鄧玲玲 歐陽博書 魏 穎 董競成△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 上海 200040；2復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 上海 200040）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因未明，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化以及肺組織中細(xì)胞外基質(zhì)過度積累的慢性進(jìn)展性間質(zhì)性纖維化肺炎，好發(fā)于60～70 歲的老年人，是臨床上最常見的間質(zhì)型肺炎類型［1］，預(yù)后較差，中位生存期多為3～5 年，生存率甚至低于肺癌［2］。目 前IPF 的 治 療 藥 物 為2015 年 美 國FDA 批準(zhǔn)的吡菲尼酮和尼達(dá)尼布，僅能改善患者癥狀，提高用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），不能延緩纖維化進(jìn)展。越來越多的證據(jù)支持肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）在IPF 發(fā)病機(jī)制中的作用，本文對特發(fā)性肺纖維化中EMT 相關(guān)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展作一綜述。

EMT 定義EMT 是一種上皮細(xì)胞去分化為可分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的間充質(zhì)細(xì)胞，使纖維化病情長期存在，導(dǎo)致肺組織硬度增加［3］，上皮細(xì)胞失去頂端基底極性，減少細(xì)胞間黏附特性，獲得間質(zhì)標(biāo)記物如α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin ，α-SMA），N 鈣 黏 蛋 白（Ncadherin），波形蛋白（vimentin），EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，以及細(xì)胞骨架的重組過程［4-5］。EMT 有3 種不同的功能類型：Ⅰ型與胚胎發(fā)育過程中組織和器官形成的生理過程有關(guān)；Ⅱ型為正常的傷口愈合，在IPF 中表現(xiàn)為肺部組織過度修復(fù)；Ⅲ型是指惡性上皮細(xì)胞獲得遷移性表型，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。

EMT 在肺纖維化中的作用IPF 的組織病理學(xué)特征表現(xiàn)為肺基底部和側(cè)部的進(jìn)行性瘢痕形成且呈不均勻性分布［6］。這些瘢痕區(qū)域的顯著標(biāo)志是存在成纖維細(xì)胞簇（fibroblast foci，F(xiàn)F）——產(chǎn)生ECM 的成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的集合［6］，位于正常和纖維化組織的邊界處，代表組織重塑或瘢痕增生的前沿［7］。多年來，關(guān)于IPF 成纖維細(xì)胞簇中成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的來源一直存在爭議，大部分學(xué)者認(rèn)為其主要來源于常駐組織成纖維細(xì)胞、骨髓源性祖細(xì)胞（所謂的纖維母細(xì)胞）和EMT來源的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（ATⅡ）［8］。在肺纖維化小鼠模型中進(jìn)行的體內(nèi)譜系追蹤實驗已證明，表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)志物的細(xì)胞具有上皮來源特性［9］。來源于EMT 的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)導(dǎo)致肺纖維化的進(jìn)展，在肺纖維化的病理生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［10］。因此，闡明EMT 相關(guān)信號通路，研究靶向EMT 的藥物可能是治療肺纖維化的主要途徑。

EMT 信號的激活組織微環(huán)境可以決定細(xì)胞是否發(fā)生EMT［11］。在慢性病中，損傷部位的微環(huán)境表現(xiàn)出乏氧、慢性炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子分泌紊亂、胞外基質(zhì)硬度增加等作為EMT 潛在的觸發(fā)因素。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（蛋白質(zhì)異常折疊）在肺纖維化的機(jī)制中研究緊密［12-13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指細(xì)胞受到各種刺激導(dǎo)致胞內(nèi)未折疊蛋白發(fā)生或折疊錯誤的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的積累，引發(fā)下游信號通路的激活，導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能異常和肺纖維化［14-16］。研究表示過表達(dá)突變體的肺表面活性蛋白C（surfactant，pulmonary-associated protein C，SP-C）會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和EMT［17］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白需肌醇酶1（inositol-requiring protein-1，IRE1）/X 盒結(jié)合蛋白1（X box-binding protein 1，XBP1）信號通路可通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子snail 的表達(dá)促進(jìn)EMT 的進(jìn)展，從而引起纖維變性［18］。此外，越來越多的證據(jù)支持胞外基質(zhì)的硬度增加不僅是纖維化的結(jié)果，而且可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的激活，正反饋加重纖維化的程度［19］。近期，唐楠團(tuán)隊驗證了持續(xù)的胞外機(jī)械張力升高可以激活A(yù)TⅡ細(xì)胞中的TGF-β 信號環(huán)路，從而驅(qū)動了肺纖維化病理從周圍到中央的進(jìn)展變化，高度模擬人體肺纖維化的病理特征，確立了肺泡再生受損、機(jī)械張力下降和進(jìn)行性肺纖維化之間的直接機(jī)制聯(lián)系［20］。未來以細(xì)胞外基質(zhì)為信號激活起始的新視角可能會極大地促進(jìn)我們對IPF 和其他纖維化疾病的理解。

EMT 相關(guān)的信號通路研究顯示，調(diào)控EMT的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括TGF-β-Smad、Wnt/βcatenin、Hippo、Notch、NF-κB 通路等（圖1），下面以前三個為例詳細(xì)介紹。

圖1 EMT 主要信號通路流程圖Fig 1 Flow chart of EMT related major signaling pathways

TGF- β -Smad 通 路 轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 β（transforming growth factor-beta，TGF-β）是 驅(qū) 動EMT 的 關(guān) 鍵 生 長 因 子。TGF-β 家 族 包 括3 個 轉(zhuǎn) 化生長因子β、2 個激活素（activins）、多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）和其他配體的同二聚體和異二聚體，它們都通過跨膜雙特異性激酶受體（即充當(dāng)Ser/Thr/Tyr 激酶的受體）的二元組合起作用［21］。肺泡上皮細(xì)胞通過整合素αvβ6結(jié)合潛伏的TGF［22］，活化TGFβ1，觸發(fā)信號蛋白Smad2/3 的磷酸化，與Smad4 形成復(fù)合物并易位入核［23］，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子SNAI1、SNAI2、ZEB、TWIST1等，并激活間充質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，例如α-SMA、Ncadherin、纖連蛋白和波形蛋白基因，促進(jìn)上皮細(xì)胞重編程，朝著更具遷移性和間充質(zhì)性的表型發(fā)展［4，24］。由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1 在肺纖 維化中起 主 要 作 用，敲 除TGF-β1 可 以 減 輕 肺 纖 維 化［25］。此外，TGF 家族成員BMP-7 可直接抑制TGF-β 誘導(dǎo)的Smad 依賴性細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體在細(xì)胞核內(nèi)的聚集和移動來逆轉(zhuǎn)EMT 過程［26-27］。吡菲尼酮作為治療肺纖維化的臨床用藥，主要通過抑制TGF-βsmad 通路發(fā)揮作用［28］。

TGF-β-nonSmad 通路 除了通過Smads 發(fā)出信號外，TGF-β 也可通過募集胞內(nèi)信號介質(zhì)如絲裂原活化蛋白激酶P38/MAPK/Erk、PI3K/AKT/mTOR 和Rho 家族的小GTPases 介導(dǎo)信號級聯(lián)傳遞，參與細(xì)胞增殖，分化和骨架重排［29-31］。在EMT早期，E3 泛素連接酶SMAD 泛素化調(diào)節(jié)因子1（SMAD ubiquitylation regulatory factor 1，SMURF1）被招募至PAR6，作為緊密連接的促溶劑，經(jīng)TGF-β RII 磷酸化，分解細(xì)胞骨架蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的遷移性表型獲得［32］。許多證據(jù)表明，PI3K/Akt/mTOR 軸 在TGF-β 誘 導(dǎo) 的EMT 中 起 關(guān) 鍵 作用［33］。研究顯示mTORC1 促進(jìn)細(xì)胞運動性和侵襲性并調(diào)節(jié)細(xì)胞體積大小。而mTORC2 可調(diào)節(jié)EMT相關(guān)的細(xì)胞骨架變化和基因表達(dá)［34］。使用AKT 的抑制劑會增加E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，減弱對Snail、波 形 蛋 白（vimentin，VIM）和α-SMA 的 表達(dá)［35-36］，替 卡 格 雷 可 以 通 過 介 導(dǎo)PI3K 通 路 抑 制EMT 進(jìn)展，降低博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化［35］。

Wnt/β-catenin 通路 在肺纖維化中起作用的為經(jīng)典Wnt/β-catenin 通路，在共受體低密度脂蛋白相關(guān)蛋白（lipoprotein-related protein，Lrp）5/6 的影響下，Wnt結(jié)合細(xì)胞表面受體Fzd，并與之形成三元復(fù)合物［37］，激 活 脫 鏈 蛋 白（disheled protein，Dvl），抑 制GSK-3β、β-catenin 發(fā)生磷酸化降解，使得β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中積累，隨后進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF 基因家族的轉(zhuǎn)錄子結(jié)合，激活目標(biāo)基因，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）、促炎癥介質(zhì)、生長因子等的表達(dá)［38］。在IPF 患者肺組織活檢樣本中發(fā)現(xiàn)ATII 中Wnt 3A、WISP1 表達(dá)上調(diào)，且在模型小鼠體內(nèi)使用WISP1 特異性的中和抗體可減少細(xì)胞外膠原沉積，改善肺功能，下調(diào)與EMT 相關(guān)基因表達(dá)［39］。此外，使用特異性抑制β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子ICG-001 可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化和EMT［40］。

Hippo 通路 Hippo 信號通路最早由果蠅遺傳篩選實驗發(fā)現(xiàn)［41］，當(dāng)Hippo 信號通路激活時，下游的MOB1 和LATS1/2 在MST1/2 和SAV1 的 共 同 作用下發(fā)生磷酸化，從而激活MOB1 和LATS1/2，磷酸化下游YES 相關(guān)蛋白（yes-associated protein，YAP）和PDZ 結(jié)合基序（tafnzzin，TAZ），磷酸化的YAP/TAZ 與細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3 蛋白結(jié)合，隨后被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白（β-transducing repeatcontaining proteins，β-TrCP）泛素化降解，從而實現(xiàn)對細(xì)胞大小和體積的調(diào)控［42-43］。當(dāng)Hippo 信號通路受到抑制時，YAP/TAZ 不能被泛素化降解，發(fā)生入核并與核內(nèi)其他轉(zhuǎn)錄因子TEAD 結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)［41］。Hippo 通路的核心轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子YAP/TAZ 是參與成纖維細(xì)胞活化和胞外基質(zhì)形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其活性反映了細(xì)胞黏附和對細(xì)胞外基質(zhì)機(jī)械信號刺激的反應(yīng)能力，敲除YAP/TAZ可以減少成纖維細(xì)胞的收縮、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成［44］。最近一項研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）內(nèi)Snail/Slug-可與YAP/TAZ 形成復(fù)合體，參與MSCs 的自我更新和分化［45］，且在腎纖維化、心臟纖維化中觀察到活化的YAP 直接與TEAD 結(jié)合形成YAP-TEAD 異二聚體，介導(dǎo)EMT 的發(fā)生發(fā)展［46-47］。IPF 患者上皮細(xì)胞免疫熒光也顯示核YAP 的上調(diào)以及MST1/2 表達(dá) 的 缺 失［48］，YAP/TAZ 通 路 作 為 觸 發(fā) 肺 纖 維 化EMT 可能的作用靶點當(dāng)進(jìn)一步深入研究。

靶向EMT 的中藥IPF 是一種難以診斷的致命性間質(zhì)性肺病，中藥治療肺纖維化逐漸被大家所認(rèn)識。骨化三醇可抑制BLM 誘導(dǎo)的肺p38 MAPK和蛋白激酶B（Akt）的磷酸化，從而減弱EMT［49］。白藜蘆醇可通過抑制氧化應(yīng)激和TGF-β1/Smad 信號通路改善LPS 誘導(dǎo)的EMT 和肺纖維化［50］。玉屏風(fēng)散中提取的天然化合物玉屏風(fēng)總糖苷YPF-G 可以通過減少HMGB1 激活和逆轉(zhuǎn)EMT 改善博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化［51］。芍藥苷依賴Smad 途徑，上調(diào)Smad7，降低轉(zhuǎn)錄因子Snail 的表達(dá)，抑制肺泡上皮細(xì)胞中TGF-β 引起的早期EMT［52］。黃芪甲苷通過抑制NLRP3 的表達(dá)降低肺纖維化上皮細(xì)胞間充質(zhì) 轉(zhuǎn) 分 化［53］。穿 心 蓮 內(nèi) 酯［54］、高 良 姜 素［55］、槲 皮素［56］、姜黃素［54，57］、燈盞乙素［58］等多項研究均顯示中藥活性單體可通過調(diào)控EMT，改善體內(nèi)肺纖維化。

結(jié)語共表達(dá)上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物細(xì)胞的存在表明了上皮細(xì)胞不一定是向產(chǎn)生ECM 的肌成纖維細(xì)胞的完全轉(zhuǎn)化，可能存在細(xì)胞的不完全轉(zhuǎn)化，存在雜合E/M 表型［59］。上皮細(xì)胞的可塑性應(yīng)答，可視為細(xì)胞和細(xì)胞之間以及信號通路串?dāng)_的結(jié)果。除 上 文 提 及 的 通 路，Notch［60］，NF-κB［59］、Sonic Hedgehog（SHH）信 號 通 路［61］、缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子1α（Hypoxia-inducible factors 1α，HIF-1α）［62］、過氧化物酶 體 增 殖 物 激 活 受 體 - γ （peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）［63］，調(diào) 控miRNAs 的上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1/2（Epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1/ESRP2）相 關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等［64-65］，都可不同程度上參與肺纖維化EMT 調(diào)節(jié)過程?？偟膩碚f，促進(jìn)EMT 發(fā)生發(fā)展的最主要的通路仍是TGF-β-Smads 通路，但其余核心通路分子蛋白與TGF-β-Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)間的相互串?dāng)_，營造了促纖維化的微環(huán)境，觸發(fā)或增強(qiáng)了EMT，可成為下一步深入探索的方向。隨著基礎(chǔ)生物學(xué)的進(jìn)展和新技術(shù)（如活體內(nèi)成像技術(shù)，透明化技術(shù)，空間轉(zhuǎn)錄學(xué)等）的出現(xiàn)，以通路分子為靶點的治療將取得豐碩的治療成果。

作者貢獻(xiàn)聲明鄧玲玲 文獻(xiàn)檢索，綜述撰寫，繪圖。歐陽博書 文獻(xiàn)調(diào)研和修訂。魏穎 綜述構(gòu)思和修訂。董競成 綜述審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。