海洋源性膠原蛋白用做組織工程材料的研究進(jìn)展?

樊廷俊, 李 琨, 趙 君

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003)

膠原蛋白是動(dòng)物界中最豐富的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，屬于纖維蛋白家族，在進(jìn)化中高度保守，廣泛存在于韌帶、肌腱、附睪等結(jié)締組織以及胃腸道和泌尿生殖道在內(nèi)的大多數(shù)中空器官中，并且在皮膚的真皮、角膜、鞏膜、軟骨和骨骼中含量也很豐富[1]。目前為止，根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異已經(jīng)鑒定出至少29種膠原，其中人體超過(guò)90%的膠原蛋白是Ⅰ型，而其他常見(jiàn)的膠原蛋白類(lèi)型包括Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型等。膠原蛋白不但為組織和器官提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)支撐，更為細(xì)胞提供了高度生物相容性的環(huán)境。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，膠原蛋白現(xiàn)已廣泛用于3D細(xì)胞培養(yǎng)及藥物遞送等各個(gè)領(lǐng)域，同時(shí)高生物相容性、可生物降解性，易得性及低免疫原性等特性，使得膠原蛋白成為組織工程用生物材料的理想來(lái)源[2]。

傳統(tǒng)上，商業(yè)膠原蛋白主要從陸生哺乳動(dòng)物(例如牛和豬)中提取，然而，近年來(lái)牛海綿狀腦病、可傳播性海綿狀腦病和口蹄疫的爆發(fā)，日益增加了人們對(duì)使用陸生動(dòng)物膠原蛋白和膠原衍生產(chǎn)品的擔(dān)憂(yōu)。同時(shí)，陸生哺乳動(dòng)物膠原存在純化困難且造價(jià)昂貴等問(wèn)題。此外，由于宗教信仰，印度教禁用牛膠原蛋白，伊斯蘭和猶太文化禁用豬膠原蛋白。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的膠原蛋白來(lái)源，以替代陸生哺乳動(dòng)物的膠原蛋白[3-4]。

地球超過(guò)70%的面積被海洋所覆蓋，海洋生物是生物活性化合物的豐富來(lái)源。迄今為止，已經(jīng)從海洋資源中分離出多種生物成分。其中，海洋源性的膠原蛋白不但在氨基酸組成和生物相容性方面與傳統(tǒng)的陸生哺乳動(dòng)物膠原蛋白相似，且比哺乳動(dòng)物膠原蛋白有著更高的優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在來(lái)源廣泛、易于提取、不存在病原微生物污染且具有穩(wěn)定的化學(xué)和物理特性等，特別是在魚(yú)類(lèi)加工業(yè)和漁業(yè)活動(dòng)中，魚(yú)和海膽的廢料、尺寸過(guò)小的魚(yú)以及副漁獲物(例如水母、海星、海綿等)含有豐富的膠原蛋白，可能會(huì)成為重要但未被充分利用的膠原蛋白來(lái)源[3]。鑒于膠原蛋白在進(jìn)化中具有高度保守性，廣大的科研工作者便將目光投向了海洋生物膠原，這掀起了研究海洋生物膠原的熱潮，其作為組織工程領(lǐng)域中重要的生物材料的可能性日益增加。因此，本文對(duì)海洋源性膠原蛋白的來(lái)源、特性及提取工藝進(jìn)行了概述，并對(duì)其目前作為生物材料在組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了重點(diǎn)闡述，同時(shí)展望了海洋源性膠原蛋白作為理想組織和器官再生材料來(lái)源的可能性。

1 海洋膠原蛋白的主要來(lái)源

海洋環(huán)境是膠原蛋白和生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源，按照動(dòng)物類(lèi)型不同，目前海洋膠原蛋白基本可以來(lái)源于兩類(lèi)：一類(lèi)為海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，包括海蜇、海膽和水母等[5-16]；另一類(lèi)為海洋脊椎動(dòng)物，包括魚(yú)和各種海洋哺乳動(dòng)物[17-25]。目前，從海洋生物中提取的膠原蛋白用于組織工程生物材料的研究主要集中在海洋魚(yú)類(lèi)、水母及海綿等，這些海洋生物的皮膚、肌肉、軟骨組織及中膠層等部位含有豐富的膠原蛋白[4]。

海洋魚(yú)類(lèi)中，膠原蛋白通常是從肉、皮膚、骨頭、鰭、鱗片和魚(yú)渣中提取得到，以Ⅰ型膠原蛋白為主。提取的魚(yú)膠原蛋白通過(guò)純化，其小分子片段可以用于化妝品的制備及營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域，其大分子則經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工形成功能性生物材料，用于組織工程的支架，包括膠原海綿、凝膠、復(fù)合材料和膜等。來(lái)源于海洋魚(yú)類(lèi)的膠原蛋白目前大部分來(lái)自加工業(yè)產(chǎn)生的魚(yú)類(lèi)廢物，研究表明從這些丟棄物中提取的膠原蛋白的干質(zhì)量可達(dá)50%以上。因此，這種廢料具有被開(kāi)發(fā)為生態(tài)友好且低成本的膠原蛋白來(lái)源的巨大潛力[17-24]。

水母是一類(lèi)膠質(zhì)狀的浮游生物，屬刺胞動(dòng)物門(mén)，在中國(guó)近海海域分布廣泛。來(lái)源于水母的膠原蛋白主要是從水母中膠層中提取得到的，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ及Ⅺ型膠原蛋白，目前作為組織工程用生物材料已被用于傷口敷料及鼻軟骨的修復(fù)等[9-10]。

海洋海綿是最原始的多細(xì)胞動(dòng)物，其主要成分是碳酸鈣或碳酸硅以及大量的膠原蛋白，已知其含有Ⅳ型膠原蛋白。研究發(fā)現(xiàn)海綿膠原蛋白可以提高皮膚成纖維細(xì)胞的增殖速度并保護(hù)其免受紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，有望用于皮膚的光老化修復(fù)[13-16]。

海洋膠原蛋白還可以從鯨魚(yú)、海豹、海獺和北極熊等海洋哺乳動(dòng)物中提取。例如小須鯨腹溝中可以提取到Ⅰ型膠原蛋白，提示其可以作為陸生哺乳動(dòng)物膠原蛋白的替代物[25]。然而，直到現(xiàn)在，海洋哺乳動(dòng)物仍很少被用于膠原蛋白的開(kāi)發(fā)。本文作者對(duì)過(guò)去十年中從海洋來(lái)源獲得的不同類(lèi)型的膠原蛋白及其潛在用途進(jìn)行了總結(jié)(見(jiàn)表1)。

表1 海洋源性膠原蛋白的主要來(lái)源、類(lèi)型及應(yīng)用領(lǐng)域

2 海洋膠原蛋白的特性

眾多數(shù)據(jù)證明，海洋源性的膠原蛋白具有與陸生動(dòng)物膠原蛋白相似的理化性質(zhì)。與陸生動(dòng)物來(lái)源的Ⅰ型膠原蛋白相比，源自海洋硬骨魚(yú)的Ⅰ型膠原蛋白被發(fā)現(xiàn)其膠原α1和α2鏈與陸生動(dòng)物表現(xiàn)出高度的結(jié)構(gòu)相似性[26]。然而海洋源性膠原蛋白在稀酸溶液中表現(xiàn)出的極高溶解度說(shuō)明，其與陸生動(dòng)物膠原蛋白一定具有不同的特性[27]。

2.1 氨基酸組成

海洋源性膠原蛋白的生化組成被發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物膠原蛋白不同。之前的研究已經(jīng)證明，海洋源性膠原蛋白的氨基酸組成與哺乳動(dòng)物膠原蛋白類(lèi)似，其中甘氨酸是最豐富的氨基酸，占所有氨基酸的30%以上。然而在海洋源性膠原蛋白中，特別是在冷水魚(yú)膠原蛋白中，亞氨基酸(包括脯氨酸和羥脯氨酸)的含量低于哺乳動(dòng)物膠原蛋白的含量，但其含有更多的絲氨酸和蘇氨酸殘基[27]。這些氨基酸組成的差異，特別是羥基脯氨酸含量的差異，會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白性質(zhì)的變化，表現(xiàn)在剛度、熱穩(wěn)定性和變性溫度的變化中，而更高含量的亞氨基酸會(huì)使膠原蛋白的穩(wěn)定性增加[28]。

2.2 熱穩(wěn)定性

膠原中，羥脯氨酸和羥賴(lài)氨酸的羥基通過(guò)鏈間氫鍵結(jié)合到羰基基團(tuán)上，從而增加了膠原三螺旋的熱穩(wěn)定性。因此，脯氨酸和賴(lài)氨酸的含量直接影響膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。海洋源性膠原蛋白的亞氨基酸含量較低，因而其變性溫度低于哺乳動(dòng)物膠原蛋白的變性溫度。同時(shí)，生活在寒冷環(huán)境中的魚(yú)類(lèi)(例如鮭魚(yú))所產(chǎn)生的膠原蛋白的羥脯氨酸含量較低(35%～37%)，與生活在溫暖環(huán)境中的魚(yú)類(lèi)(例如羅非魚(yú)膠原蛋白的羥脯氨酸含量約為43%)相比，其膠原蛋白的熱穩(wěn)定性也較低[29]。因此，魚(yú)膠原蛋白的亞氨基酸含量與其熱穩(wěn)定性相關(guān)，并與它們正常棲息地的水溫相關(guān)。

另外，由于海洋源性膠原蛋白的變性溫度低于哺乳動(dòng)物的體溫，因此放置在高于37 ℃下海洋源性膠原蛋白會(huì)發(fā)生融化現(xiàn)象。源自溫水魚(yú)類(lèi)(包括羅非魚(yú))的膠原蛋白可以表現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物膠原蛋白相似的氨基酸組成、流變特性和熱穩(wěn)定性[30]，這提示溫水魚(yú)類(lèi)膠原蛋白有望作為哺乳動(dòng)物膠原蛋白的替代品而用于生物醫(yī)學(xué)中。

與陸地脊椎動(dòng)物膠原蛋白相比，較低的變性溫度和黏度也阻礙了海洋源性膠原蛋白作為生物材料應(yīng)用于組織工程中，尤其是魚(yú)類(lèi)來(lái)源膠原蛋白的支架的制備。目前這一問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)體外化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定膠原蛋白，實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠原原纖維形成的改善。用于穩(wěn)定膠原蛋白的交聯(lián)方法可分為物理處理(例如使用UV輻照、γ輻照或脫氫熱處理)和化學(xué)處理(例如使用戊二醛、碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亞胺(EDC))[31]。盡管化學(xué)處理可導(dǎo)致其存在潛在的細(xì)胞毒性或較差的生物相容性，但化學(xué)處理可顯著提高膠原蛋白支架的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，而物理處理僅可提供足夠的穩(wěn)定性，因此在組織工程中，化學(xué)處理被廣泛的應(yīng)用于海洋源性膠原蛋白生物材料的制備中。

3 海洋膠原蛋白的提取與制備技術(shù)

按照不同的來(lái)源，對(duì)海洋源性膠原蛋白的提取有不同的方法，但從魚(yú)副產(chǎn)品和其他海洋資源中分離膠原蛋白的通用步驟一般包括準(zhǔn)備、提取和回收。

3.1 膠原蛋白的分離準(zhǔn)備

準(zhǔn)備工作包括清潔、分離動(dòng)物部位以及通過(guò)切割或切碎樣品來(lái)減小尺寸，為接下來(lái)的化學(xué)預(yù)處理做準(zhǔn)備。對(duì)于鱈魚(yú)、鮭魚(yú)和大馬哈魚(yú)等魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，因?yàn)楦鞑糠帜z原蛋白組成不同，一般會(huì)對(duì)其皮膚、魚(yú)鱗、魚(yú)鰭和骨頭分別進(jìn)行提取[19, 22, 24]。對(duì)于魷魚(yú)等軟體動(dòng)物來(lái)說(shuō)，一般采用機(jī)械方法將其皮膚與魷魚(yú)體分開(kāi)[11]。對(duì)于水母來(lái)說(shuō)，一般將其口腕與傘分開(kāi)，然后再將傘分成中胚層、上傘和下傘后進(jìn)行提取[9-10]。

準(zhǔn)備工作還包括化學(xué)預(yù)處理，通常使用氫氧化鈉去除非膠原蛋白、色素或脂肪成分，該預(yù)處理方法不會(huì)對(duì)膠原鏈造成結(jié)構(gòu)改變。但是，去除鱈魚(yú)皮膚上的非膠原蛋白時(shí)，使用氯化鈉替代氫氧化鈉[19]。另外，為了從骨、軟骨和鱗中脫礦質(zhì)，可以使用乙二胺四乙酸(EDTA)或稀鹽酸進(jìn)行預(yù)處理[32]。

3.2 膠原蛋白的提取

對(duì)于提取階段，由于膠原蛋白的三重螺旋結(jié)構(gòu)存在強(qiáng)交聯(lián)，因此它在冷水中的溶解度很差。目前有2種常規(guī)的提取方法：酸增溶的膠原蛋白的提取和胃蛋白酶增溶的膠原蛋白的提取。使用這2種方法提取的膠原蛋白的產(chǎn)量、化學(xué)組成和特性互不相同。

當(dāng)僅使用酸進(jìn)行膠原蛋白提取時(shí)，該產(chǎn)品稱(chēng)為酸溶性膠原蛋白。為了從海洋動(dòng)物組織中提取膠原蛋白，最常使用的是終濃度0.5 mol/L的乙酸，但也使用檸檬酸和乳酸。大約95%的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物(例如水母)由水組成，這會(huì)影響膠原蛋白在乙酸中的溶解度[9-10]。因此，為了改善膠原蛋白在稀酸中的溶解度增加提取產(chǎn)量，必須將水母進(jìn)行勻漿或冷凍干燥。另外利用酸處理聯(lián)合調(diào)節(jié)pH值以及超聲等物理處理的方式時(shí)，與常規(guī)提取工藝相比，提取產(chǎn)量可以顯著提高[33]。

在提取過(guò)程中添加胃蛋白酶提取的膠原蛋白稱(chēng)為胃蛋白酶可溶性膠原蛋白。這種處理非常有效，因?yàn)榈鞍酌缚稍诓黄茐娜菪Y(jié)構(gòu)完整性的情況下切割端肽交聯(lián)的區(qū)域，從而水解某些非膠原蛋白并增加膠原蛋白的純度[34]。但是，長(zhǎng)時(shí)間使用大量胃蛋白酶可能會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白裂解，損害三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性，從而導(dǎo)致膠原蛋白產(chǎn)量的降低。

3.3 膠原蛋白的回收

在回收步驟中，通常通過(guò)添加終濃度2.3～2.6 mol/L的氯化鈉溶液沉淀膠原蛋白。通過(guò)離心收集所得沉淀物，將其溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，透析并冷凍干燥即可得到膠原蛋白。其中水母膠原蛋白的回收可以通過(guò)在0.5 mol/L的乙酸溶液中增溶3 d，然后利用Na2HPO4溶液進(jìn)行透析。沉淀的膠原通過(guò)離心再添加固體氯化鈉進(jìn)行分離，最后溶解于乙酸并通過(guò)再沉淀得到。也可以用胃蛋白酶消化以獲得膠原[33]。魚(yú)鱗的處理方法也可以參照上述步驟[23]。

海膽的膠原蛋白不同于其他膠原，不能通過(guò)傳統(tǒng)的水解膠狀物的酸增溶方法來(lái)提取。因此，在海膽膠原蛋白的提取中，需先將天然組織切碎，繼而依次利用低滲溶液和SDS-脫細(xì)胞溶液處理以除去細(xì)胞碎片、骨骼和色素，然后將其加到β-巰基乙醇溶液中放置3～4 d后，通過(guò)過(guò)濾并在0.5 mol/L EDTA-Na溶液中透析獲得膠原蛋白。使用相同的方案可以從海星腕臂中提取到膠原蛋白，但是在脫細(xì)胞后，樣品需要增加額外的步驟以去除新鮮組織中存在的碳酸鈣小骨[35]。

4 海洋膠原蛋白在組織工程生物材料中的應(yīng)用

組織工程學(xué)是生命科學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)新興且迅速發(fā)展的跨學(xué)科領(lǐng)域，它利用工程學(xué)和生物學(xué)原理將細(xì)胞與支架有機(jī)結(jié)合，從而促進(jìn)受損或患病組織或器官的再生。其中，支架是由多種生物材料制成的3D結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞附著和維持生長(zhǎng)的重要支撐載體。生物材料大分子的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和排列方式?jīng)Q定了支架的機(jī)械性能和生物學(xué)特性，并進(jìn)而影響附著細(xì)胞的形態(tài)、行為和功能。

在選擇適合于組織工程應(yīng)用的生物材料時(shí)，應(yīng)考慮多種關(guān)鍵因素，包括：(1)生物材料的來(lái)源；(2)適合細(xì)胞生存的機(jī)械特性；(3)最佳的生物相容性，以促進(jìn)細(xì)胞貼附、增殖和分化；(4)適合于各種形狀和尺寸的制造方法。

應(yīng)該選擇合適的生物材料來(lái)制造支架。在可用的生物材料類(lèi)型中，合成聚合物因其良好的加工特性而被廣泛用于支架的制備，缺點(diǎn)在于其具有疏水性因而缺少細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)而無(wú)法很好的為細(xì)胞提供附著。天然聚合物，包括多糖(透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖和纖維素等)和蛋白質(zhì)(膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、絲素蛋白和角蛋白等)，由于其高生物相容性，可以出色的促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，因而可以作為理想的生物材料用于支架的制備。然而，天然聚合物通常不具有良好的機(jī)械性能，并且熱穩(wěn)定性較合成聚合物低，因而需要化學(xué)改性或復(fù)合制備才能滿(mǎn)足支架的制備要求。海洋源性膠原蛋白通過(guò)化學(xué)改性或復(fù)合制備后表現(xiàn)出較陸生動(dòng)物膠原蛋白更好的熱穩(wěn)定性及機(jī)械性能，提示其可能成為組織工程最有前途的生物材料[36](見(jiàn)圖1)。

圖1 海洋源性膠原蛋白作為支架在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用[36]

4.1 海洋膠原蛋白在骨和軟骨組織工程及再生中的應(yīng)用

骨再生是一個(gè)復(fù)雜的骨形成過(guò)程，不但可以在正常的骨折愈合過(guò)程中觀察到，且在整個(gè)成年生活中都有持續(xù)的骨再生。但是，在個(gè)別復(fù)雜的臨床情況下，需要大量的骨再生，例如由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除或骨骼異常引起的缺損和損傷而導(dǎo)致的大骨骼重建、再生過(guò)程中骨受損，包括無(wú)血管性骨壞死、萎縮性骨不連和骨質(zhì)疏松等。目前，有很多不同的策略可以修復(fù)受損的骨或幫助骨再生，包括“金標(biāo)準(zhǔn)”自體骨移植、游離腓骨血管化移植、同種異體移植、骨傳導(dǎo)性支架及骨祖細(xì)胞移植等。以生產(chǎn)具有生物力學(xué)特性的組織工程骨移植替代物正成為最有效的治療方式，其中大量海洋源性膠原蛋白已經(jīng)用于組織工程中，如骨組織和軟骨組織的體外構(gòu)建。

從羅非魚(yú)鱗片中提取的水解魚(yú)膠原蛋白可以誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化，其中水解魚(yú)膠原蛋白不僅可以提高細(xì)胞活力，還可以顯著上調(diào)成骨標(biāo)志物和內(nèi)皮標(biāo)志物的表達(dá)，這表明水解魚(yú)膠原蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞向成骨和內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用[37]；從鱈魚(yú)的骨骼和皮膚中提取的魚(yú)膠原蛋白可以促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖及成骨標(biāo)記物的表達(dá)，提高骨特異性堿性磷酸酶活性和礦化速度[38]；用鱈魚(yú)和鰈魚(yú)膠原蛋白處理的成骨細(xì)胞MC3T3-E1中膠原蛋白修飾酶的基因表達(dá)顯著上調(diào)，并且在培養(yǎng)物中產(chǎn)生更多的膠原蛋白沉積。與對(duì)照組相比，膠原蛋白表現(xiàn)出更大程度的賴(lài)氨酸羥化、更高水平的羥賴(lài)氨酸-醛衍生的交聯(lián)和更快速度的基質(zhì)礦化[39]。這些結(jié)果暗示魚(yú)膠原蛋白具有顯著促成骨細(xì)胞分化的活性，有望作為組織工程骨的生物材料。

已有研究報(bào)道了來(lái)自鮭魚(yú)皮膚的膠原蛋白對(duì)成年大鼠股骨發(fā)育的影響[40]。來(lái)自這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明海洋源性膠原蛋白不僅增加了血清骨鈣素和堿性磷酸酶的含量，而且還增加了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)中股骨的大小、礦物質(zhì)密度以及股骨的剛度和韌性，這表明這種膠原蛋白可以促進(jìn)成年雄性大鼠長(zhǎng)骨的發(fā)育。

因而基于上述膠原蛋白的特性，目前已有大量研究提出了通過(guò)模仿天然骨組織微環(huán)境，體外構(gòu)建基于膠原蛋白的組織工程支架，從而加速骨組織的再生。如通過(guò)優(yōu)化的冷凍干燥方法，使用來(lái)源于鯊魚(yú)皮的膠原蛋白和鯊魚(yú)牙齒的磷灰石，制備了膠原蛋白/磷灰石復(fù)合支架，用于硬組織的體外構(gòu)建[41]。這種膠原蛋白/磷灰石復(fù)合支架有效地提高了人類(lèi)骨肉瘤細(xì)胞的活力，表明其有望用于骨再生治療。

以相同的方式，使用藍(lán)鯊的Ⅱ型膠原蛋白通過(guò)凍干開(kāi)發(fā)了膠原蛋白/羥磷灰石/殼聚糖復(fù)合海綿，可以用于組織工程軟骨的體外構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種用羥磷灰石礦化的基于膠原蛋白/羥磷灰石的復(fù)合海綿有效地促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖活性并顯著提高了成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，表明其可以作為替代哺乳動(dòng)物膠原蛋白的組織工程軟骨應(yīng)用的合適生物材料[42]。礦化的鮭魚(yú)膠原蛋白、藻酸鹽和原纖維化的水母膠原蛋白經(jīng)冷凍干燥和交聯(lián)制備，從而開(kāi)發(fā)出新型的基于膠原蛋白纖維的堅(jiān)韌雙網(wǎng)絡(luò)復(fù)合水凝膠。這種支架能夠促進(jìn)骨髓源性人的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的軟骨形成和成骨分化，同時(shí)，植入兔缺損軟骨模型4周后，該支架在體內(nèi)表現(xiàn)出出色的生物力學(xué)性能，暗示了其應(yīng)用于體外軟骨構(gòu)建的潛能[43]。另外從水母中提取的膠原蛋白用冷凍干燥法制成的膠原支架，可以使人和大鼠鼻中隔軟骨細(xì)胞在其上正常生長(zhǎng)，并促進(jìn)細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)蛋白。在這項(xiàng)研究中，基于水母膠原蛋白的支架能夠預(yù)防大鼠模型中的間隔穿孔，表明該膠原蛋白支架可以用于鼻軟骨修復(fù)[44]。再者，由原纖維化水母膠原蛋白和藻酸鹽構(gòu)建的水凝膠混合支架可以增加人的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[45]。臨床研究也證明，海洋源性膠原蛋白有效促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨基質(zhì)合成并減輕其疼痛，上述結(jié)果提示，海洋源性膠原蛋白有望治療人骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥，并幫助骨再生，因此，被用作組織工程的潛力候選生物材料[46]。

如今海洋源性膠原蛋白在骨及軟骨再生中展現(xiàn)出了巨大的潛力，且利用交聯(lián)及復(fù)合高強(qiáng)度物質(zhì)聯(lián)合制備的方式有效改善了這類(lèi)材料無(wú)法應(yīng)用于硬組織重建的不足，然而目前尚未有標(biāo)準(zhǔn)的可用來(lái)參考的交聯(lián)方法可以穩(wěn)定制備出力學(xué)性能方面與天然骨相匹配的膠原蛋白支架。此外，身體組織通常是具有彈性的，這種彈性會(huì)直接影響或調(diào)控細(xì)胞的行為，包括成骨分化和礦化基質(zhì)沉積等。因而如何在增強(qiáng)支架的硬度的同時(shí)兼顧支架的彈性，可能是未來(lái)需要研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

4.2 海洋膠原蛋白在皮膚組織工程和皮膚修復(fù)中的應(yīng)用

幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，由燒傷、創(chuàng)傷、感染、移植排斥、疤痕、遺傳缺陷和其他疾病的廣泛存在，人們對(duì)皮膚缺陷替代品的需求日益旺盛。通常情況下，正常的傷口愈合過(guò)程可分為3個(gè)階段，分別是：(1)止血和炎癥反應(yīng)階段；(2)細(xì)胞增殖分化階段；(3)組織重建或瘢痕形成階段。理想的皮膚替代品要求其組織相容性好、植入或覆蓋創(chuàng)面不與機(jī)體發(fā)生不良反應(yīng)且能治療或代替機(jī)體中的缺損組織，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和修復(fù)。其中，利用膠原蛋白制備的組織工程皮膚修復(fù)物已取得顯著的研究進(jìn)展，同時(shí)也已有大量團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了對(duì)利用海洋源性膠原蛋白制備組織工程皮膚的研究[5, 17, 22]。

通過(guò)氨解將羅非魚(yú)的魚(yú)鱗膠原蛋白摻入P(3HB-co-4HB)共聚物中，能讓L929小鼠成纖維細(xì)胞更好地在復(fù)合支架上附著、生長(zhǎng)和增殖。體內(nèi)研究表明，P(3HB-co-4HB)中加入1.5%的魚(yú)鱗膠原蛋白還可對(duì)傷口收縮有顯著影響， 7 d內(nèi)達(dá)到最高的傷口閉合率(61%)，表明該魚(yú)膠原蛋白支架可以用于皮膚傷口愈合[47]。

從印度鯪魚(yú)鱗片中分離的Ⅰ型膠原蛋白可作為蛋白支架支持人類(lèi)原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的有效生長(zhǎng)和增殖，在該支架上將成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行三維共培養(yǎng)后，可加快傷口愈合速度并在體外形成分層的表皮層結(jié)構(gòu)，證明其可作為皮膚替代品進(jìn)行使用[48]。

利用電紡絲技術(shù)制備的魚(yú)膠原蛋白/生物活性玻璃(Col/BG)納米纖維，除拉伸強(qiáng)度得到有效改善外，并具有對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性，用作皮膚傷口敷料可有效防止病菌感染。另外Col/BG納米纖維不僅可以促進(jìn)人類(lèi)角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附、增殖和遷移，還可以促進(jìn)細(xì)胞中Ⅰ型膠原和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，從而進(jìn)一步刺激了人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。大鼠傷口模型結(jié)果表明，Col/BG納米纖維可以有效地誘導(dǎo)傷口區(qū)域的皮膚再生，說(shuō)明其具有被用作傷口敷料的巨大潛力[49]。

從海洋海綿中分離出的膠原蛋白能刺激小鼠巨噬細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞存活和增殖，證明其具有顯著的抗氧化活性并保護(hù)細(xì)胞免受紫外線(xiàn)誘導(dǎo)凋亡，表明該種海洋源性膠原蛋白具有促傷口愈合和光保護(hù)特性，可用于修復(fù)受損或光老化的皮膚[50]。

4.3 海洋膠原蛋白在血管組織工程中的應(yīng)用

由于各種疾病(包括心血管疾病、外周血管疾病和局部缺血)而需要替代血管的患者數(shù)量不斷增加，因此不僅迫切需要理解和掌握脈管系統(tǒng)發(fā)育和分化的機(jī)制，而且還需要能夠體外制備血管移植物或人造血管和淋巴管的能力。在過(guò)去的10年中，血管組織工程領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。這其中，海洋源性膠原蛋白已被接受并證明是血管組織工程的有效替代支架材料，廣泛應(yīng)用于多種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。如有研究使用甲基化修飾和1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDE)交聯(lián)來(lái)改善魚(yú)鱗來(lái)源的膠原蛋白的理化特性，在無(wú)生長(zhǎng)因子的條件下，在鼠模型中觀察到了膠原蛋白支架良好地整合到周?chē)M織中，并具有良好的細(xì)胞、血管和淋巴管浸潤(rùn)，驗(yàn)證了魚(yú)鱗來(lái)源的膠原蛋白作為血管支架材料的潛在應(yīng)用價(jià)值[51]。

通過(guò)冷凍干燥和靜電紡絲制成了來(lái)自水母膠原蛋白和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的管狀支架，在脈沖灌注系統(tǒng)下使用膠原蛋白/ PLGA混合支架對(duì)兔原代平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后，可以有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并且還能誘導(dǎo)類(lèi)似于體內(nèi)的天然血管樣的細(xì)胞的定向排列，提示膠原蛋白/PLGA支架在組織工程血管移植中具有良好的應(yīng)用前景[52]。然而不可忽視的是，雖然海洋源性膠原蛋白的免疫原性較陸生哺乳動(dòng)物低，但血管系統(tǒng)仍有可能對(duì)利用其構(gòu)建的血管移植物引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，因此在當(dāng)前階段仍需不斷探索和改進(jìn)海洋源性膠原蛋白在血管組織工程中的應(yīng)用模式。

4.4 海洋膠原蛋白在牙組織工程中的應(yīng)用

牙齒的結(jié)構(gòu)是獨(dú)特的，軟組織和硬組織同時(shí)存在，包括3種硬組織(牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì))和1種軟組織(牙髓)。在過(guò)去的10年中，牙組織工程領(lǐng)域朝著修復(fù)式的新概念發(fā)展，取得了巨大進(jìn)步。

從羅非魚(yú)鱗片分離出的Ⅰ型膠原蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的活力，增加細(xì)胞的附著力，提高堿性磷酸酶的活性，并在大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(MDPC-23)中上調(diào)骨唾液蛋白的基因表達(dá)，并加速基質(zhì)礦化，這表明魚(yú)膠原蛋白可以用于牙再生[53]。且魚(yú)膠原蛋白還能提高了人牙周膜細(xì)胞的活力，并通過(guò)激活ERK信號(hào)通路上調(diào)成骨標(biāo)志物和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明魚(yú)膠原蛋白是一種有前途的可供生物活性牙槽骨再生中使用的生物材料的成分[54]。

電紡絲技術(shù)制備的羅非魚(yú)魚(yú)膠原蛋白/生物活性玻璃/殼聚糖納米纖維膜對(duì)變形葡萄球菌具有一定程度的抗菌活性，并可增強(qiáng)人牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞黏附性、細(xì)胞活力和成骨基因的表達(dá)。在犬中該支架還促進(jìn)了牙周缺損犬模型的骨再生，證明了其在臨床上作為誘導(dǎo)牙周組織再生具有巨大的潛力[55]。

4.5 海洋膠原蛋白在角膜組織工程中的應(yīng)用

角膜損傷是患者失明的主要原因之一，當(dāng)無(wú)法使用其他治療方法矯正視力時(shí)，角膜移植是最佳的治療方法。然而，供體的老齡化及短缺嚴(yán)重制約了角膜移植手術(shù)的開(kāi)展。盡管目前已將包括羊膜及脫細(xì)胞角膜基質(zhì)在內(nèi)的不同生物材料用作角膜修復(fù)材料，并發(fā)現(xiàn)它們具有出色的生物相容性，但基于膠原蛋白的組織工程角膜也已取得了重大突破，并表現(xiàn)出了卓越的特性。

如用脫細(xì)胞和脫鈣的魚(yú)鱗膠原蛋白作為人類(lèi)供體角膜組織的替代物，在大鼠眼部植入后，顯示出良好的生物相容性、足夠的透光率、合理的光散射值以及可用于角膜移植的能力，表明魚(yú)膠原蛋白可用于角膜移植以應(yīng)對(duì)供體角膜的短缺[56]。

通過(guò)冷凍干燥從魚(yú)鱗中合成的魚(yú)膠原支架顯示出良好的機(jī)械強(qiáng)度、更好的溶脹率和更強(qiáng)的微生物抵抗力，且能使角膜上皮細(xì)胞更好地生長(zhǎng)、增殖和遷移，提示魚(yú)膠原可以作為角膜再生和移植的生物材料[57]。

最近的研究中，樊廷俊等[58]利用來(lái)自太平洋鱈魚(yú)的純化魚(yú)皮膠原體外構(gòu)建出了三維魚(yú)類(lèi)膠原支架，為其作為載體支架用于組織工程角膜的體外構(gòu)建研究提供了可能。同時(shí)鑒于膠原蛋白對(duì)疤痕的修復(fù)作用，利用膠原蛋白作為支架可能對(duì)移植后的角膜基質(zhì)的傷口有促進(jìn)愈合作用?；谀z原蛋白的生物材料構(gòu)建的組織工程角膜不但可以用于供體的替代物，還可以用于角膜修復(fù)和疤痕的抑制，值得進(jìn)一步深入研究。

4.6 海洋膠原蛋白在神經(jīng)組織工程中的應(yīng)用

神經(jīng)系統(tǒng)是人體的重要組成部分，無(wú)論是受傷還是疾病造成的損害，都可能導(dǎo)致嚴(yán)重或潛在的致命后果。由于復(fù)雜的生理系統(tǒng)和有限的再生能力，恢復(fù)受損的神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，因此迫切需要針對(duì)患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者的治療策略進(jìn)行創(chuàng)新，用組織工程化的神經(jīng)移植物替代周?chē)窠?jīng)自體移植物從一定程度上解決了缺乏神經(jīng)組織的問(wèn)題。

有研究報(bào)道，利用EDC/NHS對(duì)來(lái)源于羅非魚(yú)的膠原蛋白進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后，可以制備出與腦組織硬度相似的凝膠支架，且在神經(jīng)誘導(dǎo)的早期階段，剛度約為1 500 Pa的凝膠可促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向背皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的分化[59]。這些發(fā)現(xiàn)表明，模仿大腦僵硬的魚(yú)膠原蛋白凝膠具有確定終末神經(jīng)亞型的潛力，有望用于神經(jīng)再生。

甲基丙烯酸酯化是另外一種改善魚(yú)類(lèi)膠原蛋白強(qiáng)度的有效手段。有研究表明，通過(guò)將甲基丙烯酸酯化和UV交聯(lián)可以顯著提高來(lái)源于紅鯛魚(yú)的膠原蛋白的機(jī)械性能，將體外負(fù)載NSC-34運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的膠原蛋白生物墨水和骨骼成肌細(xì)胞的甲基丙烯酸化水凝膠生物墨水進(jìn)行共軸3D打印后可以形成結(jié)構(gòu)化的神經(jīng)肌肉接頭模型[31]。

雖然已有開(kāi)展基于海洋膠原蛋白在組織工程神經(jīng)再生中應(yīng)用的研究，然而后續(xù)依然存在大量需要深入解決的問(wèn)題，包括如何將海洋膠原蛋白用于復(fù)合神經(jīng)細(xì)胞物的培養(yǎng)。另外與其他組織相比，大腦的細(xì)胞外基質(zhì)含有較高比例的糖胺聚糖以及較小比例的膠原蛋白和其他纖維蛋白，鑒于此，海洋膠原蛋白必須與其他多糖類(lèi)材料進(jìn)行復(fù)合制備，才有望成為理想的神經(jīng)元建模支架。

5 展望

在過(guò)去的幾十年中，海洋源性膠原蛋白因其天然來(lái)源豐富且與陸生動(dòng)物膠原蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，已成為一種有前途的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用材料。此外，它具有生物相容性、生物降解性、抗微生物活性、功能性、水溶性、易提取性、安全性和低生產(chǎn)成本的優(yōu)點(diǎn)，使其成為了可廣泛應(yīng)用于各種組織工程(包括骨、軟骨、皮膚、血管、牙齒和角膜組織再生)的生物材料。而且，海洋源性膠原蛋白的加工條件靈活，取自魚(yú)類(lèi)加工業(yè)和漁業(yè)活動(dòng)的周邊成分，大大加強(qiáng)了這些“廢料”的高值化應(yīng)用。同時(shí)，其通過(guò)化學(xué)改性或復(fù)合制備后表現(xiàn)出的高熱穩(wěn)定性及優(yōu)異的機(jī)械性能，更是彌補(bǔ)了陸生動(dòng)物膠原蛋白的諸多不足。盡管海洋源性膠原蛋白所制備支架影響機(jī)體結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性，以及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的信號(hào)調(diào)控途徑仍然沒(méi)有完全查清楚，但毋庸置疑的是，海洋源性膠原蛋白作為一種可用于開(kāi)發(fā)組織工程產(chǎn)品的生物材料必將具有廣闊的應(yīng)用前景。