高效分子排阻法測定注射用頭孢唑肟鈉聚合物的方法學研究

孔令洋 韓 勇 孫巧巧 王 冉 李正國▲

1.山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測研究院，山東濟寧 272027；2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700

頭孢唑肟鈉屬于第三代頭孢菌素，用來治療各種敏感菌導致的疾病，如尿路感染、呼吸道感染、腹腔感染等，療效較好，具廣譜抗菌作用[1-2]。作為頭孢菌素的一種，其聚合物的形成可能會引起各種不良反應(yīng)，如過敏、休克等，而聚合物雜質(zhì)在藥品的生產(chǎn)、貯存、運輸、使用任一過程中均可能產(chǎn)生[3-6]。本品的執(zhí)行標準中聚合物的測定采用葡聚糖凝膠G10色譜法[7]，該方法具有分析時間長，靈敏度低，不能使用有機溶劑，主峰與聚合物峰不能有效分離等缺點，難以準確反映藥品的質(zhì)量情況。近幾年，高效分子排阻色譜法廣泛應(yīng)用于分析抗生素中的聚合物[8-14]。此方法準確度、靈敏度高，簡便易行。本研究使用TSK gel G2000SWXL親水硅膠色譜柱，建立的高效分子排阻法測定注射用頭孢唑肟鈉的聚合物的方法，分析時間短，可大幅提高檢測效率，操作方便，檢測結(jié)果更為準確。

1 儀器和試藥

安捷倫1200系列高效液相色譜儀（配備紫外檢測器），島津LC20A液相色譜儀（雙波長紫外檢測器）；賽默飛TSQ Quantum Access MAX液質(zhì)聯(lián)用儀 東曹TSK gel G200SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，1.80 μm），葡聚糖凝膠G10（40～120 μm）色譜柱（內(nèi)徑1.0～1.4 cm，柱長30～40 cm）頭孢唑肟對照品（批號130504-201503，中國食品藥品檢定研究院，純度97.2%）；乙酸銨（分析純），磷酸氫二鈉（分析純），磷酸二氫鈉（分析純），甲醇為色譜純，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

用0.075 mol/L pH 7.0的磷鹽緩沖液[0.075 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.075 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61∶39）]作為流動相A；水為流動相B，流速為 1.5 ml/min，檢測波長為254 nm，擬建立高效分子排阻色譜法色譜條件：0.075 mol/L磷酸鹽緩沖液[0.075 mol/L磷酸二氫鈉溶液-0.075 mol/L磷酸氫二鈉溶液（39∶61）]-乙腈（90∶10），檢測波長為254 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取頭孢唑肟對照品約10 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定樣品（相當于頭孢唑肟0.5 g），置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4 流動相的選擇

分別以0.075 mol/L磷酸鹽緩沖液[0.075 mol/L磷酸二氫鈉溶液-0.075 mol/L磷酸氫二鈉溶液（39∶61）]-乙 腈（95∶5）、0.075 mol/L磷 酸 鹽緩沖液[0.075 mol/L 磷酸二氫鈉溶液-0.075 mol/L 磷酸氫二鈉溶液（39∶61）]-乙腈（90∶10）和0.075 mol/L 磷酸鹽緩沖液[0.075 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.075 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（61∶39）]-甲醇（95∶5）為流動相進行分離效果比較。結(jié)果流動相為0.075 mol/L磷酸鹽緩沖液[0.075 mol/L磷酸二氫鈉溶液-0.075 mol/L磷酸氫二鈉溶液（39∶61）]-乙腈（90∶10）時，在主峰前可分離出2個雜質(zhì)峰，且分離效果最好。

2.5 專屬性實驗

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗 取供試品溶液10 ml，加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 ml，放置于室溫，10 min后，再加1 ml的0.1 mol/L 鹽酸溶液中和，充分搖勻，取100 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；頭孢唑肟峰與其前相鄰降解雜質(zhì)峰間的分離度要符合實驗要求。

2.5.2 加速破壞實驗 酸破壞：取供試品溶液10 ml，加0.1 mol/L鹽酸1 ml，室溫放置1 h，取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

堿破壞：取供試品溶液10 ml，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，室溫放置1 h，取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

熱破壞：取供試品溶液10 ml，在60℃水浴中加熱1 h，放冷，取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

254 nm紫外破壞：取供試品溶液10 ml，在254 nm的紫外光放置1 h，取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

專屬性試驗結(jié)果顯示，供試品在經(jīng)過4種條件的激烈破壞處理后，其中聚合物含量均有增加，增加含量由低到高依次為經(jīng)紫外破壞、酸破壞、高溫破壞、堿破壞，經(jīng)四種破壞處理后的聚合物峰均能完全分離，表明在該色譜條件下，頭孢唑肟的降解產(chǎn)物均能與主峰有效分離，方法專屬性良好。

2.6 線性考察

取頭孢唑肟對照品12.95 mg，置于500 ml容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取適量對照品溶液1、2，5、10、20、25、50 μl進入液相色譜儀，以對照品的進樣量（x），峰面積（y），進行線性回歸，得到線性方程y=9104302.0196x-2640.1968（n=9），對照品溶液在質(zhì)量范圍0.02518～2.5180 μg時，線性關(guān)系良好。

取適量注射用頭孢唑肟鈉內(nèi)容物，精密稱定，按“2.2”方法制成含頭孢唑肟供試品溶液，濃度分別 為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 mg/ml。色譜條件同“2.1”項，進行液相分析，橫坐標為供試品溶液的濃度c、縱坐標為聚合物的峰面積A，繪制曲線，線性擬合，得到標準曲線方程為A=387137c+4741.3，結(jié)果表明：供試品溶液在濃度0.5～50 mg/ml時線性關(guān)系良好。

2.7 頭孢唑肟鈉的穩(wěn)定性考察

取注射用頭孢唑肟內(nèi)容物2.0 g，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋著刻度，搖勻。取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

取注射用頭孢唑肟鈉2.00 g，置500 ml容量瓶中，加0.90%氯化鈉注射液溶解并稀釋至刻度，搖勻。取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。并考察將供試品溶液放置在避光和漫反射條件下高分子雜質(zhì)的變化情況。見表1。

表1 頭孢唑肟鈉在不同介質(zhì)中聚合物的穩(wěn)定性考察

由藥品說明書可知，本品臨床上主要采用0.9%氯化鈉注射液和注射用水等介質(zhì)溶解樣品，并要求在0.5～2 h內(nèi)使用完。故本實驗以按臨床高劑量在上述2種介質(zhì)中的考察穩(wěn)定性，試驗表明，注射用頭孢唑肟鈉溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，為指導臨床合理用藥提供依據(jù)，供試品溶液應(yīng)臨用現(xiàn)配。

2.8 檢測限和定量限

取“2.7”項下對照品溶液，逐步稀釋，色譜條件按“2.1”項下，進樣分析，結(jié)果顯示，檢測限為0.25 μg/ml[信噪比（S/N）為3.3]，定量限為0.75 μg/ml（S/N=11.2），靈敏度良好。

2.9 考察供試品溶液

在不同親水硅膠色譜柱的保留情況，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)個數(shù)與保留時間有差異，經(jīng)過分析，應(yīng)是色譜柱內(nèi)的填料對不同分子量的保留有差異。見圖2～3。

圖2 供試品溶液在sepax親水硅膠色譜柱的色譜圖

圖3 供試品溶液在TSKgelG2000SWXL親水硅膠色譜柱的色譜圖

3 討論

供試品溶液中聚合物峰與其他雜質(zhì)峰在不同親水硅膠色譜柱的保留情況，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)個數(shù)與保留時間略有差異，分離機制除與分子量有關(guān)外，與離子濃度等因素相關(guān)。葡聚糖G-10凝膠色譜法不適宜連續(xù)自動化分析，采用自身對照法定量時部分品種出現(xiàn)締合物峰不穩(wěn)定，甚至不締合等問題，雖然每版《中華人民共和國藥典》都針對暴露出的問題進行改進，但由于方法固有的缺陷，無法滿足現(xiàn)代藥品質(zhì)量控制的需要已經(jīng)逐漸成為專家共識[15]。這也體現(xiàn)在自2010年版之后，《中華人民共和國藥典》未再增加利用Sephadex G-10凝膠色譜法的控制標準。HPSEC方法與葡聚糖凝膠G-10色譜法相比，雖然基本原理相同。但是HPSEC法的吸附和分子篩效應(yīng)更強，且分析時間縮短，檢驗效率得到大幅度提升。試驗結(jié)果表明，HPSEC方法分離頭孢唑肟鈉和聚合物雜質(zhì)較為理想，也能夠滿足質(zhì)量分析的準確度要求，可用于檢測頭孢唑肟鈉中的聚合物等雜質(zhì)。采用Sephadex G-10凝膠色譜法和 TSK G2000 SW高效凝膠色譜法分別測定頭孢唑肟鈉的聚合物含量，發(fā)現(xiàn)二者具有較明顯的相關(guān)性，但TSK結(jié)果比葡聚糖凝膠G10結(jié)果高1.6倍。另外，如何確定β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物的質(zhì)控限度問題仍沒有明確的答案[16]。