀 (美國OI-SYS公司); SQP/CP224S/CP225D型電子天平 (德國Sartorius 公司)。
193 種農(nóng)藥標準品 (德國Dr. Ehrensterfer GmbH 公司或德國Sigma-aldrich 公司);QExactive 高分辨質(zhì)譜儀正離子模式校正液 (美國Thermo 公司);甲醇 (質(zhì)譜級,德國Merck 公司);甲酸 (質(zhì)譜級,美國Fisher Scientific 公司);甲酸銨 (質(zhì)譜級,美國Sigma 公司);乙腈、甲醇、丙酮 (色譜級,美國Fisher Scientific 公司);冰醋酸和無水硫酸鎂 (分析純,國藥集團化學試劑有限公司);提取管:6 g 無水硫酸鎂與1.5 g 無水醋酸鈉的混合粉末 (北京迪馬科技有限公司);凈化填料:十八烷基硅烷鍵合硅膠 (C18) (40~60 μm)、N-丙基乙二胺 (PSA) (40~60 μm)、硅膠 (40~60 μm)(天津博納艾杰爾科技有限公司),Oasis MCX 混合型強陽離子交換反相吸附劑 (美國Waters 公司);去離子水 (經(jīng)Milli-Q Advantage A10 過濾,美國Millipore 公司)。
色譜條件:Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 (3.0 mm × 150 mm,2.7 μm);洗脫程序:流動相A 為含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨水溶液,流動相B 為含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0~1 min,95% A;>1~4 min,95%~40% A;>4~8 min,40%~36% A;>8~8.5 min,36%~32% A;>8.5~9 min,32%~25% A;>9~16 min,25%~5% A;>16~20 min,5% A。流速0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進樣體積5 μL。
質(zhì)譜條件:電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+);監(jiān)測方式為 Full MS / ddMS2模式;電噴霧電壓3.5 kV;毛細管溫度325 ℃;S-lens RF level:55.0;鞘氣48;輔助氣11;吹掃氣2;輔助氣溫度325 ℃。一級質(zhì)譜參數(shù):分辨率為70 000 FWHM,自動增益控制為3 e6,最大注入時間為200 ms,掃描范圍m/z70~1 050。二級質(zhì)譜參數(shù):分辨率為17 500 FWHM,自動增益控制為1 e5,最大注入時間為60 ms,loop count 為4,隔離窗口為3.0m/z,歸一化碰撞能量為20、40、60,母離子強度關(guān)聯(lián)觸發(fā)閾值為8.3 e4,apex trigger 時間窗為2~6 s,動態(tài)排除時間為5.0 s。
取3 g (精確至0.01 g) 粉碎 (過三號篩) 的樣品至50 mL 離心管中,加入1%的冰醋酸溶液(1%為體積分數(shù),下同) 15 mL,渦旋、浸泡30 min。準確加入乙腈15 mL,置于振蕩器上劇烈振蕩10 min。加入6 g 無水硫酸鎂與1.5 g 無水醋酸鈉的混合粉末,立即搖散,再置于振蕩器上劇烈振蕩5 min。于冰浴中冷卻10 min,離心 (3 900 r/min)5 min。取9 mL 上清液,置于預先裝有凈化填料的固相萃取凈化管 (無水硫酸鎂900 mg,PSA 300 mg,C18300 mg,硅膠 600 mg,MCX 150 mg)中,渦旋使充分混勻,再置于振蕩器上劇烈振蕩10 min,離心 (3 900 r/min) 5 min。取5 mL 上清液,在氮氣吹干儀上于40 ℃水浴濃縮至約0.5 mL,用50%甲醇定容至2 mL,渦旋使混勻,高速離心(10 000 r/min) 10 min。取上清液,即為空白基質(zhì)溶液,待測。
1.4.1 標準儲備溶液 稱取適量農(nóng)藥標準品,根據(jù)農(nóng)藥標準品的不同性質(zhì)分別用乙腈、甲醇或丙酮配制成1 000 mg/L 的單一標準儲備溶液,于-20 ℃保存。
1.4.2 混合標準溶液 分別吸取一定體積的各單一標準儲備溶液于100 mL 容量瓶中,用乙腈定容,得到1 000 μg/L 的混合標準溶液,于4 ℃保存。
1.4.3 標準工作溶液 分別量取5、10、50、100 及200 μL 的1 000 μg/L 混合標準溶液,先分別用乙腈補足體積至500 μL 后,再用50%甲醇定容至2 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、25、50 及100 μg/L 的標準工作溶液。按1.2 節(jié)的條件測定,以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標 (x),峰面積為縱坐標 (y),權(quán)重為1/x,繪制溶劑標準曲線。
1.4.4 基質(zhì)匹配混合標準工作溶液 按1.3 節(jié)的方法制備空白基質(zhì)溶液,氮吹至0.3 mL 以下,分別加入5、10、50、100 及200 μL 的混合標準溶液,先用乙腈補足體積至500 μL 后,再用50%甲醇定容至2 mL,于10 000 r/min 下離心10 min,取上清液,即得質(zhì)量濃度分別為2.5、5、25、50 及100 μg/L的基質(zhì)匹配混合標準工作溶液。按1.2 節(jié)的條件測定,以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標 (x),峰面積為縱坐標 (y),權(quán)重為1/x,繪制基質(zhì)匹配標準曲線。
向延胡索、黃連和黃柏空白基質(zhì)溶液中分別添加193 種農(nóng)藥混合標準溶液,添加水平分別為10、50 和100 μg/kg,每個水平6 次重復,按1.2 節(jié)的條件測定,計算平均回收率及相對標準偏差 (RSD)。參考歐盟農(nóng)藥殘留指導原則SANTE/12682/2019 進行評價,將實際最低添加水平作為定量限 (LOQ)[23]。
基質(zhì)效應 (Me) 作為質(zhì)譜定量分析中影響方法正確度、精密度和靈敏度的主要問題之一[24],本研究通過比較各農(nóng)藥化合物基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比評價Me,計算公式為:Me/%=[(基質(zhì)匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率)-1] × 100,Me>20% 為基質(zhì)增強效應,-20%≤Me≤20% 為基質(zhì)效應不明顯,Me<-20%為基質(zhì)抑制效應[25]。
使用TraceFinder 4.1 數(shù)據(jù)處理軟件 (美國Thermo 公司) 對原始采集數(shù)據(jù)進行處理,并配合Excel 2019 進行數(shù)據(jù)匯總和分析。
本研究采用Full MS/ddMS2掃描模式,一級質(zhì)譜全掃描,同時設定目標物列表,采用自動觸發(fā)二級質(zhì)譜模式,獲得各農(nóng)藥化合物的母離子及碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間等質(zhì)譜信息。農(nóng)藥標準品溶液按1.2 節(jié)的條件測定,建立了193 種農(nóng)藥的標準數(shù)據(jù)庫 (表1)。為了保證母離子及碎片離子的準確度,母離子選擇各農(nóng)藥化合物響應強度最高的母離子加合形式,一般為[M + H]+或[M + NH4]+,而對于乙酰甲胺磷等容易發(fā)生源內(nèi)裂解的農(nóng)藥化合物,選擇響應強度高的源內(nèi)裂解離子作為母離子。碎片離子優(yōu)先選擇響應強度高、質(zhì)量數(shù)大于90 的離子,同時采用Mass Frontier 4.1 軟件或人工推導得到碎片離子的理論精確質(zhì)量數(shù),以避免實測值帶來的二次質(zhì)量偏差。
表1 193 種農(nóng)藥高分辨質(zhì)譜標準數(shù)據(jù)庫及定量限Table 1 The In-House compound database and LOQs of 193 pesticides
為提高篩查效率,降低假陽性率,保證篩查結(jié)果的準確性,農(nóng)藥殘留的確證參數(shù)參考歐盟農(nóng)藥殘留指導原則SANTE/12682/2019,陽性結(jié)果必須滿足以下條件:與標準數(shù)據(jù)庫中目標化合物的母離子及碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差 ≤5 ppm (若m/z< 200,則精確質(zhì)量數(shù)偏差 <1 mDa),至少檢出1 個碎片離子,保留時間窗口為 ± 0.15 min[23]。
續(xù)表1Table 1 (Continued)
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2.2.1 分散固相萃取 (d-SPE) 凈化填料的優(yōu)化 生物堿類中藥材中含有大量生物堿、甾體類、有機酸以及糖類等干擾成分。本研究考察了MCX、C18、PSA 和硅膠4 種凈化填料對延胡索、黃連和黃柏的凈化程度。結(jié)果 (圖1) 表明:MCX 作為混合型強陽離子交換、水可浸潤聚合物吸附劑,具有離子交換和反相保留雙重保留模式,對堿性化合物具有較高的選擇性和靈敏度,凈化3 種基質(zhì)中生物堿類干擾成分明顯,凈化效果最顯著;硅膠可以去除極性較大的含氮化合物以及糖類等干擾物,凈化效果次之;PSA 和C18對基質(zhì)凈化影響較小,但為了減少對儀器的污染,依然選擇使用PSA 和C18以去除有機酸及部分弱極性干擾物。最終選擇MCX、硅膠、PSA 和 C18作為凈化填料。
圖1 不同凈化填料的凈化效果 (延胡索)Fig. 1 Purification effect of different adsorbents(Rhizoma Corydalis)
固定無水硫酸鎂 900 mg、PSA 300 mg 和C18300 mg,比較了硅膠用量 (300、600 和900 mg) 對凈化效果的影響。結(jié)果表明:與用量300 mg 相比較,600 mg 與900 mg 的用量使得大部分農(nóng)藥響應明顯上升,用量600 mg 與900 mg 效果相近,最終選擇硅膠用量為600 mg。固定上述4 種凈化填料,比較了MCX 用量 (0、90、150 和250 mg)對凈化效果的影響。結(jié)果表明:MCX 加入量過多,農(nóng)藥會被吸附,導致回收率下降,計算所有農(nóng)藥的回收率 (圖2),當MCX 為150 mg 時,延胡索、黃連和黃柏中分別有98.5%、94.9% 和96.4%的農(nóng)藥回收率為70%~120%,符合農(nóng)藥殘留方法學驗證規(guī)定[23]。因此d-SPE 的最終配比為:無水硫酸鎂900 mg,PSA 300 mg,C18300 mg,硅膠 600 mg,MCX 150 mg。
圖2 不同MCX 用量下回收率在70%~120%之間的農(nóng)藥數(shù)量占比Fig. 2 Proportion of pesticides with recovery rate of 70%-120% under different MCX content
2.2.2 定容溶劑的優(yōu)化 高通量農(nóng)藥殘留篩查,液相色譜流動相條件初始比例一般溶劑強度較小,定容溶劑的溶劑強度如果太大,會造成峰形改變等強溶劑效應,為改善保留時間前端農(nóng)藥化合物的峰形,對定容溶劑進行了優(yōu)化,分別比較了乙腈、V(乙腈) :V(水) =1 : 1 及V(乙腈) :V(甲醇) :V(水) =2 : 3 : 3。結(jié)果 (圖3) 表明:V(乙腈) :V(甲醇) :V(水) =2 : 3 : 3 效果最佳,在該條件下3 種基質(zhì)中193 種農(nóng)藥的提取離子流圖見圖4。
圖3 不同定容溶劑下乙酰甲胺磷提取離子流圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of acephate using different injection solvents
圖4 3 種基質(zhì)中193 種農(nóng)藥母離子提取離子流圖Fig. 4 Extracted ion chromatogramsion of precursor ions of 193 pesticides
2.3.1 基質(zhì)效應 結(jié)果表明:193 種農(nóng)藥化合物中,延胡索、黃連和黃柏中分別有27.5%、99.0%和95.5%的農(nóng)藥顯示基質(zhì)抑制效應,因此采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。
2.3.2 線性關(guān)系 結(jié)果表明:除吡蟲啉可能與黃連中某些堿性物質(zhì)發(fā)生反應導致無響應外,其余農(nóng)藥化合物線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù) (r) 均大于0.99。
2.3.3 添加回收率及定量限 (LOQ) 結(jié)果表明:在10、50、100 μg/kg 3 個添加水平下,193 種農(nóng)藥 (包括4 組同分異構(gòu)體),在延胡索中的平均回收率為58%~120%,RSD 為0.4%~16.6%,其中190 種 (98.4%) 農(nóng)藥LOQ 為10 μg/kg,3 種 (1.6%)農(nóng)藥LOQ 為50 μg/kg;在黃連中的平均回收率為68%~124%,RSD 為0.5%~19.6%,除吡蟲啉外,其中165 種 (85.5%) 農(nóng)藥LOQ 為10 μg/kg,22 種(11.4%) 農(nóng)藥LOQ 為50 μg/kg,5 種 (2.6%) 農(nóng)藥LOQ 為100 μg/kg;在黃柏中的平均回收率為73%~122%,RSD 為0.7%~18.9%,其中168 種(87.0%) 農(nóng)藥LOQ 為10 μg/kg,23 種 (11.9%) 農(nóng)藥LOQ 為50 μg/kg,2 種 (1.0%) 農(nóng)藥LOQ 為100 μg/kg。其中氯磺隆添加回收率偏低,可能是由于其水溶性較大,且在酸性條件下不穩(wěn)定所致;MCX 吸附作用較強也可能導致某些農(nóng)藥添加回收率降低,如抗蚜威和去乙基另丁津等農(nóng)藥僅在基質(zhì)成分相對簡單的延胡索中回收率較低 (分別為58%和69%),而在另外2 種基質(zhì)中回收率在102%~108%之間。定量限詳見表1。
參考《中國藥典》2020 年版四部[26]中33 種禁限用農(nóng)藥的限量標準規(guī)定范圍 (0.01~0.2 mg/kg)以及GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]中對藥用植物的最大殘留限量規(guī)定范圍 (0.01~20 mg/kg),本方法建立的LOQ 值可滿足3 種含生物堿類中藥材中農(nóng)藥殘留限量標準的要求。
采用本方法對藥材種植基地收集及藥店購買的33 批延胡索、7 批黃連以及5 批黃柏樣品進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):農(nóng)藥總檢出率為64.4%,共檢出29 種農(nóng)藥,檢出率較高的農(nóng)藥為多效唑、吡蟲啉、敵敵畏、啶酰菌胺和苯醚甲環(huán)唑等。40.0%的樣品同時檢出2~8 種農(nóng)藥,其中1 批延胡索檢出11 種農(nóng)藥,提示3 種含生物堿類中藥材中存在多農(nóng)藥殘留污染的風險。多效唑在11 批延胡索樣品中被檢出,檢出量最高達0.11 mg/kg,參照 GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]大豆中多效唑的限量要求 (0.05 mg/kg) 進行評判,1 批樣品超過限量規(guī)定,提示延胡索存在使用植物生長延緩劑的安全風險;4 批延胡索樣品檢出吡蟲啉,參照GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]貝母 (干) 的限量要求 (0.2 mg/kg),1 批樣品超過限量規(guī)定;1 批黃柏和2 批黃連中檢出敵敵畏,參照GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]調(diào)味料的限量要求 (0.1 mg/kg),1 批黃連超過限量規(guī)定;在部分樣品中檢出克百威、毒死蜱等高毒禁限用農(nóng)藥,提示亟需進一步加強中藥材種植中農(nóng)藥的使用管理規(guī)范。表2 僅列出樣品檢出超過0.05 mg/kg 的測定結(jié)果。
表2 實際樣品測定結(jié)果Table 2 Determination results of pesticides in real samples
本研究建立了一種基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)對3 種含生物堿類中藥材中193 種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法。該方法前處理簡便快速、凈化效果好、可操作性強,并可在較短時間內(nèi)完成高通量的數(shù)據(jù)采集,檢測目標農(nóng)藥化合物靈敏且準確度高。該方法可實現(xiàn)含生物堿類中藥材中多農(nóng)藥殘留的日常風險監(jiān)測,也可為其他復雜中藥材基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的定性定量分析提供研究思路。