◎ 韋華珊，劉凌雯，孔 晶，費(fèi)玉清，徐 林，陳正件,3,4

（1.珠海中科先進(jìn)技術(shù)研究院生物材料研發(fā)中心，廣東 珠海 519000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808；3.中科萱嘉醫(yī)養(yǎng)（珠海）健康科技有限公司，廣東 珠海 519000；4.珠海萱嘉君行健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，廣東 珠海 519000）

羊棲菜（Sargassum fusiforme）是一種藻類植物，又名鹿尾菜、玉海草、六角菜、海大麥藥茶等，隸屬褐藻門墨角藻目馬尾藻科，素有“長(zhǎng)壽菜”美譽(yù)[1-2]。羊棲菜的整體為黃褐色，包含莖、假根、氣囊和葉片4部分，一般株高30～50 cm，是一種重要的經(jīng)濟(jì)藻類[3]。海洋藻類是海洋中含量和功效最豐富的自然資源，富含多糖、蛋白質(zhì)、多肽、脂類、氨基酸、膳食纖維和礦物質(zhì)等活性代謝產(chǎn)物，可用于制作食品添加劑或菜肴，如可用于烹飪蔬菜湯、制備調(diào)味品和制作輕食沙拉等，其活性代謝產(chǎn)物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥、化妝品和食品等健康領(lǐng)域[4]。

根據(jù)相關(guān)研究文獻(xiàn)，羊棲菜多糖的提取方法有水提醇沉法[5]、酶提取法[6]、酸提法[7]及超聲波輔助提取[8]等方法，不同提取純化方法和多糖的結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)，梁美娜[1]等對(duì)羊棲菜多糖的提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，得知水溶液提取法的羊棲菜多糖得率在4%～10%，酶解提取法羊棲菜多糖得率在8%～19%，超聲波和微波輔助提取羊棲菜多糖的多糖得率在6%～20%。在這些研究中發(fā)現(xiàn)，水溶液提取法能很大限度保留多糖的大分子結(jié)構(gòu)，但其對(duì)目標(biāo)多糖無選擇性，雜質(zhì)較多，加大了后續(xù)分離純化的難度。酶解提取法雖然有較好的提取率，但生物酶成本高，不適合大量生產(chǎn)。酸提取法具有較好的提取率，但酸提取法只適合某些多糖的提取，適用范圍窄，除此之外還有調(diào)節(jié)pH難度較大、過酸易破壞多糖結(jié)構(gòu)等問題。這些方法基本都以水為溶劑，可是水的極性極大，選擇性低，在提取過程中容易把蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽等水溶性的成分一同提取出來，會(huì)增加后續(xù)多糖的分離純化難度。此外，在酸性或者堿性條件下多糖的糖苷鍵較為容易斷裂，導(dǎo)致多糖降解，從而影響多糖的提取效果。研究表明，離子液體（Ionic Liquids，ILs）用于多糖的溶解提取可以簡(jiǎn)化提取工藝的流程、縮短提取的時(shí)間、提高多糖的提取效率，但是，常規(guī)的離子液體在應(yīng)用中尚存在毒性和生物兼容性不明的問題[9]。因此，研究者提出一種新的試劑叫天然低共熔溶劑（Natural Deep Eutectic Solvent，NADES），NADES是由一定摩爾比的氫鍵供體和氫鍵受體通過氫鍵結(jié)合而成的一種物質(zhì)，因其與離子液體性能相似，故又叫離子液體類似物。NADES性能媲美ILs，與ILs和傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，其制備更加簡(jiǎn)單，且具有可生物降解、可回收、成本低的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)[10-11]。此外，NADES對(duì)非極性和極性化合物都具有很強(qiáng)的增溶能力，并對(duì)生物活性成分具有較高的提取效率，同時(shí)NADES可以溶解大分子物質(zhì)，因此，將NADES作為提取試劑提取有價(jià)值的生物活性成分，在食品、化妝品和制藥行業(yè)中具有巨大的發(fā)展前景[12]。

本實(shí)驗(yàn)以天然來源的生物堿和有機(jī)酸構(gòu)建了9種NADE提取羊棲菜多糖，為盡可能地保留多糖的活性，提取溫度設(shè)定為26 ℃。通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝，篩選出提取效果最好的NADES、超聲時(shí)間、料液比和NADES含水量。將最佳實(shí)驗(yàn)條件下提取的羊棲菜多糖進(jìn)行抗氧化功效檢測(cè)，為羊棲菜多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

左旋肉堿、蘋果酸，上海源葉生物技術(shù)有限公司；順丁烯二酸、無水草酸、丙二酸、無水檸檬酸、脯氨酸、丁二酸、酒石酸、葡萄糖和苯酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；濃硫酸、無水乙醇，廣州化學(xué)試劑廠。本實(shí)驗(yàn)所采用的試劑為分析純?cè)噭┗蚣兌仍?8%以上，除在實(shí)驗(yàn)中標(biāo)明之外，均未做任何純化處理。

羊棲菜（浙江食尚農(nóng)場(chǎng)）、50 mL離心管、50 mL量筒、100 mL容量瓶、100 mL塑料瓶、10 mL圓底離心管、125 mL抽濾瓶、布氏漏斗（內(nèi)徑80 mm）、玻璃表面皿、40目篩子、96孔板。

本實(shí)驗(yàn)中用到的儀器設(shè)備如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天然低共熔溶劑的制備

本實(shí)驗(yàn)采用無溶劑酸堿中和法和水相合成方法，避免有機(jī)溶劑等有毒物質(zhì)的使用。采用天然的生物堿和有機(jī)酸進(jìn)行合成制備，將左旋肉堿作為氫鍵受體與9種氫鍵供體（NADES-1：順丁烯二酸；NADES-2：草酸；NADES-3：丙二酸；NADES-4：丙酸；NADES-5：檸檬酸；NADES-6：脯氨酸；NADES-7：蘋果酸；NADES-8：丁二酸；NADES-9：酒石酸）分別按照摩爾比1∶1混合，加入特定質(zhì)量的去離子水，室溫下攪拌和超聲（40 kHz，30 W）1～5 min，直至形成9種均一、穩(wěn)定、透明的NADES溶液。

1.2.2 多糖提取

本實(shí)驗(yàn)使用NADES作為提取試劑，通過攪拌和超聲的輔助手段加速提取過程，縮短時(shí)間，提高效率；提取完后使用反溶劑法分離回收NADES和多糖的混合物，即多糖的提取物，待檢測(cè)多糖含量。

1.2.3 羊棲菜預(yù)處理

將羊棲菜用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，再過40目篩得到羊棲菜粉末。用80%乙醇對(duì)羊棲菜粉末進(jìn)行醇沉，除去原料中的脂質(zhì)、小分子酯和蛋白質(zhì)，使粗多糖以沉淀的形式分離出來。按料液比1∶10用80%乙醇處理羊棲菜粉末，磁轉(zhuǎn)2 h，然后3 000g離心20 min，取沉淀平鋪于玻璃表面皿，放進(jìn)干燥箱中干燥成粉末，即得到預(yù)處理后的羊棲菜原料樣品，可用于后續(xù)提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 羊棲菜多糖提取

稱取1.000 g羊棲菜預(yù)處理樣品加入50 mL離心管中，料液比為1∶20，NADES的含水量為40%，超聲30 min。超聲波輔助提取完成后進(jìn)行離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1，在此轉(zhuǎn)速下離心10 min，隨后收集上清液于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)向沉淀中加入20 mL去離子水充分洗滌，在3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液，重復(fù)洗滌3次，合并上述4次上清液并用去離子水定容至100 mL，即可得到多糖提取物，先放置4 ℃冰箱暫時(shí)保存，待測(cè)多糖含量。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

以去離子水為對(duì)照組，多糖含量為指標(biāo)，在9種NADES提取試劑和去離子水中選取具有最優(yōu)提取效果的NADES，并通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)羊棲菜多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。主要從超聲時(shí)間、料液比和NADES的含水量3個(gè)方面進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。

超聲時(shí)間：固定料液比為1∶20，NADES含水量為40%，探究超聲時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）對(duì)提取效果的影響。

料液比：固定NADES含水量為40%，超聲時(shí)間為最佳，探究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）對(duì)提取效果的影響。

NADES含水量：固定最佳的超聲時(shí)間和料液比，探究不同NADES的含水量（10%、20%、30%、40%、50%和60%）對(duì)提取效果的影響。

1.2.6 多糖含量的測(cè)定

本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多糖含量采用的是苯酚-硫酸法[13]。

配制6%苯酚溶液：稱取6.000 g苯酚，加入去離子水溶解，最后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容即可得到6%苯酚溶液。

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.200 g葡萄糖，溶于1 L的去離子水中配制成2 mg·mL-1的葡糖糖溶液，再吸取1 mL 2 mg·mL-1葡糖糖溶液，再加入9 mL去離子水配制成0.2 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg·mL-1）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置于10 mL試管中，加去離子水至補(bǔ)足體積為2.0 mL，再加6%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，再搖勻，隨后室內(nèi)放置30 min反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后吸取200 μL待測(cè)液于96孔板中，并于490 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算加入葡萄糖溶液的濃度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，可根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，進(jìn)而計(jì)算多糖含量和多糖的提取率。

1.2.7 羊棲菜多糖抗氧化性能的檢測(cè)

因提取的羊棲菜多糖濃度較高，故將提取得到的羊棲菜多糖提取物分別進(jìn)行5倍和10倍的稀釋，再進(jìn)行抗氧化性能的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)使用到的抗氧化性能檢測(cè)的方法有DPPH自由基清除測(cè)試法[14]和ABTS自由基清除測(cè)試法[15]。

DPPH是1，1-二苯基-2-三硝基苯肼的簡(jiǎn)稱，是一種穩(wěn)定的自由基，將其溶于乙醇溶液會(huì)呈深紫色，并且在517 nm附近有強(qiáng)吸收峰。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH與自由基清除劑的單電子配對(duì)而使DPPH乙醇溶液褪色，導(dǎo)致光吸收減弱。因?yàn)镈PPH乙醇溶液褪色程度與DPPH接受的電子數(shù)呈線性關(guān)系，可由此評(píng)價(jià)檢測(cè)樣品清除DPPH自由基的能力，從而得到檢測(cè)樣品的抗氧化活性。

ABTS法是利用顯色劑ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟聲?huì)被氧化成綠色的ABTS+，ABTS自由基在波長(zhǎng)734 nm有吸收峰，可在此波長(zhǎng)下測(cè)定ABTS的吸光度得出樣品的總抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)使用過硫酸鉀（K2S2O8）作為氧化劑與ABTS反應(yīng)直接生成穩(wěn)定的陽離子自由基ABTS+，如果加入具有抗氧化性能的物質(zhì)，則會(huì)與ABTS+發(fā)生反應(yīng)，減少綠色的ABTS自由基的含量，從而使反應(yīng)體系褪色。

式中：A0代表空白對(duì)照組吸光度；Ai代表檢測(cè)樣品吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 羊棲菜多糖提取效果

以去離子水為對(duì)照組，多糖含量為指標(biāo)，在9種NADES提取試劑和去離子水中選取具有最優(yōu)提取效果的NADES，結(jié)果如圖1所示。從中可以看出，NADES-7對(duì)羊棲菜的提取效果最佳，提取率達(dá)9.39%，比去離子水高2.19%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

通過9種NADES和去離子水對(duì)羊棲菜多糖的提取效果可知，由左旋肉堿和蘋果酸合成的NADES-7的提取效果最佳，故以NADES-7為提取試劑進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步提高羊棲菜多糖的提取效果，進(jìn)而優(yōu)化羊棲菜多糖提取工藝。

2.2.1 超聲時(shí)間

在1∶20為料液比，NADES含水量為40%的實(shí)驗(yàn)條件下，探究不同超聲時(shí)間對(duì)羊棲菜提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。在固定料液比和提取試劑含水量的條件下，隨著超聲時(shí)間的增加，多糖的提取總體效率趨勢(shì)呈現(xiàn)為先增后減，在40 min時(shí)達(dá)到峰值，故選取最佳超聲時(shí)間為40 min。在20 min時(shí)其提取效率較10 min下降了0.19%，在誤差范圍內(nèi)；在40 min之后增加超聲時(shí)間提取率反而下降，有可能是超聲導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響多糖的提取效果。

2.2.2 料液比

在固定超聲時(shí)間40 min，提取試劑的含水量為40%的實(shí)驗(yàn)條件下，探究不同料液比對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。從中可以看出，隨著料液比的數(shù)值變化，加入的提取試劑逐漸增加，多糖的提取率總體趨勢(shì)是上升的，在料液比達(dá)到1∶50時(shí)提取效率曲線趨于平緩。在圖3中料液比1∶30較1∶20的多糖提取率下降了0.25%，在誤差范圍內(nèi)，故建議選擇料液比為1∶50。

2.2.3 含水量

作為多糖提取試劑，NADES存在一個(gè)問題，其黏度較高，限制了它在提取方面的應(yīng)用。因此，為了降低黏度，采用不同含水量的NADES進(jìn)行多糖的提取。不同的含水量會(huì)影響NADES的增溶能力以及反應(yīng)效率，在NADES中加入水，可以調(diào)節(jié)NADES的黏度以及物理性質(zhì)。當(dāng)含水量過低時(shí)，NADES具有較高黏度，會(huì)阻礙其穿透細(xì)胞壁，影響提取效率。當(dāng)水的含量在合適范圍內(nèi)，NADES的超分子復(fù)雜結(jié)構(gòu)可以得以保留，而進(jìn)一步稀釋，結(jié)構(gòu)則會(huì)被破壞，形成各組分的混合溶液，NADES在稀釋過程中結(jié)構(gòu)的逐漸變化會(huì)影響其理化性質(zhì)和應(yīng)用。

在固定超聲時(shí)間為40 min，料液比為1∶50的實(shí)驗(yàn)條件下，探究不同NADES含水量對(duì)羊棲菜多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著NADES含水量的增加，NADES-7對(duì)羊棲菜多糖的提取效率先增加后減少，在50%出現(xiàn)峰值，提取率為13.82%，因此選擇NADES含水量為50%。在NADES含水量為10%和20%時(shí)羊棲菜多糖的提取率相同，可能是NADES黏度較高，對(duì)多糖的提取效果無較大的差別。

2.3 羊棲菜多糖抗氧化性能的測(cè)定

羊棲菜多糖抗氧化性能如表2所示。從中可以看出，羊棲菜多糖對(duì)DPPH和ABTS自由基均具有良好的清除效率。尤其是在無稀釋的情況下，羊棲菜多糖提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率分別高達(dá)68.70%和98.89%，遠(yuǎn)高于5 μg·mL-1維生素C陽性對(duì)照組的43.27%和62.79%。隨著稀釋，羊棲菜多糖提取物的抗氧化性能顯著下降。稀釋5倍時(shí)，DPPH和ABTS的清除率分別只有8.47%和60.00%。而當(dāng)稀釋10倍時(shí)，羊棲菜多糖提取物的抗氧化性幾乎可以忽略不記。

表2 DPPH或ABTS自由基的清除率表

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取的方法，利用9種生物酸作為氫鍵供體與左旋肉堿作為氫鍵受體合成9種的NADES對(duì)羊棲菜進(jìn)行多糖的提取，考察不同提取試劑提取羊棲菜多糖的效果，并進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，考察超聲時(shí)間、料液比和NADES的含水量對(duì)羊棲菜多糖提取效率的影響，并且后續(xù)將提取得到的羊棲菜多糖進(jìn)行抗氧化性能的測(cè)定。結(jié)果表明，9種不同NADES對(duì)羊棲菜多糖提取具有良好的提取效率，其中由左旋肉堿和蘋果酸合成制備的NADES-7對(duì)羊棲菜多糖的提取效果最佳，可達(dá)到9.39%。通過單因素實(shí)驗(yàn)得到NADES-7對(duì)羊棲菜多糖的最佳提取條件是超聲時(shí)間為40 min、料液比為1∶50、NADES含水量為50 %，其提取率可達(dá)到13.82%。通過對(duì)優(yōu)化提取工藝后的羊棲菜多糖進(jìn)行抗氧化性能的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖具有較好的抗氧化性能，其中未進(jìn)行稀釋的羊棲菜多糖的濃度為0.008 64 g·mL-1，其對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率分別達(dá)到68.70%和98.89%，較陽性對(duì)照維生素C的清除率高1.5倍左右。兩項(xiàng)自由基清除測(cè)試均表明提取的羊棲菜多糖具有很好的抗氧化性，由此羊棲菜多糖可以應(yīng)用到食品、化妝品和生物醫(yī)藥等健康領(lǐng)域。