王俊曉 ,安 莉 ,馬 歡 ,許???,馬婧瑋 ,汪 紅 ,吳緒金 ,楊 靜 ,李 萌 *
(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,鄭州 450046;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/河南省糧食質(zhì)量安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450002)
金銀花為常用中藥材之一,主要作用是清熱解毒、疏散風(fēng)熱[1]。近年來(lái),受疫情因素的影響,金銀花的市場(chǎng)需求量進(jìn)一步增大,但隨著人工種植面積的增加,病蟲(chóng)害問(wèn)題更加突顯,尤其是白粉病愈加突出[2]。目前,金銀花種植戶(hù)主要采取化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治,但由于缺乏專(zhuān)業(yè)的培訓(xùn),用藥不規(guī)范,造成作物中農(nóng)藥殘留超標(biāo),加重了對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)身體健康的危害。吡唑醚菌酯作為德國(guó)巴斯夫公司生產(chǎn)的新型殺菌劑,被廣泛用于黃瓜、草莓、苦瓜等作物上白粉病的防治,其主要作用方式是通過(guò)阻止病菌線粒體呼吸作用,使病菌體內(nèi)供給細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)所需的能量減少,從而造成細(xì)胞的死亡[3-4]。
目前關(guān)于吡唑醚菌酯的研究主要包括對(duì)柑橘[5]、蘋(píng)果[6]、草莓[7]、桃[8]等作物的病蟲(chóng)害防效,以及采用氣相色譜、液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定吡唑醚菌酯在作物上的殘留量。例如,楊茜茹等[9]選用乙腈作為提取液利用C18固相萃取柱和石墨化碳黑/氨基雙層固相萃取柱,采用氣相色譜檢測(cè)小麥樣品中吡唑醚菌酯殘留量。喻歆茹等[10]選用1.0%甲酸乙腈提取草莓樣品,采用分散固相萃取凈化,借助氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜,測(cè)定吡唑醚菌酯的殘留量。劉霞等[11]選用乙腈提取蘋(píng)果樣品,經(jīng)弗羅里硅土固相萃取柱凈化,在波長(zhǎng)為275 nm情況下,借助高效液相色譜配合紫外檢測(cè)器測(cè)定吡唑醚菌酯的殘留量。在膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面,有研究報(bào)道桑椹中吡唑醚菌酯在各個(gè)年齡段上的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)為3.7%~22.3%[12];小白菜、油麥菜和西葫蘆中吡唑醚菌酯的長(zhǎng)期攝入風(fēng)險(xiǎn)在0.7%~8.0%[13]。除此之外,吡唑醚菌酯在刺梨[14]、豇豆[15]和桑椹[12]等作物中的消解規(guī)律也有所報(bào)道。然而,關(guān)于吡唑醚菌酯在金銀花上殘留檢測(cè)消解動(dòng)態(tài)和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估鮮少報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀對(duì)金銀花中吡唑醚菌酯的殘留量進(jìn)行檢測(cè),分析其殘留消解動(dòng)態(tài),并對(duì)吡唑醚菌酯在普通消費(fèi)人群中的膳食風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估,旨在為指導(dǎo)吡唑醚菌酯在金銀花上的合理使用提供數(shù)據(jù)支持。
供試試劑。25%吡唑醚菌酯SC,河南遠(yuǎn)見(jiàn)農(nóng)業(yè)科技有限公司;吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%),德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲酸(色譜純),CNW Technologies;乙腈(色譜純),默克股份兩合公司;氯化鈉(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)、十八烷基硅烷鍵合相吸附劑(C18),天津博納艾杰爾科技有限公司;提取溶液1(乙腈10 mL+水10 mL)、提取溶液2(乙腈溶液10 mL+水20 mL)。
供試儀器。LC/MS-8050超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津儀器公司;TARGIN?VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器,北京踏錦科技有限公司;DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。
按照NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求,田間試驗(yàn)于2020年進(jìn)行,試驗(yàn)地點(diǎn)詳見(jiàn)表1。將25%吡唑醚菌酯SC于金銀花白粉病初發(fā)時(shí)噴霧施藥。本試驗(yàn)施藥劑量按農(nóng)藥標(biāo)簽規(guī)定設(shè)為250 mg/kg,施藥2次,施藥間隔7 d。于最后1次施藥后間隔2 h,3、5、7、10 d采集金銀花樣品進(jìn)行消解試驗(yàn);于最后1次施藥后間隔7、10 d采集金銀花樣品進(jìn)行最終殘留試驗(yàn)。隨機(jī)在金銀花植株的不同部位采集生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的金銀花1.5 kg。將金銀花樣品均分為2組,其中一組用電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干制成金銀花(干)樣品,另一組為金銀花(鮮)樣品,均置于-20℃冰柜保存。烘干方式:溫度設(shè)置為35℃,預(yù)熱30 min,金銀花樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱,35℃維持1.5 h;溫度升高到40℃,維持10 h;溫度升高到50℃,維持10 h;溫度升高到55℃,維持2 h,烘干時(shí)間總共為24 h。
表1 試驗(yàn)信息
準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g金銀花樣品于100 mL離心管中,金銀花(鮮)加入提取溶劑1,金銀花(干)加入提取溶劑2,分別加入2.5 g氯化鈉,混勻后震蕩提取10 min,靜置5 min后于4 000 r/min離心10 min;取2 mL上清液置于含有0.03 g C18和0.02 g PSA吸附劑的5 mL離心管中,渦漩混勻2 min,4 000 r/min離心5 min,過(guò)0.22 μm濾膜待測(cè)。
色譜條件。液相色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(3.0 mm ×100 mm,3.5 μm);柱溫:40℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表2。
表2 梯度洗脫條件
質(zhì)譜條件。掃描方式:電噴霧離子源ESI+;CID氣:270 Kpa;霧化氣流速:3.0 L/min;加熱氣流速:10 L/min;接口溫度:300℃;DL溫度:250℃;加熱塊溫度:400℃;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。吡唑醚菌酯定性離子對(duì):387.9/163.2(m/z),碰撞電壓:25 eV;定量離子對(duì):387.9/194.25(m/z),碰撞電壓:14 eV。
稱(chēng)取0.010 1 g吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯中,加入乙腈溶解,并用10 mL容量瓶定容,制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別用乙腈、金銀花(鮮)空白基質(zhì)溶液和金銀花(干)空白基質(zhì)進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尦?.005、0.01、0.05、0.1、0.2 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.4條件下進(jìn)行檢測(cè)。
將濃度為0.01、0.1、1 mg/kg的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入金銀花空白對(duì)照樣品中,每檔濃度重復(fù)5次,按照1.4所述分析方法測(cè)定,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。
基質(zhì)效應(yīng)。關(guān)于基質(zhì)效應(yīng)(ME)評(píng)價(jià),需對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線間斜率的比值按式(1)計(jì)算。
吡唑醚菌酯在金銀花(鮮)和金銀花(干)中基質(zhì)效應(yīng)ME值分別為30%和22%,基質(zhì)效應(yīng)在20%~50%范圍內(nèi)。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),均屬于中等基質(zhì)效應(yīng),因此可選用金銀花空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行定量分析。
在0.005~0.2 mg/L范圍內(nèi),基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x)與其峰面積(y)間的線性關(guān)系良好。金銀花(鮮)的線性回歸方程為y=57 684 904.195 5x+214 657.593 7,R2=0.999 5;金銀花(干)線性回歸方程為y=62 037 055.927 6x+822 620.717 3,R2=0.998 4。
當(dāng)吡唑醚菌酯的添加水平為0.01、0.1、1 mg/kg時(shí),金銀花(鮮)的平均回收率為102%~108%,RSD為1.3%~1.4%;金銀花(干)的平均回收率為76%~80%,RSD為0.9%~2.4%。吡唑醚菌酯在金銀花中的定量限均為0.01 mg/kg,符合NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[18]規(guī)定,適用于殘留分析研究。
于2020年在河南焦作、湖南長(zhǎng)沙兩地進(jìn)行吡唑醚菌酯殘留消解試驗(yàn)。吡唑醚菌酯在金銀花中的消解動(dòng)態(tài)曲線符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(圖1)。其中,河南焦作金銀花(鮮)和金銀花(干)半衰期分別為2.7和4.3 d,湖南長(zhǎng)沙金銀花(鮮)和金銀花(干)半衰期分別為2.1和2.2 d(表3)。
圖1 吡唑醚菌酯在金銀花上的消解動(dòng)態(tài)曲線
表3 吡唑醚菌酯在金銀花中的消解趨勢(shì)
于2020年在河南、湖南、山東、湖北四地進(jìn)行最終殘留試驗(yàn)。河南焦作的金銀花(鮮)和金銀花(干)中吡唑醚菌酯的最終殘留量分別為0.017~0.031 mg/kg和0.059~0.10 mg/kg;湖南長(zhǎng)沙的金銀花(鮮)和金銀花(干)中吡唑醚菌酯的最終殘留量分別為0.019~0.060 mg/kg和0.035~0.092 mg/kg;山東泰安的金銀花(鮮)和金銀花(干)中吡唑醚菌酯的最終殘留量分別為0.028~0.041 mg/kg和0.13~0.21 mg/kg;湖北荊州的金銀花(鮮)和金銀花(干)中的吡唑醚菌酯最終殘留量分別為0.013~0.024 mg/kg和<0.037 mg/kg。由于各個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)的氣候、溫度、光照等天氣因素差異較大;不同品種的金銀花,導(dǎo)致作物形態(tài)有所區(qū)別,兩者共同作用使得吡唑醚菌酯降解存在差距,造成不同試驗(yàn)地點(diǎn)的最終殘留量的差別[19-20]。
結(jié)果還顯示,河南焦作、湖南長(zhǎng)沙、山東泰安和湖北荊州地區(qū)的吡唑醚菌酯在金銀花中的殘留量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少,說(shuō)明吡唑醚菌酯在金銀花上的殘留量與采收時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。
國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)和我國(guó)未規(guī)定金銀花中吡唑醚菌酯的最大殘留限量[22]。為指導(dǎo)吡唑醚菌酯在金銀花上的合理使用,需對(duì)其進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估?;谠囼?yàn)室前期對(duì)鮮黃花菜和楊梅中吡唑醚菌酯的殘留結(jié)果,得到其對(duì)應(yīng)的淺色蔬菜和水果規(guī)范殘留試驗(yàn)中值(STMR)分別為0.097和0.89 mg/kg。居民體重以63 kg計(jì),我國(guó)規(guī)定吡唑醚菌酯的每日允許攝入量(ADI)為0.03 mg/kg bw,最后1次施藥后間隔7 d時(shí),吡唑醚菌酯在金銀花上的規(guī)范STMR值為0.10 mg/kg,通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型(表4)計(jì)算出普通人群吡唑醚菌酯的國(guó)家估算每日攝入量(NEDI)為1.422 9 mg,占日允攝入量的75.29%,表明吡唑醚菌酯的殘留量對(duì)一般消費(fèi)人群健康危害是可接受的。
表4 金銀花中吡唑醚菌酯的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果
當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)的絕對(duì)值范圍在0~20%時(shí),屬于弱基質(zhì)效應(yīng);范圍為20%~50%時(shí),屬于中等基質(zhì)效應(yīng);大于50%,屬于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。本試驗(yàn)吡唑醚菌酯的|ME|在20%~50%的范圍內(nèi),屬于中等基質(zhì)效應(yīng)。在使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析金銀花中吡唑醚菌酯殘留量時(shí),建議使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。
金銀花(干)原始沉積量和最終殘留量相對(duì)金銀花(鮮)較高,可能是由于吡唑醚菌酯的熱穩(wěn)定性較好,在金銀花烘干過(guò)程中,溫度對(duì)吡唑醚菌酯殘留量降解影響小。再者,烘干后金銀花(干)較金銀花(鮮)含水量低,對(duì)吡唑醚菌酯殘留量起到一定濃縮作用,導(dǎo)致單位質(zhì)量下金銀花(干)的殘留量較高。吡唑醚菌酯在金銀花(鮮)上的半衰期為2.1~2.7 d,在金銀花(干)上的半衰期為2.2~4.3 d,吡唑醚菌酯的半衰期均小于30 d,屬于易消解類(lèi)農(nóng)藥。此外,金銀花的半衰期在兩地之間差異并不明顯,原因可能是溫度或氣候?qū)吝蛎丫埩袅康慕到庥绊戄^小。已有文獻(xiàn)報(bào)道吡唑醚菌酯在鐵皮石斛[22]、人參[23]、蒔蘿[24]和山藥[25]中的半衰期分別為38.1、0.2~8.4、2.7~10.1和4.3~9.9 d,由此可以看出吡唑醚菌酯在金銀花上的半衰期與人參、蒔蘿和山藥相似,但明顯短于鐵皮石斛。
25%吡唑醚菌酯SC在防治金銀花病害時(shí),當(dāng)制劑施藥劑量為250 mg/kg,施藥2次,施藥間隔7 d,采收間隔期7 d時(shí),金銀花(鮮)和金銀花(干)中的吡唑醚菌酯國(guó)家估算每日攝入量(NEDI)為1.422 9 mg,占日允許攝入量的75.29%,對(duì)一般消費(fèi)人群健康危害是可接受的。