劉鑫軍， 魏洪杰

( 1. 河北政法職業(yè)學(xué)院 生態(tài)工程系， 石家莊 050061； 2. 石家莊市城市水系園林中心， 石家莊 050061 )

土壤氮(N)的有效性是影響陸地生態(tài)系統(tǒng)中植物生長(zhǎng)和土壤生物化學(xué)的重要因素(巨曉棠，2014)。全球N沉降正在改變土壤N有效性及影響著生態(tài)系統(tǒng)土壤的N循環(huán)(廖珂等，2021；吳玉鳳等，2019)，包括N礦化、硝化以及NO排放，這可能導(dǎo)致陸地N供需失衡、面源污染以及溫室氣體排放等環(huán)境問(wèn)題(李海霞等，2021)。土壤微生物作用被認(rèn)為是影響N循環(huán)過(guò)程的主要驅(qū)動(dòng)力，但關(guān)于N循環(huán)的微生物作用核心過(guò)程對(duì)N沉降的響應(yīng)以及與N轉(zhuǎn)化的關(guān)系少有報(bào)道。

氮功能基因(nitrogen function genes，NFGs)可直接編碼關(guān)鍵酶從而影響氮循環(huán)過(guò)程，是表征氮生物轉(zhuǎn)化功能的直接指標(biāo)(廖李容等，2019)。以往關(guān)于NFGs的研究主要集中于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和亞熱帶森林系統(tǒng)。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)施氮對(duì)N固定基因()豐度沒(méi)有顯著影響，但增加了硝化基因()和反硝化基因(、、)的相對(duì)豐度，其主要受氮形態(tài)和土壤pH調(diào)控(Ouyang et al., 2018)。而在亞熱帶森林土壤中，N添加降低了等N固定基因和等反硝化基因豐度，而增加了反硝化基因豐度(Tian et al., 2019)。與亞熱帶森林和農(nóng)業(yè)土壤相比，北方寒溫帶森林土壤養(yǎng)分相對(duì)貧乏、氮輸入低、降水量少以及溫度波動(dòng)較大(Tian et al., 2019)，因此可能形成不同的微生物群落結(jié)構(gòu)從而對(duì)氮轉(zhuǎn)化的影響存在差異。然而，目前關(guān)于氮添加對(duì)寒溫帶森林土壤NFGs的影響卻鮮有報(bào)道。

近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在森林生態(tài)系統(tǒng)氮的轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了一系列研究，初步揭示了氮添加情況下非生物和生物因素對(duì)特定氮轉(zhuǎn)化過(guò)程(即硝化、礦化和NO排放)的驅(qū)動(dòng)機(jī)制(Chelsea et al., 2016)。在所有的NFGs中，影響硝化限速步驟的基因、影響反硝化第一步的基因以及影響限速步驟的基因通常被認(rèn)為是控制N轉(zhuǎn)化的樞紐因子(Ouyang et al., 2018；Chelsea et al., 2016)，且發(fā)現(xiàn)土壤有效磷、pH以及溶解性氮是影響NFGs豐度的主要因素，這表明土壤性質(zhì)和微生物功能在氮素轉(zhuǎn)化中起著重要作用，即外源氮添加可直接影響土壤性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)氮轉(zhuǎn)化過(guò)程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響(Wang et al., 2017)。但二者在多大程度上作用于氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程，以及影響氮素轉(zhuǎn)化的主導(dǎo)因素尚不清楚。因此，N添加能否介導(dǎo)土壤NFGs表達(dá)，從而影響相關(guān)N轉(zhuǎn)化過(guò)程?土壤N轉(zhuǎn)化過(guò)程與NFGs、土壤性質(zhì)三者間的相關(guān)關(guān)系如何?這些問(wèn)題都嚴(yán)重制約著人們對(duì)樟樹(shù)人工林土壤氮轉(zhuǎn)化及其影響作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究以河北省塞罕壩樟子松人造林為研究對(duì)象，采用功能基因微陣GeoChip 5.0系統(tǒng)及室內(nèi)土壤培養(yǎng)法，通過(guò)分析不同氮添加水平對(duì)土壤性質(zhì)、NFGs及其氮轉(zhuǎn)化過(guò)程參數(shù)的影響，擬探討不同氮添加水平條件下NFGs和土壤性質(zhì)對(duì)樟子松人工林氮素轉(zhuǎn)化的相對(duì)貢獻(xiàn)以及影響相關(guān)氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵因素，以期為樟子松人工林的氮肥管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)地處大興安嶺山系與冀北山地交匯處，位于河北省圍場(chǎng)滿族蒙古族自治縣北部的塞罕壩機(jī)械林場(chǎng)千層板林場(chǎng)內(nèi)(17°39′42″ E、42°35′45″ N)。該林場(chǎng)于1962年建成，人工林面積20 029.8 hm，是我國(guó)樟子松種群的主要人造林區(qū)，林分密度1 300～1 600株，該人工林自建成以來(lái)每8—10年進(jìn)行一次采伐及補(bǔ)種。該區(qū)域?qū)贉貛Т箨懶园敫珊蛋霛駶?rùn)氣候區(qū)，全年氣候冬季漫長(zhǎng)，低溫寒冷，春秋季短暫，干燥多風(fēng)，該區(qū)域的平均環(huán)境氮沉降水平為3.34 g N·m·a。試驗(yàn)區(qū)海拔高度為1 432 m，年均降水量為454.2 mm，年均日照時(shí)數(shù)為2 368.8 h，年均蒸發(fā)量為1 244.9 mm，年均相對(duì)濕度為75.3%，年均氣溫為-1.4 ℃。土壤類型主要為風(fēng)沙土，主要成土母質(zhì)為風(fēng)積物、殘積物、堆積物。林下灌木、草本稀疏，以瓣蕊唐松草()、腺毛委陵菜()、地榆()、大披針薹草()為主。

1.2 樣地設(shè)置與樣品采集

2018年3月選擇樹(shù)苗年限為12年的樣點(diǎn)，設(shè)置4個(gè)氮素處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，共16個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積均為6 m×6 m，小區(qū)之間設(shè)置4 m的緩沖帶。氮素以硝酸銨(NHNO)溶液的形式在四個(gè)氮水平下添加：0(N0)，1(N1)，5(N5)和10(N10) g N·m·a，與該地的自然氮沉降速率(3.34 g N·m·a)相比，N1，N5和N10處理分別代表了低、中和高氮沉降量。每次施用將對(duì)應(yīng)NHNO稀釋于10 L蒸餾水中，在2018年6月至2020年6月隔兩個(gè)月施氮一次，施用時(shí)間均為月初約早上10:30，并保證該施用時(shí)間前后15 h無(wú)下雨情況，試驗(yàn)期間共施12次。對(duì)于N0處理，采用等體積的蒸餾水噴灑樣地，施用時(shí)間及方式與氮素添加處理相同。

2020年6月20日(晴天)，使用不銹鋼土壤螺旋鉆(長(zhǎng)20 cm，直徑6 cm)從表土(0～20 cm)收集土壤樣本，取樣前去除表層凋落物，在每個(gè)樣地隨機(jī)選取5個(gè)取土點(diǎn)土壤匯集成一個(gè)樣本，保存于無(wú)菌聚乙烯袋中，將樣品快速儲(chǔ)存含干冰的泡沫箱，并快速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。所有土壤樣本去除殘根、凋落物和礫石后分為3部分：第一部分保存于4 ℃，用于測(cè)定微生物生物量和溶解營(yíng)養(yǎng)物以及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；第二部分樣品風(fēng)干后進(jìn)行土壤基礎(chǔ)理化分析；第三部分立即保存于-80 ℃環(huán)境采用功能基因微陣GeoChip 5.0系統(tǒng)定量分析土壤NFGs相對(duì)豐度。

1.3 樣品分析

1.3.1 土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定 土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定參照鮑士旦(2000)所述測(cè)定。土壤pH值測(cè)定：稱取10.00 g風(fēng)干土壤于50 mL燒杯中，加入蒸餾水(水∶土=2.5∶1)，間歇攪拌30 min，靜置15 min后采用奧豪斯ST3100/F型pH計(jì)進(jìn)行酸堿值測(cè)定。土壤有機(jī)碳(soil organic carbon，SOC)測(cè)定：稱取過(guò)0.149 mm篩孔的風(fēng)干土0.500 0 g放入150 mL三角瓶中，加入粉末狀A(yù)gNO0.10 g，精確加入0.8 mol·L重鉻酸鉀(KCrO)溶液和濃硫酸各5 mL，瓶口加蓋小漏斗，置于230 ℃電砂浴中加熱15 min，采用0.1 mol·L的硫酸亞鐵溶液還原滴定法測(cè)定SOC含量?？偟?total nitrogen，TN)測(cè)定：稱取0.500 0 g風(fēng)干土壤放入凱氏瓶中，加入適量蒸餾水濕潤(rùn)樣品，加入8 mL濃硫酸，在通風(fēng)櫥中消解至淡藍(lán)色，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀(KDN-520，杭州綠博儀器有限公司)測(cè)定。全磷(TP)測(cè)定：稱取0.25 g風(fēng)干土壤于鎳坩堝，加入3滴無(wú)水乙醇，在樣品上平鋪2 g NaOH，將坩堝放入高溫電爐400 ℃、15 min，采用75 ℃蒸餾水洗滌坩堝并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，吸取消化的母液5 mL至50 mL容量瓶中，加入蒸餾水稀釋至30 mL，加入二硝基酚3滴，加入鉬銻抗顯色劑5 mL，定容至刻度，采用紫外分光光度計(jì)(T-6M，上海菲勒儀器有限公司)在700 nm處測(cè)定。有效磷(available phosphorus，AP)的測(cè)定：稱取0.25 g風(fēng)干土樣于200 mL帶瓶蓋的塑料瓶中，加入50 mL的0.5 mol·LNaHCO，恒溫(25 ℃)振蕩浸提30 min，采用無(wú)磷濾紙過(guò)濾，吸取濾液5 mL并加入鉬酸銨使用液5 mL和氯化亞錫試劑1滴，顯色15 min后借助紫外分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)定。土壤銨態(tài)氮(NH-N)和硝態(tài)氮(NO-N)測(cè)定：稱取5.00 g風(fēng)干土放入離心管中，加入25 mL、2 mol·L的KCl振蕩浸提(120 r·min、2 h)，振蕩結(jié)束后高速離心8 000 r·min、15 min，靜置后過(guò)濾，取兩份濾液，一份加入鹽酸-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液用于測(cè)定NO-N，另一份加入苯酚鈉-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液用于測(cè)定NH-N，二者皆采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(SmartChem 200，AMS/Alliance, Italy)測(cè)定。溶解性有機(jī)碳(dissolved organic carbon，DOC)測(cè)定：稱取20.0 g風(fēng)干土樣于帶蓋的150 mL塑料瓶中，加入60 mL、5 g·L偏磷酸鈉，以轉(zhuǎn)速為120 r·min往復(fù)振蕩18 h，振蕩懸浮物放置于60 ℃環(huán)境下烘干48 h，借助TOC自動(dòng)分析儀(TOC-LCPH，Shimadzu，Japan)測(cè)定DOC。總?cè)芙庑缘?total dissolved nitrogen，TDN)測(cè)定：稱取5.00 g風(fēng)干土于50 mL帶蓋的塑料瓶中，加入25 mL、1 mol·L氯化鉀溶液，以轉(zhuǎn)速為180 r·min，往復(fù)振蕩1 h，振蕩懸浮物靜置10 min后過(guò)濾于50 mL容量瓶中，取8 mL濾液加入10 mL過(guò)硫酸鉀氧化劑氧化15 min，采用連續(xù)流動(dòng)自動(dòng)分析儀測(cè)定TDN濃度。溶解性有機(jī)氮(dissolved organic nitrogen，DON)以TDN — (NH-N + NO-N)計(jì)算(吉恒寬等，2020)。稱取40%田間持水量的新鮮土壤70.0 g于80 mL的燒杯中，將燒杯放入真空干燥器中，同時(shí)放入裝滿氯仿的同規(guī)格燒杯，采用熏蒸抽真空裝置抽為真空狀態(tài)，在-0.07 MPa真空下使氯仿劇烈沸騰5 min，重復(fù)該步驟直至氯仿熏蒸完全；將熏蒸土壤轉(zhuǎn)移至塑料瓶中，加入100 mL、0.5 mol·L硫酸鉀溶液振蕩(25 ℃、300 r·min)浸提30 min，懸浮物過(guò)濾，取兩份10 mL濾液，一份加入10 mL六偏磷酸鈉溶液用于測(cè)定微生物生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)，另一份置于消煮管中，加入5 mL濃硫酸消化，回流3 h，用于測(cè)定微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)，二者均采用TOC自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3.2 土壤凈氮轉(zhuǎn)化和NO排放速率測(cè)定 凈氮轉(zhuǎn)化分為凈氮硝化速率()和凈氮礦化速率()，皆通過(guò)培養(yǎng)14 d的土壤樣品測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，每個(gè)樣本采用40.00 g土壤置于500 mL的聚乙烯瓶(高8 cm，直徑6 cm)中，保持60%的土壤含水率，在25 ℃的恒溫黑暗培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)6 d，之后在相同的環(huán)境條件下正式培養(yǎng)14 d。在培養(yǎng)的第1、第7、第14 d分別對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行土壤取樣，測(cè)定樣品無(wú)機(jī)氮濃度。和(mg N kg·d)計(jì)算參照王子龍(2021)的方法，(mg N kg·d)=培養(yǎng)后硝態(tài)氮(NO-N)含量 - 培養(yǎng)前硝態(tài)氮(NO-N)含量/培養(yǎng)時(shí)間。(mg N kg·d)=培養(yǎng)后無(wú)機(jī)氮(NH-N + NO-N)含量-培養(yǎng)前無(wú)機(jī)氮(NH-N + NO-N)含量/培養(yǎng)時(shí)間。

通過(guò)平行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定NO排放速率。所有的聚乙烯瓶都覆蓋一層無(wú)菌透氣的有機(jī)膜，以防止水分流失和保持通氣。使用Picarro G2508型氣體濃度分析儀(Picarro G2208 Environment, Picarro Inc., CA, USA)在培養(yǎng)期的第1、第3、第5、第7和第14天測(cè)定NO排放速率(馬芬等，2015)。在測(cè)量NO排放速率前密封乙烯培養(yǎng)罐12 h，NO 排放速率(μg·kg·d)通過(guò)12 h密閉期中NO濃度的變化計(jì)算。

1.3.3 土壤微生物NFGs功能基因測(cè)定 利用GeoChip 5.0功能微陣列系統(tǒng)對(duì)微生物NFGs的綜合序列進(jìn)行測(cè)定分析，該系統(tǒng)是一個(gè)分析微生物群落功能基因的高通量平臺(tái)。GeoChip 5.0包含N57000個(gè)寡核苷酸探針，覆蓋了N373基因家族中144 000多個(gè)基因序列，可以檢測(cè)比qPCR更廣泛的基因類型，現(xiàn)已用于不同的微生物功能和生物地球化學(xué)過(guò)程(盧慧等，2018)。

將每個(gè)處理的土壤樣品解凍后，稱取0.50 g土壤樣本中使用PowerSoil試劑盒(MoBio,Carlsbad,USA)進(jìn)行DNA提取。各樣點(diǎn)土壤取3組平行樣品。DNA純度和數(shù)量分別使用分光光度計(jì)和截面讀取系統(tǒng)(FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech, Jena, Germany)檢測(cè)。將檢測(cè)合格的DNA樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記、芯片雜交、芯片掃描與成像(Li et al., 2017)?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)每組皆進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

基因芯片具體步驟如下，采用Cy-3熒光染料隨機(jī)引物標(biāo)記，采用QIA純化試劑盒(QIAGEN QUICK Purification Kit, Roche NimbleGen Inc, USA)純化熒光標(biāo)記后的DNA，并將標(biāo)記成功的DNA樣品采用干燥旋轉(zhuǎn)儀(Savant SVC200, Thermo Savant, Holbrook, NY, USA)在45 ℃條件下干燥45 min。接著在標(biāo)記濃縮后的DNA樣品加入120 μL雜交緩沖液(40%甲酰胺、0.1%十二烷基硫酸鈉、10 μg未標(biāo)記的DNA、2×SSC)，待完全溶解后90 ℃變性5 min，50 ℃保存30 min，在MAUI雜交平臺(tái)40 ℃進(jìn)行雜交16 h。采用NimbleGen MS200微陣列掃描儀(Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI, USA)對(duì)雜交后的芯片在633 nm上掃描微陣列。掃描得到的圖像由Imagene 6.0軟件對(duì)掃描圖像進(jìn)行轉(zhuǎn)換、提取及信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。

數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理包括片間歸一化和去假陽(yáng)性。把各個(gè)樣本光強(qiáng)總和調(diào)整為同一批次光強(qiáng)最高樣本水平。去除信噪比小于2.0的低質(zhì)量點(diǎn)。將信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)化，最后轉(zhuǎn)化為自然對(duì)數(shù)數(shù)字信息(Zhang et al., 2017)。上述NFGs功能基因分析委托上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加對(duì)樟子松人工林土壤理化性質(zhì)的影響

從圖1可知，連續(xù)兩年的N添加顯著改變了部分土壤的理化性質(zhì)。從單個(gè)土壤指標(biāo)來(lái)看，土壤NO-N和DON濃度隨著N添加水平的增加而增加，皆以N10處理值最大，且顯著大于N0處理(<0.05)。隨著氮添加水平的提高土壤NH-N含量呈下降趨勢(shì)，但各處理間均無(wú)顯著差異。SOC、MBC以及C/N隨著N添加水平的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，同時(shí)皆表現(xiàn)為N5處理具有最大值；DOC含量隨著N添加水平的提高亦呈降低趨勢(shì)，以N1處理值最大。其他土壤性質(zhì)中，各處理的MBN、TN、TP、AP和pH差距較小，處理間皆均無(wú)顯著差異。

不同小寫(xiě)字母表示不同處理間有顯著性差異(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05). The same below. 圖 1 氮添加對(duì)樟子松人工林土壤理化性質(zhì)的影響Fig. 1 Effects of nitrogen addition on soil physical and chemical properties of Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.2 氮添加對(duì)樟子松人工林氮功能基因(NFGs)相對(duì)豐度的影響

從圖2可知，N的添加顯著改變了部分NFGs的相對(duì)豐度。就單個(gè)NFG基因的相對(duì)豐度來(lái)看，N養(yǎng)分固定基因()和反硝化基因()是NFGs豐度值最大的兩個(gè)基因，分別占總豐度的16.69%～18.03%和17.42%～18.98%。同時(shí)，較未施氮處理(N0)相比，N1處理顯著增加了參與硝化過(guò)程的-和-基因(編碼單氧化銨酶)、參與反硝化作用的基因(編碼亞硝酸還原酶)、參與同化氮還原的基因(編碼硝酸還原酶)、參與異化氮還原的基因(編碼硝酸還原酶輔酶Ⅱ)的相對(duì)豐度；N5處理顯著增加了參與氨化的基因(編碼脲酶)、-、、以及的相對(duì)豐度。同樣，N10處理中，除了參與氨氧化物的基因(編碼谷氨酸合酶)與其他處理無(wú)顯著差異外，其余NFGs的相對(duì)豐度皆顯著下降。

圖 2 氮添加對(duì)樟子松人工林氮功能基因(NFGs)相對(duì)豐度的影響 Fig. 2 Effects of nitrogen addition on the relative abundance of nitrogen functional genes (NFGs) in Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.3 氮添加對(duì)樟子松人工林氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程N(yùn)FGs總豐度的影響

由圖3可知，就各氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程的NFGs總相對(duì)豐度來(lái)看，微生物對(duì)氮素反硝化、固氮、氨化的過(guò)程影響最大，三者豐度總和占總NFGs豐度的73.7%以上。從試驗(yàn)處理豐度值來(lái)看，在反硝化、固氮、氨化、厭氧氨氧化、硝化、同化氮還原及異化氮還原7個(gè)氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除厭氧氨氧化的N10與N0無(wú)顯著差異外，其他各過(guò)程皆以N10處理顯著小于其他處理，且各處理氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程呈N5>N1>N0>N10的趨勢(shì)，且N0與N1之間均無(wú)顯著差異。

圖 3 氮添加對(duì)樟子松人工林各氮轉(zhuǎn)化過(guò)程N(yùn)FGs相對(duì)豐度的影響 Fig. 3 Effects of nitrogen addition on the relative abundance of NFGs in each nitrogen transformation process of Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.4 氮添加對(duì)樟子松人工林 土壤凈N硝化速率、凈N礦化和N2O排放速率的影響

由表1可知，與N0處理相比，兩年的氮添加顯著增加了N1和N5凈N硝化、凈N礦化和NO的排放速率，三者在N5處理時(shí)達(dá)到最大值，之后在N10處理時(shí)下降，N10處理與N0處理均沒(méi)有顯著差異。與N0處理相比，添加氮后凈N硝化、礦化和NO的排放速率均有不程度提高，凈N硝化率、礦化和NO排放速率在加入氮后分別增加了18.62%～57.41%、10.95%～49.88%和1.69%～28.55%。

表 1 氮添加對(duì)樟子松人工林土壤凈N硝化速率、凈N礦化率和N2O排放速率的影響Table 1 Effects of nitrogen addition on soil net N nitrification rate, net N mineralization rate and N2O emission rate in Pinus sylvestris var. mongolica plantation

2.5 氮添加下樟子松人工林土壤氮轉(zhuǎn)化NFGs豐度與土壤因子的相關(guān)分析

從表2可知，12個(gè)土壤理化性質(zhì)指標(biāo)與固氮、氨化、硝化、反硝化等7個(gè)氮素轉(zhuǎn)化指標(biāo)的相關(guān)分析中，土壤因子TN、TP、NO-N、DOC中與某一氮轉(zhuǎn)化過(guò)程N(yùn)FGs豐度存在顯著相關(guān)性，其余土壤因子與其任一氮轉(zhuǎn)化過(guò)程N(yùn)FGs豐度均無(wú)顯著相關(guān)性。就TN而言，TN與硝化、同化氮還原、異化氮還原過(guò)程指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)。TP與異化氮還原NFGs豐度呈顯著正相關(guān)。在NO-N與DOC的土壤指標(biāo)中，DOC與固氮、氨化、反硝化、同化氮還原、異化氮還原呈顯著正相關(guān)，NO-N與固氮、氨化、硝化、反硝化、同化氮還原、異化氮還原、厭氧氨氧化的NFGs豐度皆呈顯著正相關(guān)。

2.6 土壤凈N硝化速率、凈N礦化和N2O排放速率與NFGs、土壤性質(zhì)的相關(guān)分析

由表3可見(jiàn)，相關(guān)系數(shù)表明凈氮硝化速率()、凈氮礦化率()和NO排放速率()與部分NFGs的相對(duì)豐度和土壤性質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)。整體來(lái)看，與、-、、的相對(duì)豐度以及土壤SOC、NO-N、MBC、MBC含量呈顯著正相關(guān)，其中MBC和SOC與的相關(guān)性較強(qiáng)。凈氮礦化率()與參與氮循環(huán)過(guò)程的NFGs，如、、、-、、、、、以及土壤SOC、MBC含量呈顯著正相關(guān)，但與MBC含量和的相關(guān)性比與其他因素的相關(guān)性更密切。與除和基因無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系外，與其他所有硝化和反硝化基因相對(duì)豐度均呈極顯著相關(guān)，與土壤SOC、MBC含量呈極顯著正相關(guān)，其中-、與更密切。

2.7 土壤凈氮轉(zhuǎn)化和N2O排放速率與NFGs、土壤性質(zhì)的回歸分析

由表4可見(jiàn)，基于逐步多元回歸分析表明，-相對(duì)豐度和土壤MBC含量是影響凈N硝化速率()的主導(dǎo)因子，回歸分析的決定系數(shù)()值為0.64(<0.001)。、相對(duì)豐度和土壤MBC含量是影響凈N礦化率()的主導(dǎo)因子，回歸分析的值為0.75(<0.001)；相對(duì)豐度和相對(duì)豐度是影響NO排放速率()的主導(dǎo)因子，回歸分析的值為0.69(<0.001)。

3 討論

適量的氮(N)添加可以緩解生態(tài)系統(tǒng)中的氮素限制，為微生物的生長(zhǎng)和基礎(chǔ)代謝提供底物和能量，從而激發(fā)土壤養(yǎng)分有效性、提高微生物的功能活性(Li et al., 2017)。本研究地點(diǎn)位于塞罕壩人工林場(chǎng)，該區(qū)域已被證實(shí)氮儲(chǔ)備較低(任艷林，2012)，因此N添加可能對(duì)該區(qū)域的養(yǎng)分底物有效性產(chǎn)生影響。本研究中，不同氮水平對(duì)不同指標(biāo)影響不一，隨著氮素添加水平的提高，土壤SOC、MBC、DOC則呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)土壤由于過(guò)量添加N而使土壤N飽和時(shí)，土壤養(yǎng)分的分配可能會(huì)因此受到影響而降低，即N添加水平存在一定閾值。在為期2年的試驗(yàn)中，各處理的土壤pH為7.62～7.76，處理間無(wú)明顯差異，且與NFGs的相對(duì)豐度沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，說(shuō)明本研究中土壤pH對(duì)NFGs影響較弱。這可能是由于土壤具有較高的緩沖能力(江軍等，2019)或與其他微生物的共同作用(例如叢枝菌根菌絲作用)的結(jié)果(曹本福等，2021)；此外，在TN、TP、AP、MBN中各處理亦無(wú)明顯差異，這可能是因?yàn)?年的氮添加試驗(yàn)時(shí)間較短，不能對(duì)其土壤肥力產(chǎn)生全面質(zhì)變影響的緣故(Ouyang et al., 2016)。

在本研究中，基于GeoChip 5.0微陣列系統(tǒng)探索了參與氮轉(zhuǎn)化過(guò)程關(guān)鍵基因的相對(duì)豐度，結(jié)果表明：中低N添加處理(N1、N5)對(duì)所有NFGs皆表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，尤其體現(xiàn)在氨化、硝化和反硝化相關(guān)基因，而高N添加(N10)顯著降低了所有NFGs的相對(duì)豐度。

在氨化循環(huán)的相關(guān)基因中，N1和N5處理中的相對(duì)豐度顯著增加，同時(shí)在N5處理達(dá)到峰值，在N10顯著下降，且谷氨酰胺合成基因()和厭氧氨氧化基因()豐度保持不變，這反映了氮素在達(dá)到飽和臨界狀態(tài)從而向礦化轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)(Zhang et al., 2019)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在N1和N5處理下的沒(méi)有明顯增加，這與前人的研究結(jié)果一致，即施氮對(duì)的相對(duì)豐度沒(méi)有影響(Berthrong et al., 2014)。這可能是由于在環(huán)境中獲得的N為有效態(tài)(NH-N、NO-N)，因此不需要額外的能量代謝投入(Zheng et al.,2017)。

在參與硝化過(guò)程的相關(guān)基因中，氮添加處理(N1、N5)顯著增加了-和-的相對(duì)豐度，這與Szukics(2012)在溫帶森林中的研究結(jié)果趨于一致，這意味著區(qū)域氣候影響不是主導(dǎo)硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)因子。此外，本研究發(fā)現(xiàn)硝化過(guò)程的總基因豐度與土壤TN、NO-N呈顯著正相關(guān)(表2)，表明N添加引起的土壤N含量增加可提高硝化基因豐度。值得注意的是，在所有處理中-的豐度皆明顯高于-。前人研究表明-受具有核糖體的功能微生物所介導(dǎo)，因此在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境或適量增加N情況下其相對(duì)豐度較高。而-與銨具有較高的親和力，對(duì)氮限制或氮飽和環(huán)境具有更好的耐受性(Ouyang et al., 2019)。因此，研究區(qū)域中-在豐度數(shù)值上比-更大， 同時(shí)-對(duì)N的增加反應(yīng)更敏感，這與農(nóng)業(yè)土壤中的觀測(cè)結(jié)果相似(宋延靜等，2020)。

表 4 NFGs、土壤因子與凈N硝化速率，凈N礦化率和N2O排放速率的逐步多元回歸分析Table 4 Stepwise multiple regression analysis of NFGs, soil factor and net N nitrification rate, net N mineralization rate and N2O emission rate

在反硝化的相關(guān)功能基因中，N1和N5處理顯著增加了的相對(duì)豐度，但其他反硝化基因的相對(duì)豐度幾乎不變，本研究結(jié)果與前人在森林系統(tǒng)中得到的研究結(jié)果不同。前人研究表明、和豐度隨著N添加的增加而大幅度提升，和對(duì)N添加不敏感(Tang et al., 2016)。兩者研究結(jié)果不同的原因可能與反硝化作用的步驟順序有關(guān)，硝酸鹽是反硝化的起始底物，其濃度的變化顯著影響的表達(dá)；隨著反硝化的進(jìn)行，由于植物吸收或N發(fā)生氣態(tài)流失使得硝酸鹽濃度降低(劉躲等，2020)，因此可能會(huì)弱化N添加對(duì)和的影響(Chen et al., 2012)。此外，在本研究中，反硝化基因的相對(duì)豐度與NO-N、DOC呈顯著正相關(guān)，這與Wang等(2017)研究結(jié)論的和相對(duì)豐度與SOC、NO-N含量呈正相關(guān)的結(jié)果趨于一致。這可能是參與反硝化作用的微生物大多是異養(yǎng)型，因而更多的依賴于有機(jī)物。

土壤氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程主要表現(xiàn)為硝化、礦化和NO排放，是表征氮素供給及氮損失的重要表征(林偉等，2020)。本研究發(fā)現(xiàn)，中、低N添加顯著提高了凈氮硝化速率()、凈氮礦化率()和NO排放速率()，但在高N處理(N10)中上述指標(biāo)均有所下降。和是反映土壤無(wú)機(jī)氮庫(kù)凈變化的直接指標(biāo)，是有機(jī)物質(zhì)分解、礦化、硝化和固定過(guò)程相互作用的重要表現(xiàn)(Chen et al., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)與相關(guān)N轉(zhuǎn)化過(guò)程的核心基因顯著相關(guān)。逐步回歸多元分析表明，-的相對(duì)豐度和MBC含量是影響的關(guān)鍵因素，且相關(guān)性分析表明-與之間具有顯著相關(guān)性，因此-可能是半干旱人工林生態(tài)系統(tǒng)中驅(qū)動(dòng)土壤硝化的主要基因(Zhang et al., 2019；Tang et al., 2019)。此外，逐步回歸多元分析顯示，、豐度和MBC含量是影響的重要參數(shù)，表明與有機(jī)氮礦化和反硝化過(guò)程密切相關(guān)。同理，與參與硝化和反硝化過(guò)程的NFGs顯著相關(guān)，與反硝化途徑基因和密切相關(guān)，表明反硝化是溫帶森林土壤中NO釋放的主要途徑，而、與顯著正相關(guān)，這意味著豐度可作為估算Re排放的有效參數(shù)(Flaa et al., 2019)。

4 結(jié)論

本研究表明，中、低氮添加水平(1、5 g N·m·a)對(duì)氮功能基因(NFGs)的總相對(duì)豐度沒(méi)有顯著影響，但增加了氨化、硝化和反硝化等特定基因的相對(duì)豐度。高N添加處理(N10)中，所有氮轉(zhuǎn)化過(guò)程的NFGs相對(duì)豐度皆顯著降低。這些影響主要與土壤C、N養(yǎng)分指標(biāo)(SOC、NO-N、DON)的變化有關(guān)，而與pH無(wú)關(guān)。相關(guān)分析表明，上述促進(jìn)作用與土壤SOC、NO-N和MBC顯著相關(guān)。N10處理顯著降低了所有氮轉(zhuǎn)化過(guò)程N(yùn)FGs的相對(duì)豐度，這種負(fù)面影響與DOC、MBC含量的減少有關(guān)。與氮轉(zhuǎn)化基因豐度規(guī)律趨勢(shì)相似，N1和N5處理顯著增加了凈N硝化、凈N礦化以及NO的排放速率，但N10促進(jìn)作用不明顯，表明氮添加對(duì)氮轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用存在閾值。此外，逐步多元回歸分析表明，-的相對(duì)豐度和MBC含量可作為凈N硝化率的關(guān)鍵預(yù)測(cè)指標(biāo)；、的相對(duì)豐度與MBC含量可作為凈氮礦化率的關(guān)鍵預(yù)測(cè)指標(biāo)；而、的相對(duì)豐度可作為NO排放速率的關(guān)鍵預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果為樟子松人工林的氮肥管理提供了理論依據(jù)。