小鼠腸道乳酸菌定植機(jī)制與影響分析

◎ 張艷艷

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧 沈陽 110000）

乳酸菌是基于發(fā)酵碳水化合物生成眾多乳酸細(xì)菌的集合體，其在益生菌家族當(dāng)中，屬于十分關(guān)鍵的菌株之一，其在參與改善腸道菌群平衡狀態(tài)、參與免疫應(yīng)答以及抑制腸道病原菌生長繁殖等一系列益生功能方面，有著不容忽視的作用[1-2]。從人體內(nèi)乳酸菌數(shù)量和種類最為豐富的部位——消化道來看，乳酸菌種類與數(shù)量也由于消化道部位的區(qū)別，而有著比較明顯的差異。其中，胃中的乳酸菌數(shù)量相對最少，這是因?yàn)槲杆峥梢詫⒁恍┤樗峋鷼⑺?。但在盲腸和結(jié)腸當(dāng)中乳酸菌數(shù)量相對較多，介于106～1010CFU·g-1[3-5]。

在本試驗(yàn)當(dāng)中，運(yùn)用平板培養(yǎng)的方式，分離出傳統(tǒng)發(fā)酵食品當(dāng)中所包含的乳酸菌，篩選出不同類型的乳桿菌各1株，將其制作成為混合菌，完成液灌胃小鼠工作[6]。借助于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，進(jìn)一步檢測灌胃混合菌液之前、之后小鼠糞便當(dāng)中6種不同乳桿菌數(shù)量所發(fā)生的具體變化，由此探索菌株具有的定植特性，掌握乳桿菌在小鼠腸道當(dāng)中的定植能力狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

東北酸菜、酸奶，均來自市面銷售；陳醋醋醅，源自陳醋醋酸發(fā)酵時(shí)期；發(fā)酵面團(tuán)，源自農(nóng)家自制的老面團(tuán)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4；Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒，由北京聯(lián)立信生物科技有限公司所生產(chǎn)；Taq DNA酶、dNTPs、10×PCR buffer，由天根生化科技有限公司所生產(chǎn)；SYBR Green Supermix，BIORAD；瓊脂糖回收試劑盒，由天根生化科技有限公司所生產(chǎn)；其他相關(guān)的化學(xué)試劑，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司所生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離和鑒定工作

將不同類型的發(fā)酵食品樣品相繼在生理鹽水當(dāng)中進(jìn)行振蕩處理，對上述樣品溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇相符的稀釋度，開展MRS平板涂布工作，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中，培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)48 h。在看到長出單菌落的情況下，挑選出不同形態(tài)與大小的菌落進(jìn)行劃線純化處理。在完成3次分離純化工作之后，針對菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并且最終確定菌株所處的形態(tài)。將完成鏡檢之后的菌株接種在MRS液體培養(yǎng)基當(dāng)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并將其保存在MRS斜面培養(yǎng)基當(dāng)中，在4 ℃冰箱環(huán)境中進(jìn)行保藏與備用。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

將用于實(shí)驗(yàn)研究的16只小鼠隨機(jī)分成兩組，一組作為實(shí)驗(yàn)組，而另外一組則作為對照組。兩組小鼠在經(jīng)過1周時(shí)間的適應(yīng)期之后，進(jìn)入干預(yù)期。在干預(yù)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組每天灌胃總量應(yīng)達(dá)到6×108CFU的混合菌粉，灌胃時(shí)間為2周。對照組小鼠灌胃相同總量的脫脂乳。收集兩組不同的小鼠在灌胃之前，以及灌胃之后4 d、6 d、8 d、10 d、12 d和14 d的糞便樣品，在-80 ℃環(huán)境下進(jìn)行保存和備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定結(jié)果及試驗(yàn)菌株

從不同發(fā)酵食品當(dāng)中，經(jīng)過分離可以得到不同類型的乳酸菌，針對分離得到的菌株予以16S rDNA序列分析以及BLAST比對工作，進(jìn)而明確菌株的相應(yīng)種屬，結(jié)果見表1。從表1可以了解到，從市面銷售的酸奶當(dāng)中分離得到鼠李糖乳桿菌與保加利亞乳桿菌，從陳醋醋醅當(dāng)中分離得到干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌，從東北酸菜中分離得到植物乳桿菌，從老面團(tuán)當(dāng)中分離得到酵乳桿菌。從分離得到的6種不同菌株當(dāng)中，篩選出6株乳桿菌（植物乳桿菌H7、干酪乳桿菌C6、鼠李糖乳桿菌Y4、發(fā)酵乳桿菌Z1、瑞士乳桿菌C36和保加利亞乳桿菌Y3）開展后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而測定其在小鼠腸道當(dāng)中所具有的定植能力。

表1 不同類型發(fā)酵食品中分離的具體結(jié)果表

2.2 乳桿菌在小鼠腸道的定植能力

采集實(shí)驗(yàn)組小鼠在灌胃混合菌液之前與之后的糞便樣品。借助于Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒，提取糞便樣品的相應(yīng)基因組DNA。將以上基因組DNA作為模板，運(yùn)用6對乳桿菌特異性引物，開展熒光定量PCR擴(kuò)增工作，進(jìn)而獲得Ct值。將不同乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成為拷貝數(shù)，由此得到每克糞便樣品當(dāng)中所包含的6種乳桿菌量。對比接受乳桿菌處理之前與之后的小鼠糞便當(dāng)中以上乳桿菌實(shí)際含量，在后者超出前者的情況下，則代表喂食的乳桿菌在小鼠腸道內(nèi)部定植，可持續(xù)觀察并對比每株菌具體的定植量。依次測定處在適應(yīng)期最后1 d時(shí)間，以及完成灌胃4 d、6 d、8 d、10 d、12 d和14 d時(shí)間的小鼠糞便樣品當(dāng)中所包含的6種乳桿菌量，結(jié)果見表2。

表2 不同小鼠糞便樣品中6種不同乳桿菌的含量表

由表2當(dāng)中能夠了解到，在灌胃完成后的兩周時(shí)間內(nèi)，小鼠糞便當(dāng)中植物乳桿菌及干酪乳桿菌的量明顯超出了灌胃之前的含量，可見植物乳桿菌H7與干酪乳桿菌C6均已超出腸道中該種菌原始狀態(tài)一個(gè)數(shù)量級的水平，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)至少定植14 d。而對于瑞士乳桿菌C36、鼠李糖乳桿菌Y4以及發(fā)酵乳桿菌Z1來講，則并未在小鼠腸道內(nèi)部定植。保加利亞乳桿菌Y3通過相對較少的定植量，實(shí)現(xiàn)了定植8 d。

借助于特異性PCR引物開展熒光定量PCR，能夠有效定量糞便樣品當(dāng)中包含的不同乳桿菌。經(jīng)過一系列的檢驗(yàn)，此類引物有著良好的特異性，可以抵抗同屬不同種乳桿菌帶來的干擾。6種乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線有著較高的相關(guān)性，可見PCR所處的條件十分適宜，引物特異性相對良好，這一方法可以應(yīng)用在糞便樣品乳桿菌的有關(guān)定量檢測工作方面。將小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，檢測6株乳桿菌在腸道當(dāng)中具有的定植能力。從結(jié)果得知，不同菌株具有的定植能力差異比較明顯，而定植能力大小在不同種間是否也具有差異，仍需要予以深入研究。

3 結(jié)論

現(xiàn)階段，針對乳酸菌在腸道定植的研究已經(jīng)有了相關(guān)成果，但定植機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。雖然當(dāng)前已有體外黏附模型便于開展乳酸菌在腸道定植機(jī)制研究工作，但其體外模型無法體現(xiàn)出乳酸菌在腸道環(huán)境內(nèi)部最為精確的定植效果。因此，建立出科學(xué)有效的定植能力的評估方法不容忽視。與此同時(shí)，復(fù)雜腸道環(huán)境中不同因素的干擾為乳酸菌在示蹤和定量方面帶來不容忽視的挑戰(zhàn)。今后研究的重點(diǎn)，應(yīng)針對此類環(huán)境干擾因素，開發(fā)出不同的示蹤技術(shù)、定量方法以及借助于和其他組學(xué)結(jié)合予以相關(guān)的研究，力求追蹤乳酸菌在復(fù)雜腸道環(huán)境下的具體定植位點(diǎn)，外加準(zhǔn)確判斷出定植時(shí)間與數(shù)量。此外還應(yīng)和其他學(xué)科密切結(jié)合，如運(yùn)用新型納米材料、軟件分析等有關(guān)的技術(shù)，對乳酸菌腸道定植機(jī)理開展更加精確與深層次的研究工作。未來還應(yīng)探索影響菌株定植能力的一系列因素，以期借助于體外篩選的方式，獲得有著良好定植能力的眾多潛力益生菌。