一株稻田固氮藍(lán)藻的分離鑒定及其鎘耐受和去除能力評(píng)估

張定煌，朱 嫡，李擁軍，蘇增強(qiáng)，李 杰，賀鴻志*

(1.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所，廣東中山 528400；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510000；3.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東清遠(yuǎn) 511500)

鎘(Cd)污染治理是當(dāng)前國(guó)家的重大需求，國(guó)內(nèi)外研究表明微藻可能在Cd污染水體處理方面具有很大潛力。固氮藍(lán)藻是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的微生物資源，自從1889年Franck發(fā)現(xiàn)了固氮藍(lán)藻，到20世紀(jì)末期已得出20多個(gè)屬的150多種藍(lán)藻具有固氮能力。我國(guó)記載了800多種藍(lán)藻，其中有固氮能力的就有70多種。且我國(guó)很早就有將固氮藻類中的葛仙米和發(fā)菜等作為食品和藥物使用的記載，已經(jīng)成了價(jià)格高昂的保健食品。研究表明稻田中接種固氮藍(lán)藻可顯著增產(chǎn)，如在湖北晚稻田中測(cè)得其固氮量為22.5～37.5 kg/hm。隨全球變暖和水體富營(yíng)養(yǎng)化日益嚴(yán)重，固氮藍(lán)藻的農(nóng)業(yè)應(yīng)用和生態(tài)價(jià)值將日益凸顯。同時(shí)，研究表明固氮藍(lán)藻在生物活性物質(zhì)發(fā)掘、新能源開(kāi)發(fā)、功能食品研制和環(huán)境保護(hù)等方面均具有重要的應(yīng)用前景。固氮藍(lán)藻蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成完全，含有豐富的維生素和微量元素，在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中還可分泌出少量的氨基酸、激素等活性物質(zhì)促進(jìn)作物生長(zhǎng)。固氮藍(lán)藻還可以用于環(huán)境污染修復(fù)，并已有利用藻菌結(jié)合體清除石油污染的報(bào)道。一些固氮藍(lán)藻可以用于水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和重金屬的去除。同時(shí)，固氮藍(lán)藻還具有修復(fù)水體農(nóng)藥和染料等污染的潛力。已有很多利用篩選到的固氮藍(lán)藻結(jié)合固定化技術(shù)進(jìn)行了應(yīng)用技術(shù)方面的探索。另外，在我國(guó)西北地區(qū)絲狀固氮藍(lán)藻已被用于荒漠和鹽堿化土壤治理中，并獲得了不錯(cuò)的效果。

國(guó)內(nèi)已有對(duì)湖北、湖南、江西、北京、延邊、西北荒漠區(qū)等地的固氮藍(lán)藻資源的調(diào)查研究，并分離純化了不少固氮藻株，但關(guān)于廣東、廣西、海南等省份固氮藍(lán)藻的研究非常少。現(xiàn)在中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所藻種庫(kù)保存的藻種主要來(lái)自湖北、湖南和江西等亞熱帶地區(qū)，可以預(yù)見(jiàn)屬熱帶、亞熱帶的海南、廣東、廣西部分地區(qū)必定有不少的固氮藍(lán)藻種質(zhì)資源待發(fā)掘，甚至可能會(huì)有某些特殊功能的種類存在。筆者從中山實(shí)驗(yàn)田采集土樣、水樣，然后經(jīng)過(guò)紫外線法、抗生素法將其純化為單一藻株，鑒定出藻種為念珠藻，通過(guò)重金屬Cd對(duì)念珠藻的急性試驗(yàn)，評(píng)估Cd對(duì)念珠藻的生態(tài)毒理效應(yīng)，研究其對(duì)鎘的耐受能力和去除能力。

1 材料與方法

試驗(yàn)所用固氮藍(lán)藻培養(yǎng)基為無(wú)氮BG11(BG11)。除培養(yǎng)基以外，所用的藥品還包括乙醇、(1+1)鹽酸溶液、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二鈉、硼砂、氯化鉀、pH=4.01 標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液、pH=6.87 標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液、pH=9.18標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液、20 mg/L的鎘溶液。

100 mL錐形瓶、50 mL錐形瓶、分光光度計(jì)、TOC 分析儀、往復(fù)式振蕩器、磁力攪拌儀、光照培養(yǎng)箱、微孔濾膜、離心管、試管、燒杯、滴管、移液槍(20 μL、200 μL、1 000 μL、5 mL)、電子天平、4 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、比色皿、各種規(guī)格培養(yǎng)皿、酒精燈、接種環(huán)、高壓滅菌鍋、帶相機(jī)和視頻攝像頭的Olympus倒置顯微鏡、低溫高速離心機(jī)、凍干機(jī)、超凈工作臺(tái)、抽濾裝置、純水機(jī)、酸度計(jì)。

藻的富集培養(yǎng)。將從中山實(shí)驗(yàn)田采集回來(lái)的土樣、水樣取少量放入100 mL錐形瓶中，分別加入40 mL無(wú)氮BG11培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(27±1)℃、光照(2 700±50)lx、光暗比16 h∶8 h。

藻株分離。培養(yǎng)20 d后，將富集培養(yǎng)的藻樣用移液器移取20～50 μL涂布于含BG11的瓊脂固體平板上。等長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的藻后，用接種環(huán)小心挑取，在新的固體培養(yǎng)基上Z字形劃線轉(zhuǎn)接，重復(fù)此操作直到純化出單一藻種為止。分離方法：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將接種環(huán)在酒精燈上灼燒，接種環(huán)除菌后蘸取少許待純化藻類，在無(wú)菌BG11固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或Z字劃線的連續(xù)劃線，用無(wú)菌的Parafilm對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行封口，放在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，用以分離出單個(gè)菌落。待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，在顯微鏡下觀察藻的形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)，看是否為單一藻株，若不是單一藻株，再采用相同的方法或者毛細(xì)管分離法、梯度稀釋法進(jìn)行分離，直至找到單一藻株。

藻種純化。用抗生素、抗菌酮等處理，除菌、純化藻株，具體步驟為先分別在5個(gè)50 mL 錐形瓶中加入BG11培養(yǎng)液 20 mL，經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌后，冷卻，在超凈工作臺(tái)接種2 mL藻株在50 mL錐形瓶中；同時(shí)配制氨芐青霉素、硫酸慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素4 種抗生素的混合濃縮液共10 mL，濃度均為 2 g/L，在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌的一次性過(guò)濾頭和針筒過(guò)濾混合液，裝在預(yù)先滅菌的玻璃錐形瓶中；然后分別取2 g/L的混合抗生素母液10、8、6、4、2 μL加至上述含BG11培養(yǎng)液20 mL的5個(gè)50 mL錐形瓶中，處理 3 d。3 d后離心機(jī)15 ℃、7 000 r/min離心7 min，棄去上清液，隨后沉淀用無(wú)菌水離心清洗3 次，劃平板，用封口膜封口，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)上述操作直至通過(guò)顯微鏡觀察不到明顯的菌生長(zhǎng)。藻株的保存采用固體培養(yǎng)基斜面或平板保種(常溫或低溫)和液體培養(yǎng)基保種相結(jié)合的方法。

藻株的擴(kuò)大培養(yǎng)。在1個(gè) 50 mL錐形瓶中加入BG11培養(yǎng)液20 mL，經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌后，冷卻，在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)從分離純化后的固氮藍(lán)藻培養(yǎng)皿中刮取少量藻株接種到上述錐形瓶中，確保要刮取到藻，然后放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶4～6 次。

采用分子生物學(xué)方法對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行鑒定，通過(guò)選擇有代表性的基因序列片段作為分類標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)分不同生物、同種生物種內(nèi)株系之間的遺傳差異，此方法操作容易、結(jié)果可靠。

將篩選出來(lái)的優(yōu)良藻株用16S rDNA序列分析法進(jìn)行鑒定，即用一對(duì)引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)序確定16S rDNA序列，再通過(guò) Genebank 進(jìn)行 Blast 比較分析確定藻株所屬的屬。在此基礎(chǔ)上，用兩對(duì)引物CX(5′-GGCGCAGGTAAGAAAGGGTTTCGTA-3′)、CW(5′-CGTAGCTTCCGGTGGTATCCAC GT-3′)對(duì)固氮藍(lán)藻基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。通過(guò) Blast比較分析進(jìn)行藻種鑒定。

取8個(gè)50 mL錐形瓶，每個(gè)瓶中裝20 mL的BG11培養(yǎng)基。向錐形瓶中加入不同體積Cd母液(20 mg/L)，使瓶中Cd最終濃度分別為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600和0.800 mg/L。每個(gè)瓶中再加入2 mL培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種液。培養(yǎng)4 d后在超凈工作臺(tái)取3 mL均勻藻液測(cè)OD值，并觀察藻細(xì)胞的變化。

取100 mL錐形瓶，每個(gè)瓶裝40 mL的BG11培養(yǎng)基。向錐形瓶中加入不同體積Cd母液(20 mg/L)，使Cd最終濃度分別為0.1和0.2 mg/L。每個(gè)瓶中再加入2 mL培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24和48 h后取樣抽濾，然后用原子吸收法進(jìn)行Cd濃度的測(cè)定。

取正常生長(zhǎng)和0.2 mg/L Cd處理4 d后的藻液高速離心收集藻細(xì)胞，用凍干機(jī)進(jìn)行凍干。干燥后的樣品用傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Scientific Nicolet IS50，美國(guó))進(jìn)行紅外光譜分析。

采用溴化鉀壓片法，取干藻樣1.5 mg與0.3 g干燥的KBr粉末一起研細(xì)，研磨充分后，將樣品壓成薄片后進(jìn)行測(cè)定。

試驗(yàn)結(jié)果用 Excel 軟件(2013 版)進(jìn)行處理，再利用 SPSS 22.0 中的多因素方差分析(ANOVA)對(duì)測(cè)定項(xiàng)目的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，Duncan’s 檢驗(yàn)(<0.05)比較各處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

無(wú)氮 BG11 培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)富集后，綜合采用多種分離方法，獲得固氮藍(lán)藻的單種培養(yǎng)，最后經(jīng)多種抗生素聯(lián)合處理得到無(wú)菌藻株。純化后藻絲形態(tài)見(jiàn)圖1，由圖1可知，在10×100倍鏡下，藻絲長(zhǎng)，藻細(xì)胞飽滿，具異形胞，異形胞間生，從形態(tài)看屬于念珠藻目藻株(該試驗(yàn)命名為藻D)。

圖1 分離得到的一株具有異形胞的念珠藻Fig.1 A strain of nostoc with heterocysts isolated

對(duì)藻細(xì)胞16S rDNA和基因序列進(jìn)行分析，通過(guò)Genebank進(jìn)行Blast比較分析確定藻株所屬的屬。Blast比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)16S rDNA序列Blast結(jié)果，藻D屬于念珠藻屬。而基因序列Blast結(jié)果表明藻D與sp.NIES-2111親源關(guān)系最近，同源性達(dá)到97%。

表1 藻株的16S rDNA序列和rbcLX基因序列的Blast比對(duì)結(jié)果

對(duì)藻形態(tài)的影響。不同Cd濃度條件下生長(zhǎng)的藻D的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示。由圖2可知，在Cd濃度為0.200 mg/L時(shí)，藻絲開(kāi)始斷裂，并出現(xiàn)扭曲，在Cd濃度為0.600 mg/L時(shí)，念珠藻細(xì)胞被破壞的更加嚴(yán)重，且顏色變淡。

圖2 不同Cd濃度下生長(zhǎng)的藻D在顯微鏡下的微觀形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of algae D grown under different Cd concentrations

對(duì)藻生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)4 d后藻的OD測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，低濃度Cd(0.025 mg/L)顯著促進(jìn)藻生長(zhǎng)；0.050～0.100 mg/L沒(méi)有顯著毒害作用，超過(guò)0.200 mg/L時(shí)顯著抑制藻生長(zhǎng)，說(shuō)明Cd對(duì)藻具有低促高抑的作用。通過(guò)抑制率與Cd濃度作圖，按線性回歸曲線計(jì)算可得出Cd對(duì)藻D的半致死濃度(EC)為0.205 mg/L，毒性較高。

表2 藻對(duì)鎘耐受能力評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，在24 h時(shí)藻D對(duì)Cd的吸附可能已經(jīng)達(dá)到平衡，此時(shí)Cd被藻D吸附的最多，隨著時(shí)間的增加，有的藻已經(jīng)死亡，然后又釋放出部分Cd，所以Cd濃度增加。Cd初始濃度0.200 mg/L處理時(shí)，藻D在24 h對(duì)Cd的去除率達(dá)到最大(33.79%)。

表3 藻對(duì)Cd的去除效果

由圖3可知，在0.200 mg/L鎘的脅迫下，藻D的C—H(2 960～2 850 cm)、C==O(1 690～1 650 cm)和—NH(3 500～3 300 cm)等基團(tuán)吸收峰明顯比對(duì)照降低，推測(cè)鎘與藻細(xì)胞中的部分基團(tuán)結(jié)合。

圖3 Cd對(duì)藻紅外光譜的影響Fig.3 Effect of Cd on the infrared spectrum of algae

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，影響藻類吸附重金屬離子的因素有很多，主要包括微藻濃度的大小、微藻本身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光照、溫度、pH、鹽度、重金屬濃度、試驗(yàn)時(shí)間等。該試驗(yàn)中主要研究了重金屬Cd的濃度為0.100和0.200 mg/L，試驗(yàn)時(shí)間為24和48 h的條件下，該藻對(duì)Cd的吸附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)試驗(yàn)時(shí)間為24 h、Cd濃度為0.200 mg/L時(shí)，該念珠藻對(duì)Cd的去除能力最強(qiáng)，去除率達(dá)到33.79%。已有研究表明，斜生柵藻對(duì)Cd的吸收能力最高，單位吸收率可達(dá)76.9%。由此可見(jiàn)，該念珠藻對(duì)Cd的吸附能力相對(duì)較弱，今后應(yīng)進(jìn)一步分離純化篩選Cd去除能力更強(qiáng)的藻株。

微藻對(duì)重金屬的吸附是一個(gè)復(fù)雜的物化和生化過(guò)程，是多種機(jī)理共同協(xié)作的結(jié)果，主要包括絡(luò)合機(jī)理和離子交換機(jī)理。藻類富含生化和礦物組分，尤其是一些官能團(tuán)，如—OH、—COOH、—SH、—POO和—NH等在吸附過(guò)程中發(fā)揮很大的作用。根據(jù)該試驗(yàn)紅外光譜數(shù)據(jù)顯示，在0.200 mg/L鎘的脅迫下，念珠藻D的C—H、C==O和—NH等基團(tuán)吸收峰明顯比對(duì)照降低，所以認(rèn)為吸附過(guò)程還有其他官能團(tuán)的參與，但是此次試驗(yàn)無(wú)法確定是哪些官能團(tuán)，有待進(jìn)行更深入的研究?，F(xiàn)有研究表明，低濃度的Cd對(duì)藻的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，高濃度的Cd具有抑制藻生長(zhǎng)的作用。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度Cd(0.025 mg/L)顯著促進(jìn)藻生長(zhǎng)；0.050～0.100 mg/L沒(méi)有顯著毒害作用；超過(guò)0.200 mg/L時(shí)顯著抑制藻生長(zhǎng)，說(shuō)明Cd對(duì)藻具有低促高抑的作用。

該研究用分子手段分析結(jié)果表明藻D與sp.NIES-2111親源關(guān)系最近。Cd毒性試驗(yàn)結(jié)果Cd對(duì)藻D的EC值為0.205 mg/L，屬于高毒性。在0.200 mg/L的Cd的脅迫下，藻D的C—H、C==O和—NH發(fā)生改變，說(shuō)明該藻對(duì)Cd的去除能力相對(duì)較弱，今后應(yīng)進(jìn)一步分離純化篩選對(duì)Cd去除能力更強(qiáng)的藻株。