梁正，范穎欣，聶署萍

1 中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518033；2 廣東省興寧市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

近年來(lái)，細(xì)菌耐藥已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。細(xì)菌的藥物敏感性測(cè)定能指導(dǎo)臨床合理用藥，避免抗生素的濫用，延緩耐藥菌的產(chǎn)生［1-3］。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的常規(guī)方法主要有肉湯稀釋法、K-B 紙片擴(kuò)散法、E-test 及自動(dòng)化藥敏分析系統(tǒng)。自動(dòng)化藥敏分析系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、易標(biāo)準(zhǔn)化，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室［4-10］。BD Phoenix 和VITEK 2 Compact 是目前應(yīng)用最為廣泛的全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)［11-15］。革蘭陽(yáng)性細(xì)菌藥敏板PMIC-92 和革蘭陰性細(xì)菌藥敏板NMIC-413是根據(jù)臨床市場(chǎng)特征和病原菌流行病學(xué)現(xiàn)狀而設(shè)計(jì)的兩款新型藥物敏感性檢測(cè)試劑板。與其他商品化的藥敏檢測(cè)試劑相比，PMIC-92 和NMIC-413 藥敏板增加了抗菌藥物數(shù)量，如PMIC-92藥敏板包括磷霉素、米諾環(huán)素、頭孢洛林等，NMIC-413 藥敏板包括磷霉素、替加環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素等，為臨床抗感染藥物的選擇提供更多支持，進(jìn)一步提高了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌藥物敏感性的檢測(cè)能力。此外，這兩種藥敏板還依據(jù)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)特定藥物擴(kuò)大了MIC 檢測(cè)范圍。目前，國(guó)內(nèi)評(píng)估這兩種藥敏板檢測(cè)性能的研究少見。本研究以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的VITEK 2 Compact 系統(tǒng)結(jié)合K-B 紙片擴(kuò)散法作為參比方法，評(píng)估PMIC-92、NMIC-413 藥敏板對(duì)臨床菌株的藥敏檢測(cè)性能。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2018 年7—10 月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院微生物室從臨床送檢各類標(biāo)本中分離的40 株臨床株［革蘭陽(yáng)性菌17 株（葡萄球菌13 株、腸球菌4 株）、革蘭陰性菌23 株（腸桿菌科細(xì)菌15株、非發(fā)酵菌8 株）］及4 株實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株（大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212）。標(biāo)準(zhǔn)菌株使用前通過(guò)甘油肉湯保存于-80 ℃環(huán)境中。復(fù)蘇后每天檢測(cè)3次，重復(fù)5 d，各測(cè)15 次。

1.2 主要儀器與試劑 BD Phoenix M50 全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀及其配套NMIC-413 陰性細(xì)菌藥敏檢測(cè)板和PMIC-92 陽(yáng)性細(xì)菌藥敏檢測(cè)板。BD Phoenix 鑒定及藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)液，藥敏指示劑（美國(guó)BD 公司）。Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀、Vitek 2 Compact GN 和GP 鑒定卡、Vitek 2 Compact AST-GN13、AST-GN335 及ASTGP639 藥敏卡（法國(guó)生物梅里埃公司）、藥敏紙片（英國(guó)OXOID 公司）、血瓊脂平板（安圖）、MH 瓊脂平板（凱林）、游標(biāo)卡尺、比濁儀、渦旋儀。

1.3 細(xì)菌藥敏檢測(cè) 將菌株接種至含有5%羊血的血瓊脂平板上，在35 ℃環(huán)境中孵育18～24 h。從平板上挑取單個(gè)菌落，傳代1 次。然后分別按照BD Phoenix M50 及Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀操作規(guī)程進(jìn)行操作。對(duì)于部分Vitek 2 Compact 無(wú)法檢測(cè)的藥物，補(bǔ)充K-B 紙片擴(kuò)散法檢測(cè)。藥敏結(jié)果參考CLSI2020 的折點(diǎn)報(bào)告其敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）結(jié)果，當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)重大差異（MD）和極重大差異（VMD）時(shí)，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。①BD Phoenix M50 PMIC-92 和NMIC-413 藥 敏檢測(cè)：a.用無(wú)菌棉拭子，挑取單個(gè)菌落在鑒定肉湯管中，配置成0.50～0.60 麥?zhǔn)蠞舛鹊木?。b.取一只藥敏肉湯管，加入45 μL 藥敏指示劑，混勻。從鑒定肉湯管中吸取25 μL 菌懸液，加入藥敏肉湯中。c.把含有菌液的藥敏肉湯管傾倒入相應(yīng)檢測(cè)板的填充端口中，陽(yáng)性球菌使用PMIC-92 檢測(cè)板，陰性桿菌菌選擇NMIC-413，讓液體沿檢測(cè)板軌道來(lái)回流動(dòng)，然后再將檢測(cè)板按照儀器操作流程上機(jī)檢測(cè)。②Vitek 2 Compact AST-GN13、ASTGN335 及AST-GP639 藥敏 檢 測(cè)：a.將一次 性 塑料試管放置在載卡架上，每管中加入3 mL 的0.45%NaCl 溶液。b.用無(wú)菌棉拭子，挑取單個(gè)菌落在含NaCl 溶液的塑料試管中，配置成0.5～0.63 麥?zhǔn)蠞舛鹊木?。c.分別將145 μL（AST GN）或280 μL（AST GP）配制好的菌懸液加入新的含NaCl 溶液塑料試管中，做為藥敏管。d.將相應(yīng)藥敏卡片的輸樣管插入到藥敏管中，然后將載卡架加載至機(jī)器上進(jìn)行檢測(cè)。③K-B 紙片擴(kuò)散法藥敏檢測(cè)：由于部分細(xì)菌—抗生素組合如腸桿菌科—頭孢哌酮/舒巴坦及頭孢呋辛，銅綠假單胞菌—氨曲南，鮑曼不動(dòng)桿菌—阿米卡星及氨芐西林/舒巴坦等，通過(guò)Vitek 2 Compact 相應(yīng)藥敏卡無(wú)法獲得準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，以上抗菌藥物通過(guò)K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行比對(duì)。具體步驟如下：a.用無(wú)菌棉拭子，挑取單個(gè)菌落在0.45%NaCl 溶液中，配置成0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊木?。b.接種：用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂抹接種3 次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1 周。c.貼抗菌藥物紙片：平板置室溫干燥3～5 min，用紙片分配器或無(wú)菌鑷子將含藥紙片緊貼在瓊脂表面，各紙片中心相距＞24 mm，紙片距平板內(nèi)緣＞15 mm。d.孵育：置35 ℃孵育16～18 h 后判讀結(jié)果。e.結(jié)果判讀：用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（抑菌圖的邊緣應(yīng)是無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的區(qū)域），測(cè)量時(shí)應(yīng)將平板置于黑色背景下，肉眼判讀；按照CLSI 2020 的折點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行解釋。

1.4 藥敏結(jié)果分析 a.總分類一致性（CA）：研究產(chǎn)品與參比方法判斷試驗(yàn)結(jié)果為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R），結(jié)果完全一致。b.小誤差（MIE）：研究產(chǎn)品將中介判為S 或R，將R 或S 判為I。c.重大差異（MD）：研究產(chǎn)品結(jié)果為R，參比方法結(jié)果為S。d.極重大差異（VMD）：研究產(chǎn)品結(jié)果為S，參比方法結(jié)果為R。

2 結(jié)果

針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌藥敏板PMIC-92 共評(píng)估了14種抗菌藥物，分別為青霉素（47 株）、苯唑西林（28株）、替考拉寧（47 株）、萬(wàn)古霉素（47 株）、利奈唑胺（47 株）、紅霉素（47 株）、克林霉素（28 株）、替加環(huán)素（47 株）、左氧氟沙星（47 株）、莫西沙星（28 株）、慶大霉素（28 株）、達(dá)托霉素（47 株）、利福平（28 株）及復(fù)方磺胺甲噁唑（28 株）。產(chǎn)生MIE 的細(xì)菌—抗生素組合（株數(shù)）為：金黃色葡萄球菌—利福平（1 株），屎腸球菌—利奈唑胺（1株）。產(chǎn)生MD 的細(xì)菌—抗生素組合（株數(shù)）為：金黃色葡萄球菌—青霉素（1 株），金黃色葡萄球菌—慶大霉素（1 株），沃氏葡萄球菌—復(fù)方磺胺甲噁唑（1 株）。無(wú)極重大差異（VMD）的細(xì)菌—抗生素組合。PMIC-92 比對(duì)了14 種抗菌藥物，在544株細(xì)菌—抗生素組合，總分類一致性（CA）為99.08%，小誤差（MIE）率為0.37%，重大差異（MD）率為0.55%。此外，在13 株臨床分離的葡萄球菌中，PMIC-92 檢出耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）5 株，與Vitek 2 Compact AST-GP639 的符合率為100%。

針對(duì)革蘭陰性菌藥敏板NMIC-413 共評(píng)估了17 種藥物，分別為頭孢呋辛（28 株）、頭孢曲松（29 株）、氨芐西林/舒巴坦（29 株）、哌拉西林/他唑巴坦（51 株）、頭孢他啶（51 株）、頭孢吡肟（51株）、頭孢哌酮/舒巴坦（51 株）、氨曲南（49 株）、亞胺培南（51 株）、厄他培南（26 株）、美羅培南（21 株）、阿米卡星（49 株）、左氧氟沙星（51 株），環(huán)丙沙星（47 株）、復(fù)方磺胺甲噁唑（49 株），慶大霉素（29 株）、妥布霉素（19 株）。產(chǎn)生MIE 的細(xì)菌—抗生素組合（株數(shù)）為：大腸埃希菌—亞胺培南（1 株）、銅綠假單胞菌—美羅培南（1 株）、木糖氧化無(wú)色桿菌—頭孢他定（1 株）、大腸埃希菌—頭孢吡肟（1 株）、銅綠假單胞菌—氨曲南（1 株）、沙門菌屬—環(huán)丙沙星（1 株）、大腸埃希菌—氨芐西林/舒巴坦（1 株）。產(chǎn)生MD 的細(xì)菌—抗生素組合（株數(shù)）為：大腸埃希菌—頭孢吡肟（2 株）、大腸埃希菌—頭孢哌酮/舒巴坦（1 株）、木糖氧化無(wú)色桿菌—頭孢哌酮/舒巴坦（1 株）、銅綠假單胞菌—復(fù)方磺胺甲噁唑（1 株）、嗜麥芽窄食單胞菌—復(fù)方磺胺甲噁唑（1 株）、銅綠假單胞菌—亞胺培南（1 株）、大腸埃希菌—慶大霉素（1 株）。產(chǎn)生極重大差異VMD 的細(xì)菌—抗生素組合（株數(shù)）為：大腸埃希菌—氨芐西林/舒巴坦（1 株）。NMIC-413 共比對(duì)了17 種抗菌藥物，在全部681 株細(xì)菌—抗生素組合中，總CA 為97.65%，MIE 率為1.03%，MD 率為1.17%，VMD 率為0.15%。在13株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床株中，NMIC-413 檢 出10 株 產(chǎn)ESBL 細(xì) 菌，與Vitek 2 Compact AST-GN13 的符合率為100%。

3 討論

近年來(lái)，由于抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，嚴(yán)重威脅著人類健康［2-3］。快速、準(zhǔn)確的藥敏檢測(cè)已成為臨床抗感染治療的迫切需求，不僅能指導(dǎo)臨床合理用藥，提高療效，節(jié)省費(fèi)用，還能進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，為抗菌藥物的臨床使用及管理提供依據(jù)。全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)因其操作簡(jiǎn)單、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)，越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床微生物室［4-8］。BD Phoenix 是目前全球應(yīng)用最為廣泛的全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)之一，其藥敏試驗(yàn)采用比濁法和氧化還原法，報(bào)告實(shí)測(cè)最小抑菌濃度，結(jié)果準(zhǔn)確可靠［16-18］。陽(yáng)性菌藥敏板PMIC-92 和陰性菌藥敏板NMIC-413 是兩款藥物敏感性檢測(cè)板，與其他商品化藥敏檢測(cè)試劑比較，PMIC-92 和NMIC-413 增加了抗菌藥物數(shù)量，如在腸桿菌目細(xì)菌藥敏檢測(cè)中，陰性菌藥敏板NMIC-413 與Vitek 2 Compact AST-GN13 相比增加了磷霉素、美羅培南、米諾環(huán)素、頭孢呋辛、頭孢西丁、莫西沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、多粘菌素等藥物；PMIC-92 與VITEK 2 GP39 相比增加了替考拉寧、諾氟沙星、呋喃妥因等藥物，為臨床抗感染疾病的治療提供更多選擇。為評(píng)估其藥敏檢測(cè)性能，本研究將PMIC-92、NMIC-413 藥敏板與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Vitek 2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì)，部分Vitek 2 Compact 無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)的抗菌藥物，則通過(guò)與K-B 紙片擴(kuò)散法比較對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

本研究選取的評(píng)估菌株包括4 株標(biāo)準(zhǔn)株和40 株臨床分離株，臨床分離株中17 株革蘭陽(yáng)性菌及23 株革蘭陰性菌，可以代表大多數(shù)臨床相關(guān)致病菌。針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌藥敏板PMIC-92 共評(píng)估了14 種抗菌藥物，在544 株細(xì)菌—抗生素組合，總CA 為99.08%，MIE 率為0.37%，MD 率為0.55%，表明其藥敏測(cè)定的準(zhǔn)確性，對(duì)于部分細(xì)菌—抗生素藥敏測(cè)定的MD＞3%，如金黃色葡萄球菌—慶大霉素，沃氏葡萄球菌—復(fù)方磺胺甲噁唑等，主要是由于本研究中針對(duì)該抗生素的菌株數(shù)量較少。此外，PMIC-92 成功檢出5 株MRS，敏感性和特異性均為100%。

本研究針對(duì)革蘭陰性菌藥敏板NMIC-413 共評(píng)估了17 種藥物，在全部681 株細(xì)菌—抗生素組合中，總CA 為97.65%，MIE 率為1.03%，MD 率為1.17%，VMD 率為0.15%。部分細(xì)菌—抗生素藥敏測(cè)定的MD＞3%，如大腸埃希菌—頭孢吡肟、大腸埃希菌—頭孢哌酮/舒巴坦、木糖氧化無(wú)色桿菌—頭孢哌酮/舒巴坦，嗜麥芽窄食單胞菌—復(fù)方磺胺甲噁唑，均是由于臨床菌株數(shù)量不夠?qū)е拢罄m(xù)應(yīng)加大菌株的數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證這些抗生素的藥敏試驗(yàn)測(cè)定性能。本研究中僅1 株大腸埃希菌—氨芐西林/舒巴坦出現(xiàn)了VMD。HONG 等［19］用825株臨床分離株來(lái)評(píng)價(jià)NMIC-413 藥敏測(cè)定性能，研究發(fā)現(xiàn)除了腸球菌—環(huán)丙沙星，不動(dòng)桿菌屬—頭孢吡肟組合外，其他細(xì)菌—抗生素組合中CA 均超過(guò)90%，與本研究結(jié)果一致。此外，NMIC-413 還檢測(cè)出10 株產(chǎn)ESBL 腸桿菌科細(xì)菌，與Vitek 2 Compact的符合率為100%。研究［20］評(píng)估了BD Phoenix NMIC-413 藥敏板檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌碳青霉烯類藥物敏感性試驗(yàn)的性能，結(jié)果表明與微量肉湯稀釋法及紙片法相比，BD Phoenix NMIC-413 藥敏板能更可靠的檢測(cè)碳青霉烯類耐藥的腸桿菌目細(xì)菌。充分表明革蘭陰性菌藥敏板NMIC-413 能對(duì)臨床常見的革蘭陰性菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的藥敏測(cè)定。

總之，藥敏板PMIC-92 和NMIC-413 能分別對(duì)臨床分離的革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的藥物敏感性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的測(cè)定，可應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏檢測(cè)。