吳 杉 牛振楠 孟常娟 路 萌 成云云*

（1.邢臺市第三醫(yī)院健康體檢中心，邢臺 054000；2.邢臺市第三醫(yī)院內(nèi)鏡室，邢臺 054000；3.邢臺市第三醫(yī)院病理科，邢臺 054000）

宮頸癌是女性第四大常見的惡性腫瘤，尤其是在發(fā)展中國家。目前國際上關(guān)于高級別宮頸病變的診治沒有爭議［1］。但是，宮頸病變的患者即使在治療后發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于正常人群。因此，為了防止宮頸病變的復(fù)發(fā)和進(jìn)展，對這部分人群的監(jiān)測是一項(xiàng)重要的工作。然而，不同的國家和地區(qū)的隨訪方案差異比較大。目前對于宮頸病變治療后的女性，術(shù)后需要定期行宮頸細(xì)胞學(xué)和宮頸HPV 檢測，但由于篩查方法存在高敏感性和低特異性等不足，這部分患者需要頻繁的接受檢查［2，3］。并且檢測的間隔時(shí)間長短不一，這不僅為患者帶來嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和壓力，也為國家?guī)砭薮蟮呢?fù)擔(dān)。因此，目前需要一種方法可以簡便和有效的預(yù)測宮頸病變治療后的殘留與復(fù)發(fā)。約99.7%的宮頸癌是由于HPV 感染造成的，HPV 持續(xù)感染與子宮頸癌，肛門生殖器，以及頭頸癌密切相關(guān)［4，5］。國際認(rèn)可的宮頸癌篩查三步方案包括初次篩查、陰道鏡檢查和組織病理學(xué)。目前，通過HPV 檢測和Thinprep 細(xì)胞學(xué)檢測（TCT）單獨(dú)篩查方案應(yīng)用廣泛，但篩查結(jié)果較局限，仍需尋找可靠的篩查方案。本研究探討TCT 結(jié)合HR?HPV 基因檢測對宮頸病變的診斷及HPV 基因型與TCT 結(jié)果、病理分型的關(guān)系。評價(jià)其對診斷宮頸病變的價(jià)值，進(jìn)而為宮頸癌的及時(shí)發(fā)現(xiàn)以及后續(xù)療法的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月~2020年10月入邢臺市第三醫(yī)院的行宮頸病變的426例，<21 歲組80例，21~29歲組98例，30~65 歲組135例，>65 歲組113例，均行TCT 檢測和HR?HPV 基因型檢測，患者均知曉并簽署《知情同意書》，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查并通過。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照美國宮頸病變篩查推薦指南；②患者檢查前3d 未進(jìn)行性行為；③患者可進(jìn)行良好溝通，無嚴(yán)重的精神病史；④無其他器官功能障礙；⑤伴有白帶異常、陰道內(nèi)不規(guī)則出血等。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有急性生殖道炎癥，免疫系統(tǒng)疾病以及性傳播疾病等；②已進(jìn)行全子宮切除術(shù)；③篩查的1 周內(nèi)有陰道用藥史；④已接受過HPV治療者（2 內(nèi)周內(nèi)）；⑤不配合本研究患者。

1.3 方法

1.3.1 TCT 檢測方法

是一種針對傳統(tǒng)巴氏涂片缺點(diǎn)改進(jìn)后的宮頸細(xì)胞脫落采集、制片、閱片的方法。利用從宮頸外表面（子宮頸陰道部）和宮頸管（宮頸內(nèi)膜）獲取的細(xì)胞來評估移行帶（鱗狀柱狀上皮接合處）發(fā)生宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)。TCT 的采樣工具是一把小毛刷，和傳統(tǒng)的刮板相比，可以刷到更多細(xì)胞，然后經(jīng)過特殊的制片技術(shù)把細(xì)胞分散成薄層樣本。經(jīng)Thin Prep 2000 全自動超薄液基細(xì)胞學(xué)檢測系統(tǒng)制備成均勻的薄層細(xì)胞涂片，將玻片進(jìn)行染色固定后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。

1.3.2 HPV 基因型檢測

采用PCR 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，以及HPV 基因分型檢測試劑盒（深圳市某生物藥械有限公司）進(jìn)行定性檢測并加以分型，能夠檢測23種HPV 基因型，直接提示感染HPV 的基因型；包括17種高危型（R?HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）和6種低危型（L?HPV6、11、42、43、81、83）。采用PCR 儀（BD，美國）、核酸分子快速雜交儀、基因芯片?微陣列掃描分析儀，PCR 擴(kuò)增待檢測樣品，并進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說明書。根據(jù)反應(yīng)的質(zhì)量，每個(gè)擴(kuò)增系統(tǒng)的最終體積為25 μl，由50 mM KCl，10 mM pH 8.3 的Tris?HCl，4 mM MgCl2、200 mM 脫氧核苷酸三磷酸（dNTP），50 pmol 組成每個(gè)引物和2U Easy TAQ DNA Poly?merase。在PCR 儀中對引物進(jìn)行擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為：94 ℃下45 s 變性，58 ℃下45 s 退火，并于45 ℃延伸。在72 ℃下45 s，在72 ℃下5分鐘；而使用GP5+和GP6+引物進(jìn)行擴(kuò)增的條件包括：在94 ℃初始變性4分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中在94 ℃變性1分鐘，在50 ℃退火1分鐘并在72 ℃下在1分鐘內(nèi)延長15 s，此外，在1.3%瓊脂糖凝膠中使用電泳分析通過反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 不同年齡層次HPV 基因型陽性率

分析年齡<21歲、21~29歲、30~65歲以及>65歲的年齡段的HPV 基因型陽性率；

1.4.2 TCT 結(jié)果與病理診斷陽性率

分析TCT 結(jié)果（ASCUS、LSIL、HSIL、SCC）與病理診斷陽性（CINⅠ、CINⅡ、CINIII 、癌、病理陽性率（%）；

1.4.3 比較病理分級與HPV 感染情況

HR?HPV 陽 性、HPV 陰 性、HPV16+ 或HPV18+、HPV16 及HPV18 亞型感染率與病例分級比較。

1.4.4 比較HR‐HPV 感染與TCT 檢測異常比較

宮頸炎組中HR?HPV 陽性、宮頸CIN 組、宮頸浸潤癌組。

1.4.5 比較TCT 結(jié)合HR‐HPV 基因檢測

分析3 種檢測方式陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、假陽性預(yù)測值、假陰性預(yù)測值

1.4.6 ROC 曲線分析

分析3 種檢測方式的特異性和靈敏度。

1.4.7 相關(guān)性分析

以16、18、31、35、39、45、51、58、68、73 及82分型，采用Seperman 進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以率［n（%）］表示，ROC 曲線用于靈敏度與特異度分析，采用Seperman 分析檢測的相關(guān)性，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較不同年齡層次HPV 基因型陽性率

與<21 歲組比較，30~65歲組和>65歲組HR?HPVS 陽性率升高（P<0. 05）；與<21 歲組比較，>65歲組L?HPV 陽性率降低（P<0. 05）；與21~29歲組比較，30~65 歲組、>65歲組HR?HPV陽性率均升高（P<0. 05），而L?HPV 陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05）；而HPV 陰性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05）。見表1。

表1 比較不同年齡范圍HPV 基因型陽性率

2.2 比較TCT 結(jié)果與病理診斷陽性率

426例異常TCT 患者中病理陽性133例，病理陽性率31.2%，其中，ASCUS 病理陽性45例（4.37%），LSIL 病理陽性24例（38.1%），HSIL 病理陽性45例（60.81%），SCC 病理陽性率為100%，隨著TCT 檢查級別與病理陽性率成正比（P<0.05）。見表2。

表2 比較TCT 結(jié)果與病理診斷陽性率

2.3 比較病理分級與HPV 感染情況

相比于HPV16+或HPV18+，HPV16 及HPV18亞型感染率在不同病例分級（CNⅠ、CNⅡ、CNⅢ、SCC）中明顯升高（P<0.05）。見表3。

表3 比較病理分級與HPV 感染情況

2.4 高危型HR‐HPV 感染與TCT 檢測異常的比較

宮頸炎組中HR?HPV 陽性77例，感染率36.15%，宮頸CIN 組中HR?HPV 陽性58例，感染率73.41%，宮頸浸潤癌組中HR?HPV 陽性31例，感染率91.12%，提示宮頸病變病理級別與高危型HPV 感染率呈正比（P<0.05）。見表4。

表4 高危型HR‐HPV 感染與TCT 檢測異常的比較

2.5 比較TCT 結(jié)合HR‐HPV 基因檢測

TCT+HR?HPV 檢測的陰性預(yù)測值均高于單獨(dú)的T CT 和HR?HPV 檢測。見表5。

表5 比較TCT 結(jié)合HR‐HPV 檢測

2.6 ROC 曲線分析

TCT+HR?HPV 檢測敏感度及特異度均高于單獨(dú)的TCT 和HR?HPV 檢測，兩種方法聯(lián)合檢測敏感度及特異度均最高。見圖1。

圖1 TCT、HR‐HPV 和 TCT+HR‐HPV ROC 曲線分析

2.7 HPV 基因型與宮頸病變的相關(guān)性分析

以16、18、31、35、39、45、51、58、68、73 及82分型，進(jìn)行相關(guān)性分析，其中16、18、31、58、73 及82 密切相關(guān)（P<0.05）。見表6。

表6 HPV 基因型與宮頸病變的相關(guān)性分析

3 討論

宮頸病變是我國女性中常見的婦科疾病，癌變的可能性極大，長時(shí)間的HR?HPV 感染在宮頸癌的發(fā)展中起主要作用，高危型HPV 感染累計(jì)一定程度發(fā)展為宮頸原位癌。一些研究已經(jīng)報(bào)道了感染程度與HPV 類型特異性，持續(xù)存在相關(guān)聯(lián)的靈敏度損失，而另一些則未表示出此相關(guān)性。這些差異可能是HPV 檢測方法差異，因此，早期診斷和及時(shí)治療宮頸癌病變對于宮頸癌篩查尤為重要。幾種技術(shù)用于篩查宮頸癌，例如視覺檢查，陰道鏡檢查和宮頸抹片檢查，但是這些技術(shù)在檢測癌前病變方面具有較低或中等的臨床敏感性［6，7］。相反，基于實(shí)時(shí)PCR 的HPV 基因組檢測具有很高的靈敏度，而TCT 的明顯優(yōu)勢在于大大減少了阻礙視線的血液、粘液和炎細(xì)胞數(shù)量，提高篩查的準(zhǔn)確率［8，9］。本研究TTC 分型為SCC 中HR?HPV 感染率較高，采用HR?HPV 篩查可發(fā)現(xiàn)部分宮頸癌患者。然而，宮頸癌HR?HPV 篩查目的不是證實(shí)癌變患者HR?HPV 高感染率，而是在疾病早期發(fā)現(xiàn)更多的癌前病變患者，為后期治療爭取時(shí)間。

本研究發(fā)現(xiàn)，30~65歲組和>65歲組HR?HPVS陽性率升高，>65歲組L?HPV 陽性率降低，與21~29歲組比較，30~65 歲組、>65歲組HR?HPV 陽性率均升高。TCT 檢查宮頸病變級別的增高，病理陽性率隨之增加。有研究顯示，<20 歲組HR?HPV 感染率較高，但多為單次一過性HPV 感染陽性，無長期持續(xù)性感染，其組織學(xué)病理診斷多為陰性［10，11］，相比于HPV16+或HPV18+，HPV16 及HPV18 亞型感染率在不同病例分級（CNⅠ、CNⅡ、CNⅢ、SCC）中明顯升高，說明宮頸病變病理級別與高危型HPV感染率呈正比趨勢，TCT+HR?HPV 檢測的陰性預(yù)測值均高于單獨(dú)的TCT 和HR?HPV 檢測，TCT+HR?HPV 檢測敏感度及特異度均高于單獨(dú)法，而聯(lián)合檢測的敏感度及特異度均最高。同時(shí)，16、18、31、58、73及82基因型與宮頸病變密切相關(guān)。有結(jié)果顯示［12］，宮頸病變等級與HPV 感染率以及TCT 陽性率呈正比。HPV 感染和宮頸癌的相對風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到307.5。我們的研究結(jié)果與先前的研究一致。也有研究表明［13］，HR?HPV 檢測宮頸病變的敏感性和特異性分別為91.91%和84.46%。相比之下，細(xì)胞學(xué)檢查的相應(yīng)結(jié)果為80.51% 和83.12%。同時(shí)，TCT 結(jié)果與宮頸病變等級之間存在等級相關(guān)性。根據(jù)這些結(jié)果，HR?HPV 載量在診斷宮頸病變方面具有比TCT 更高的特異性，但敏感性更高［14?16］。此外，一項(xiàng)基于RCT 結(jié)果的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，HPV檢測結(jié)果陰性的女性宮頸癌的發(fā)病率明顯降低。陰道鏡檢查程序與宮頸篩查有關(guān)的潛在不良反應(yīng)包括疼痛，出血，分泌物和焦慮癥。采用HPV 檢測可提高其特異性和陽性預(yù)測價(jià)值，并減少對患者的不必要傷害。本結(jié)果顯示TCT 聯(lián)合HPV 分型檢測對宮頸病變的假陰性率較低，靈敏度更高，與先前研究結(jié)果相符。HPV 作為分流檢查的依據(jù)是在陰道鏡轉(zhuǎn)診之前根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常的人進(jìn)行的，以排除更多低危人群，從而減少了侵入性手術(shù)的機(jī)會，并為患者節(jié)約了醫(yī)療費(fèi)用。

目前，我國宮頸篩查計(jì)劃以“三步走”策略實(shí)施，包括TCT，HPV 檢測和陰道鏡檢查，并且以多種方式進(jìn)行，針對不同人群采用不同的篩查策略。其旨在以最低的成本篩查異常病例，并根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r選擇最佳的篩查方法，可以在有限的醫(yī)療費(fèi)用下為大多數(shù)女性帶來最大的收益［17，18］。因此，基層醫(yī)院應(yīng)擴(kuò)大宮頸的篩查范圍，為低成本篩查策略提供更多選擇。本研究也存在一定的局限性，納入的病例數(shù)有限，后期還需多中心、多樣本例數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，已得到更加可靠的結(jié)果。

綜上所述，聯(lián)合篩查明顯提高診斷的靈敏度，漏診率明顯降低。HPV 在宮頸癌篩查中能夠?yàn)榕R床早期篩查提供理論基礎(chǔ)，并盡早發(fā)現(xiàn)宮頸癌前期誘因。