偶氮苯類DNA納米機(jī)器

劉蘇毓，丁 飛，李 茜，3，樊春海，馮 景

（1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200093；2.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,上海 200240；3.世界頂尖科學(xué)家國際聯(lián)合實(shí)驗室,上海 201203；4.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院,上海 201499）

偶氮苯（Azobenzene）分子于1834年首次被發(fā)現(xiàn)［1］，其光致異構(gòu)性的研究可追溯到1937年［2］. 偶氮苯分子的光致異構(gòu)性具體表現(xiàn)為：在紫外光（340～380 nm）照射下，偶氮苯呈現(xiàn)順式非平面極性構(gòu)象（cis），空間位阻效應(yīng)阻礙其與其它平面構(gòu)象分子的結(jié)合［3］；而在可見光（420～490 nm）刺激時，偶氮苯則呈現(xiàn)反式平面非極性構(gòu)象（trans），此時其能夠與其它平面構(gòu)象分子（如核酸堿基）緊密結(jié)合［4］［圖1（A）］. 基于這種性質(zhì)，偶氮苯類分子目前已成為一類被廣泛應(yīng)用的光響應(yīng)性分子［5］. 此外，偶氮苯基團(tuán)可被體內(nèi)還原物質(zhì)（如偶氮還原酶和谷胱甘肽）還原裂解［圖1（B）］. 通常這類還原物質(zhì)的局部濃度與組織的乏氧程度呈正相關(guān)［6］，因此偶氮苯也被視為乏氧響應(yīng)因子，被用于構(gòu)建乏氧激活的探針或藥物遞送載體等［7～12］.

Fig.1 Photo?isomerized and hypoxia?responsive properties of azobenzene（A）Azobenzene reversibly isomerizes between cis- and trans-form under visible and UV light irradiation；（B）hypoxic reduction mechanism of azobenzene.

隨著脫氧核糖核酸（DNA）納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，DNA已不僅是遺傳信息的載體，也成為納米醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的生物材料之一［13，14］. 目前，通過核酸的可編程性能夠構(gòu)建正方形、長方形、星形和笑臉等不同空間形狀的結(jié)構(gòu)［15］. 除了上述的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，基于核酸納米技術(shù)也可構(gòu)建DNA鑷子［16，17］、DNA步行器［18］以及DNA控制釋放系統(tǒng)［19］等動態(tài)智能化的核酸納米結(jié)構(gòu). 這些動態(tài)響應(yīng)性的核酸納米結(jié)構(gòu)在單分子傳感、藥物輸送和分子組裝等領(lǐng)域顯示出巨大的潛力［20～22］.

將偶氮苯整合至DNA骨架中，能夠賦予DNA納米結(jié)構(gòu)光致異構(gòu)性及乏氧響應(yīng)性，進(jìn)而構(gòu)建光響應(yīng)的DNA 納米機(jī)器（Scheme 1）［23］. 本文梳理了近年來基于偶氮苯的DNA納米機(jī)器的研究進(jìn)展，并進(jìn)行分類匯總和利弊分析，希望為DNA 納米機(jī)器在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料等領(lǐng)域的研究提供新的思路.

Scheme 1 Light? and hypoxia?responsive azoben?zene integrated DNA nanomachine

1 偶氮苯類DNA納米機(jī)器的構(gòu)建

1.1 DNA分子的偶氮苯修飾

偶氮苯與DNA的相互作用主要分為非共價與共價2種方式（圖2）. 非共價作用力主要包括靜電吸附［24］和氫鍵［25］等. 利用非共價作用力，無需對DNA分子進(jìn)行復(fù)雜的修飾即可實(shí)現(xiàn)對核酸結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控［26］［圖2（A）］，此類非共價作用的核酸-偶氮苯雜合物包括季銨鹽類偶氮苯［27，28］、偶氮苯-陽離子肽類分子（Azo-PM）［29］和帶胍鹽的偶氮苯衍生物（AzoDiGua）［30］等. 基于這類超分子作用，很難實(shí)現(xiàn)核酸結(jié)構(gòu)的局部調(diào)控，而且游離的偶氮苯衍生物具有較高的生物毒副作用［31］.

按照偶聯(lián)位置不同，偶氮苯基團(tuán)與核酸的共價結(jié)合方式主要分為3種：（1）偶氮苯單元作為核苷替代物整合至核酸中［圖2（B）］；（2）偶氮苯基團(tuán)修飾在核苷上［圖2（C）和（D）］；（3）偶氮苯基團(tuán)修飾在磷酸骨架上［圖2（E）和（F）］.

Fig.2 Interactions between azobenzene and nucleotides（A）Schematic illustration of noncovalent interaction；（B）schematic illustration of covalent interaction：azobenzene as nucleoside surrogates；（C）azobenzene attached to a nucleoside on the ribose unit；（D）azobenzene attached to a nucleoside on the nucleobase；（E）azobenzene used as a backbone linker between two nucleosides；（F）azobenzene attached on the phosphate backbone；（G）an example of azobenzene-based hypoxia-activated DNA nanodevice［32］；（H）light-responsive azobenzene-integrated asODNs for regulating RNA digestion［33］.（G）Copyright 2019，American Chemical Society；（H）Copyright 2015，American Chemical Society.

將偶氮苯單元作為核苷替代物（偶氮苯亞磷酰胺單體），利用DNA固相合成儀整合至核酸骨架中是構(gòu)建偶氮苯類DNA光控納米機(jī)器最常見的方法［34］［圖2（B）］. 該方法可以實(shí)現(xiàn)偶氮苯基團(tuán)在寡聚核苷酸鏈上的定點(diǎn)及多位點(diǎn)修飾，從而擴(kuò)大核酸設(shè)計的范圍. 在這種設(shè)計中，當(dāng)偶氮苯基團(tuán)呈現(xiàn)平面反式構(gòu)象時，能夠插入到堿基對層間空隙中，而且其疏水性可以增強(qiáng)堿基間堆積力，從而提高雙鏈核酸的穩(wěn)定性；當(dāng)偶氮苯單元異構(gòu)為非平面順式結(jié)構(gòu)時，空間位阻增大，堿基間氫鍵作用減弱，導(dǎo)致雙鏈核酸的穩(wěn)定性和熔融溫度（Tm）降低［35］. 這種修飾方式目前主要用于光調(diào)控雙鏈核酸的雜交和解鏈［36～38］. 在偶氮苯亞磷酰胺單體中，偶氮苯基團(tuán)需要借助橋連單元連接核酸骨架，這種橋連單元的結(jié)構(gòu)會影響偶氮苯的光致異構(gòu)化效率. 目前最為常見的橋連單元是D-蘇氨醇［39］，其能夠匹配順B-型DNA右手螺旋，使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定［40］. 但D-蘇氨醇偶聯(lián)的偶氮苯骨架（D-tAzo）［圖3（A）］在37 ℃下的光異構(gòu)化效率較低，僅為30%［41］. Liang 等［42］將更為柔性的R-甘油偶聯(lián)的偶氮苯（R-gAzo）整合至寡聚核kl 苷酸鏈中［圖3（B）］，使偶氮苯單元的光異構(gòu)化效率顯著增強(qiáng)，室溫下能夠獲得80%的順式異構(gòu)體［43］. 此外，Burghardt等［43，44］將β-糖環(huán)偶聯(lián)的偶氮苯骨架（β-dAzo）插入RNA中［圖3（C）］，同樣能有效地完成光異構(gòu)化，甚至在高溫時異構(gòu)化效率能與D-tAzo修飾的RNA雙鏈相比.

核苷作為偶氮苯單元的修飾位點(diǎn)，可分為五碳糖以及堿基兩部分［圖2（C）和（D）］. 其中，核苷中五碳糖的修飾位點(diǎn)主要集中在糖環(huán)2′位［圖2（C）］. 通過酰胺化［45］和環(huán)加成［46］反應(yīng)可將偶氮苯類分子偶聯(lián)至寡聚核苷酸的糖環(huán)2′位. 這類偶聯(lián)模式會拉大偶氮苯驅(qū)動單元與堿基之間的距離，降低整體結(jié)構(gòu)的光驅(qū)動效率［47］. 將偶氮苯分子修飾到堿基上［圖2（D）］，同樣會遇到光驅(qū)動效率低的難題，這主要是由于偶氮苯分子與互補(bǔ)鏈的堿基相對距離較短，光異構(gòu)反應(yīng)的空間位阻增大所致. 精確考量偶氮苯單元與堿基的構(gòu)效關(guān)系，是獲得高順反異構(gòu)效率的關(guān)鍵. 目前，主流的修飾策略是將偶氮苯通過點(diǎn)擊反應(yīng)修飾至脫氧尿嘧啶的C5位，這種偶聯(lián)方法在紫外光照下可獲得60%的順式異構(gòu)體［48，49］. 將偶氮苯單元作為乏氧激活因子，直接偶聯(lián)至堿基中，同樣能夠構(gòu)建乏氧驅(qū)動的DNA納米機(jī)器. Tan等［32］通過DNA固相合成儀將氨基修飾的腺嘌呤（iAmMC6-dT）整合至核酸適配體中，再與聚乙二醇-偶氮苯-N-羥基琥珀酰亞胺酯（PEG5000-azo-NHS）偶聯(lián)構(gòu)建乏氧響應(yīng)的適配體偶聯(lián)物［圖2（G）］. 當(dāng)其未處于腫瘤部位時，聚乙二醇的位阻效應(yīng)會阻礙核酸適配體與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，使其不具有識別作用. 當(dāng)處于腫瘤乏氧微環(huán)境中，偶氮苯基團(tuán)中氮-氮雙鍵被還原斷裂，適配體恢復(fù)識別功能，從而減少脫靶效應(yīng).

核酸磷酸骨架的偶氮苯單元修飾主要包含2種方法：（1）偶氮苯基團(tuán)通過取代反應(yīng)與硫代磷酸酯修飾的寡聚核苷酸偶聯(lián)［50］［圖2（E）］. 由于偶氮苯驅(qū)動單元與堿基距離較遠(yuǎn)，影響光驅(qū)動效率，因此這種方法不適宜構(gòu)建光敏DNA納米機(jī)器，但可作為乏氧激活的DNA納米機(jī)器的構(gòu)建方法；（2）偶氮苯基團(tuán)作為連接單元，連接2條寡聚核苷酸的兩端構(gòu)建發(fā)卡核酸［51，52］［圖2（F）］. 這種方法是目前用于構(gòu)建光驅(qū)動的DNA納米機(jī)器的主要工具. Wu等［33］將反義寡核苷酸（asODN）兩端通過4，4′-羥甲基偶氮苯分別偶聯(lián)短鏈核酸（含有5個堿基），實(shí)現(xiàn)了光控RNA的降解［圖2（H）］. 當(dāng)偶氮苯單元處于反式結(jié)構(gòu)時，其兩端相鄰堿基互補(bǔ)配對不受影響，此時核酸形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；當(dāng)偶氮苯單元處于非平面的順式結(jié)構(gòu)時，偶氮苯相鄰堿基空間位阻增大，導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)失穩(wěn)，寡核苷酸與RNA 結(jié)合，使RNA 在RNase H的作用下降解.

Fig.3 Bridging groups between azobenzene and nucleic acid

1.2 偶氮苯類DNA納米機(jī)器的構(gòu)建

傳統(tǒng)偶氮苯類DNA納米機(jī)器需要紫外光觸發(fā)，其光響應(yīng)范圍在340～360 nm［53］，此波長區(qū)間的光通常會破壞胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)功能，與生物系統(tǒng)不兼容［54］. 相比之下，可見光響應(yīng)的偶氮苯類DNA納米機(jī)器則具有更廣泛的應(yīng)用前景［圖4（A）］.

通常偶氮苯及其烷基衍生物的反式異構(gòu)體在320 nm 左右（π-π*躍遷）具有最大吸收峰（λmax），在310～370 nm的光照射下可得到順式異構(gòu)體［53］. 當(dāng)苯環(huán)對位引入供電子基團(tuán)時，可使λmax向可見光區(qū)域紅移. 然而，π-π*和n-π*躍遷的重疊（約450 nm）會降低順式結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，從而難以獲得穩(wěn)定的順式結(jié)構(gòu)［55］. 為避免這些不利因素，可見光響應(yīng)的偶氮苯衍生物理想的λmax應(yīng)在400 nm左右［56］. 基于此，Asanuma等［18］［圖4（B）］合成了一種可見光響應(yīng)的偶氮苯衍生物——2，6-二甲基-4-（甲硫基）偶氮苯-4′-羧酸（S-DMazo）. 在供電子基團(tuán)的影響下，偶氮苯衍生物（反式異構(gòu)體）的最大吸收峰紅移至400 nm，同時偶氮苯鄰位修飾的2個甲基增強(qiáng)了衍生物光致異構(gòu)的效率及順式異構(gòu)體的熱穩(wěn)定性. 在400和450 nm的光照射下，S-DMazo分別進(jìn)行反式到順式和順式到反式的異構(gòu)化. 將S-DMazo通過D-蘇氨醇偶聯(lián)至DNA 中，當(dāng)S-DMazo 呈現(xiàn)反式構(gòu)象時，同樣能夠增強(qiáng)雙鏈DNA 的Tm；而當(dāng)S-DMazo 呈現(xiàn)順式構(gòu)象時，雙鏈DNA解開.

Asanuma等［57］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L-蘇氨醇作為橋連單元時，DNA雙鏈的穩(wěn)定能力小于D-蘇氨醇橋連的穩(wěn)定能力，且偶氮苯的對位被烷基修飾時，這種現(xiàn)象進(jìn)一步增強(qiáng)［圖4（C）］. 利用這一性質(zhì)，Asanuma 等［58］通過L-蘇氨醇橋連對位修飾烷基的偶氮苯單元構(gòu)建了一種可見光響應(yīng)的新型偶氮苯類DNA 納米機(jī)器. 與常規(guī)偶氮苯類DNA納米機(jī)器不同，此修飾方式在偶氮苯單元呈現(xiàn)順式構(gòu)象時（400 nm），能夠促進(jìn)DNA雙鏈形成；當(dāng)其呈現(xiàn)反式構(gòu)象時（520 nm），DNA雙鏈解離，而且這種新型納米機(jī)器提高了常溫光致異構(gòu)的效率.

Fig.4 Schematic illustration of azobenzene?modified DNA（A）The azobenzene-based DNA nanomachines responding to visible light；（B）S-DMAzo［18］；（C）L-tAzo［58］；（D）oF4Azo［59］；（E）CL-siRNAzo［60］.（B）Copyright 2012，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim；（C）Copyright 2019，Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim；（D）Copyright 2019，Beilstein-Institut；（E）Copyright 2020，Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim.

Olalla 等［59］通過固相合成法將可見光響應(yīng)的四鄰氟偶氮苯單元（oF4Azo）引入肽核酸（PNA）體系［圖4（D）］. 與寡聚核苷酸體系相比，這種肽核酸同樣能夠?qū)崿F(xiàn)光控PNA/DNA或者PNA/RNA的解鏈與雜交（405 nm/520 nm）. 更重要的是，這種PNA 與互補(bǔ)DNA 或RNA 具有更高的結(jié)合親和力，改善了生理條件下辨別堿基錯配的能力. Hammill等［60］將四鄰氯偶氮苯亞磷酰胺單體通過DNA固相合成儀整合至siRNA的正義鏈（CL-siRNAzos）中，在410 nm/660 nm可見光誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了正義鏈與反義鏈的解鏈與雜交，從而進(jìn)一步對RNA 干擾行為進(jìn)行調(diào)控［圖4（E）］. 這些體系規(guī)避了紫外光，拓展了偶氮苯-核酸納米機(jī)器在生物體內(nèi)的應(yīng)用.

2 偶氮苯類光控DNA納米機(jī)器的應(yīng)用

目前，將偶氮苯驅(qū)動單元整合至寡聚核苷酸中主要用于構(gòu)建光控納米機(jī)器，較少用于構(gòu)建乏氧驅(qū)動的納米機(jī)器［61］. 基于此，本節(jié)集中討論偶氮苯類光控DNA納米機(jī)器，提供了若干例子用于展示其在各個領(lǐng)域的最新進(jìn)展，并總結(jié)了其優(yōu)缺點(diǎn)，為擴(kuò)展其應(yīng)用提供參考.

2.1 調(diào)控酶活性

酶活性與新陳代謝、營養(yǎng)和能量轉(zhuǎn)換等生命過程密切相關(guān). 可逆調(diào)節(jié)酶活性對于細(xì)胞和有機(jī)體功能的調(diào)控具有重要的生物學(xué)意義［62］.

凝血酶對于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，并且與許多類型癌癥的發(fā)生有關(guān)［63］. 通過偶氮苯類DNA納米機(jī)器調(diào)節(jié)凝血酶適配體與凝血酶的結(jié)合或解離，能夠?qū)崿F(xiàn)對凝血酶活性的調(diào)控［64］. Tan等［65］將偶氮苯修飾在與凝血酶適配體互補(bǔ)的DNA 序列中（cDNA），再通過聚乙二醇將其連接到適配體上［圖5（A）］. 當(dāng)偶氮苯呈現(xiàn)反式構(gòu)象時，凝血酶適配體與cDNA雜交，不影響凝血酶功能；當(dāng)其呈現(xiàn)順式構(gòu)象時，誘導(dǎo)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（雙鏈）的解離，適配體結(jié)合凝血酶從而抑制其功能發(fā)揮，實(shí)現(xiàn)對凝血酶的調(diào)控. 偶氮苯類DNA 納米機(jī)器調(diào)控G-四鏈體的形成和解離為調(diào)控凝血酶活性提供了新的方法［66］.Zhou等［67］發(fā)現(xiàn)偶氮苯衍生物可誘導(dǎo)端粒DNA的折疊（G-四鏈體）-拉伸（鏈狀）. 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用偶氮苯衍生物（Razo）-端粒DNA體系［圖5（B）］實(shí)現(xiàn)了對凝血酶的調(diào)控［68］. 端粒DNA兩端連接2個不同的凝血酶適配體，當(dāng)Razo呈現(xiàn)順式構(gòu)象時，誘導(dǎo)端粒DNA折疊形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，2種適配體脫離凝血酶且不影響其功能；當(dāng)Razo呈現(xiàn)反式構(gòu)象時，誘導(dǎo)端粒DNA拉伸成鏈狀，適配體與凝血酶結(jié)合且抑制其功能發(fā)揮，實(shí)現(xiàn)了對凝血酶的調(diào)控. 該系統(tǒng)已經(jīng)成功地用于調(diào)節(jié)人體血漿的凝血過程，有望推動生物醫(yī)學(xué)和制藥應(yīng)用領(lǐng)域的研究.

Fig.5 Azobenzene?based DNA nanomachines for regulation of enzymatic activity（A）The azobenzene-modified cDNA regulate thrombin activity［65］；（B）razo and telomere DNA regulate thrombin activity［68］；（C）light-responsive azobenzene-integrated DNA duplex for controlling GOx/HRP protein enzyme cascade activity［69］；（D）regulation of enzyme Cascade activity［70］.（A）Copyright 2009，National Academy of Sciences；（B）Copyright 2016，American Chemical Society；（C）Copyright 2011，American Chemical Society；（D）Copyright 2018，American Chemical Society.

酶反應(yīng)可通過級聯(lián)的方式協(xié)同作用，如在葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根過氧化物酶（HRP）級聯(lián)體系中，GOx催化形成的產(chǎn)物可作為HRP 反應(yīng)的底物. 這種體系可減少中間產(chǎn)物的積累，提升酶反應(yīng)速率，對于控制細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也起著重要作用. Tan 等［69］將GOx連接至偶氮苯-DNA 上作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“臂”，同時HRP連接到cDNA上［圖5（C）］. 通過雜交/解離調(diào)控GOx和HRP之間的距離，提升酶反應(yīng)的效率，實(shí)現(xiàn)了對酶促反應(yīng)的精確控制.

在酶級聯(lián)活性調(diào)控過程中，對酶及偶氮核酸納米機(jī)器進(jìn)行合理的空間排列是獲得高效的級聯(lián)催化的關(guān)鍵. Yan等［70］利用DNA折紙作為發(fā)生級聯(lián)的酶平臺［圖5（D）］，精確編碼組裝酶間距及偶氮苯修飾的擺動臂，從而優(yōu)化酶級聯(lián)活性. 以葡萄糖6-磷酸脫氫酶（G6pDH）和乳酸脫氫酶（LDH）級聯(lián)反應(yīng)為模型，反應(yīng)以6-磷酸葡萄糖被G6pDH 氧化開始，同時煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶（NAD+）被還原為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶（NADH）；然后LDH利用NADH將丙酮酸還原為乳酸，反應(yīng)再生的NAD+繼續(xù)級聯(lián)反應(yīng). 因為NAD+在級聯(lián)反應(yīng)中的循環(huán)作用，所以將其作為G6pDH和LDH之間的擺動臂. 為了實(shí)現(xiàn)控制NAD+擺臂運(yùn)動，將偶氮苯引入擺臂鏈（HJ-armAZO）和可與之雜交的錨定鏈（anchor-AZO）中，然后DNA 折紙精確組裝酶級聯(lián)、擺臂鏈和錨定鏈. 在可見光和紫外光的照射下，調(diào)節(jié)HJ-armAZO 鏈和anchor-AZO 鏈的雜交/解鏈，誘發(fā)擺臂鏈遠(yuǎn)離/靠近酶級聯(lián). 這種方法將代謝中間物從一種酶直接轉(zhuǎn)移至下一種酶，避免游離產(chǎn)物釋放到溶液中，加快了代謝物的加工并提高底物的選擇性［71］，實(shí)現(xiàn)了干凈、快速、可逆地光調(diào)控酶級聯(lián)活性.

2.2 調(diào)控物質(zhì)傳輸

生物分子的選擇性跨膜運(yùn)輸具有重要意義. 受到生物通道介導(dǎo)三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)運(yùn)的啟發(fā)［72］，Jiang等［73］通過光響應(yīng)的偶氮苯類DNA納米機(jī)器構(gòu)建了人工納米通道，實(shí)現(xiàn)ATP分子的光調(diào)節(jié)跨膜捕獲-釋放-運(yùn)輸. 首先將偶氮苯單元偶聯(lián)至ATP適配體中，然后將其修飾在錐形聚酰亞胺（PI）納米通道內(nèi)［圖6（A）］. 當(dāng)可見光照射時，適配體形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，同時捕獲ATP分子；當(dāng)紫外光照射時，適配體則呈現(xiàn)單鏈狀態(tài)，釋放ATP 分子. 該體系能夠在折疊與展開狀態(tài)之間進(jìn)行切換，實(shí)現(xiàn)ATP 的光控輸運(yùn). 通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化，改變核酸適配體序列，可以構(gòu)建不同的偶氮苯-DNA適配體納米通道，適用于各種分子、離子甚至癌細(xì)胞的運(yùn)輸.

Fig.6 Azobenzene?based DNA nanomachines for photo?responsive regulation of material transport（A）Azobenzene-modified DNA nanochannel for ATP transmembrane transport［73］；（B）azobenzene-modified DNA nanochannel for ion transport［76］；（C）schematic illustration of the construction and working mechanism of the ionic gate based on the interaction between GO and azobenzene-DNA-modified PAA membrane［77］；（D）azobenzene-integrated DNA nanopump for photo-regulating Dox release［79］.（A）Copyright 2018，American Chemical Society；（B）Copyright 2016，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim；（C）Copyright 2019，American Chemical Society；（D）Copyright 2019，Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim.

天然蛋白質(zhì)通道通常嵌入脂質(zhì)雙分子層中，因其脆弱且不穩(wěn)定，不適宜用作體外離子通道實(shí)驗材料. 相比之下，構(gòu)筑人工光敏離子通道更有助于離子傳輸?shù)难芯浚?4］. 受視紫紅質(zhì)光控離子通道原理的啟發(fā)［75］，Jiang等［76］基于偶氮苯類DNA納米機(jī)器的光致異構(gòu)性構(gòu)建了光控納米通道［圖6（B）］，實(shí)現(xiàn)了對離子傳輸過程的調(diào)節(jié). 整合偶氮苯的DNA分子，通過金-硫鍵被固定在錐形聚對苯二甲酸乙二醇酯納米通道內(nèi). 在可見光照射下，DNA呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，擴(kuò)大了納米通道的有效直徑（開放狀態(tài)）；在紫外光照射下，DNA呈現(xiàn)單鏈狀態(tài)，減小了有效直徑（閉合狀態(tài)），阻斷了納米通道，實(shí)現(xiàn)光控調(diào)節(jié)離子傳輸. 這種納米通道響應(yīng)快，具有良好的生物相容性，在光控藥物傳輸、光信息存儲和邏輯網(wǎng)絡(luò)等方面將具有潛在的應(yīng)用前景. 利用相同的原理，Li等［77］構(gòu)建了一種新型氧化石墨烯離子門用于光控離子傳輸. 這種類視紫紅質(zhì)仿生離子門為研究離子通道、離子功能和離子數(shù)量提供了一種新的模型和方法［圖6（C）］.

通過偶氮苯的光異構(gòu)轉(zhuǎn)換可實(shí)現(xiàn)光控藥物傳輸，如抗癌藥物阿霉素（DOX）的光控遞送. Tan等［78］將偶氮苯修飾的DNA雙鏈裝載在介孔二氧化硅的孔口處，同時將DOX裝載于介孔二氧化硅中，制備了光子調(diào)控的藥物釋放系統(tǒng). 在可見光照射下，DNA雙鏈形成，孔口閉合，藥物被封裝在介孔二氧化硅納米孔中；紫外光照射時，DNA雙鏈解離，孔口打開實(shí)現(xiàn)藥物釋放. 此外，Liu等［79］基于偶氮苯的光致異構(gòu)性構(gòu)建了一種DNA納米泵，用于快速高效的藥物傳輸［圖6（D）］. 偶氮苯-DNA通過配體交換被修飾至上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNP）表面，DOX選擇性插入DNA雙螺旋中，形成高效負(fù)載藥物的納米泵. 在近紅外光照射下，UCNPs同時發(fā)射紫外和可見光光子，使偶氮苯單元如同葉輪泵在光照下連續(xù)進(jìn)行順反異構(gòu). 當(dāng)偶氮苯單元呈現(xiàn)反式構(gòu)象時，堆疊在相鄰堿基對之間，DNA雙鏈形成，納米泵閉合，不釋放DOX；當(dāng)其呈現(xiàn)順式構(gòu)象時，使DNA雙鏈解離，納米泵打開，實(shí)現(xiàn)光控DOX釋放. 該體系的DOX釋放率在30 min 內(nèi)可以達(dá)到86.7%. 通過在體系中組裝核定位肽（HIV-1 TAT），能夠進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)藥物的細(xì)胞核靶向遞送，從而增強(qiáng)抑癌效果.

2.3 調(diào)控機(jī)械運(yùn)動

鏈置換反應(yīng)是目前構(gòu)建DNA機(jī)械運(yùn)動的基本原理［80］，但這種策略產(chǎn)生的“廢物”鏈會逐漸積累，進(jìn)而降低驅(qū)動效率［81］. 由光驅(qū)動運(yùn)行的DNA納米機(jī)器可以克服燃料鏈逐步累積的缺點(diǎn)［82］. Asanuma等［18］基于偶氮苯構(gòu)建了一種光燃料DNA“蹺蹺板”［圖7（A）］. 這種DNA“蹺蹺板”由4條寡核苷酸鏈組成：整合5個S-DMazo的寡核苷酸（L bar，20 nt）、未修飾偶氮苯的寡核苷酸（M bar，25 nt）、整合5個偶氮苯單元的寡核苷酸（R bar，20 nt）以及DNA模板鏈（Temp，65 nt）. 在450 nm光照射下，S-DMazo和偶氮苯單元呈現(xiàn)反式構(gòu)象，L bar/Temp和R bar/Temp雙鏈呈現(xiàn)雜交狀態(tài)（state a）. 在390 nm（或400 nm）光照下，S-DMazo呈順式構(gòu)象，而偶氮苯單元保持反式構(gòu)象，L bar/Temp雙鏈解離，R bar/Temp雙鏈保持穩(wěn)定狀態(tài)（state b）. 在340 nm光照下，S-DMazo 異構(gòu)為反式，而反式偶氮苯單元異構(gòu)為順式，因此L bar/Temp雙鏈雜交，R bar/Temp 雙鏈解離（state c）. 在370 nm 光照下，S-DMazo 和偶氮苯單元都呈現(xiàn)順式構(gòu)象，L bar/Temp 和R bar/Temp 雙鏈都離解（state d）. 中間的雙鏈（M bar/Temp）在所有狀態(tài)下都是穩(wěn)定的雙鏈. 通過偶聯(lián)S-DMazo和偶氮苯單元，其可以在不同波長的光照射下以“蹺蹺板”的形式運(yùn)動.

Fig.7 The azobenzene?based DNA nanomachines for photo?responsive regulation of mechanical motion,cellular morphology and molecular communication（A）Scheme illustration offour possible states（a，b，c，and d）of the DNA machines containing S-DMazo and azobenzenemodified DNAs are achieved byirradiation at four wavelengths（340，370，390 and 450 nm，respectively）［18］；（B）scheme illustration of DNA Walker［83］；（C）azobenzene-integrated DNA machine for photo-regulating cellular morphology［85］；（D）schematics of photo-actuated reversible transport of molecules between two DNA coacervates［86］.（A）Copyright 2019，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim；（B）Copyright 2012，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim；（C）Copyright 2019，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim；（D）Copyright 2022，Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim.

基于相同原理，Asanuma等［83］進(jìn)一步利用2，6-二甲基偶氮苯（DM-Azo）和2，6-二甲基-4′-（甲硫基）偶氮苯（S-DM-Azo），首次構(gòu)建出能夠在一維空間雙向移動的正交光控非自主DNA 步行器［圖7（B）］.該步行器系統(tǒng)由3 個部分組成：S-DM-Azo 和DM-Azo 修飾的“兩足”DNA 步行器（LEG A，LEG B）、4 個foothold 鏈（F）組成的步行器行走路徑（F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4）及toehold 寡脫氧核苷酸鏈（TO）. TO-1和TO-2可分別與F1 和F2 上的片段堿基互補(bǔ)配對. 當(dāng)步行器兩足分別位于F1 和F2 時為起始位置，TO-A 和TO-B與兩足雜交. 在385 nm光照下，S-DM-Azo 呈現(xiàn)順式構(gòu)象，使LEG A 與TO-A解鏈，LEG A 向前移動到F3，TO-1 結(jié)合F1. 在365 nm 光照下，DM-Azo 呈現(xiàn)順式構(gòu)象，使LEG B 和TO-B 解鏈，LEG B 向前移動到F4，TO-2結(jié)合F2. 隨后步行器再經(jīng)385 nm光照射時，S-DM-Azo呈現(xiàn)反式構(gòu)象，兩足反向移動一步. 最后，450 nm的光照射使DM-Azo呈現(xiàn)反式構(gòu)象，兩足反向移動回到起始位置. 這種前所未有的步行器系統(tǒng)設(shè)計實(shí)現(xiàn)了高精度的運(yùn)動控制，為推進(jìn)非自主性DNA機(jī)器開辟了新途徑，促進(jìn)了其在納米尺度上的應(yīng)用.

2.4 其它應(yīng)用

準(zhǔn)確模擬細(xì)胞的形態(tài)變化、修復(fù)和分化等動態(tài)過程有助于深入探究細(xì)胞生命活動［84］. Masayuki等［85］構(gòu)建了一個偶氮苯修飾的DNA聚合物用于可逆調(diào)控細(xì)胞形態(tài)變化［圖7（C）］. DNA聚合物由修飾偶氮苯的DNA鏈（S1-Azo）、修飾細(xì)胞粘附肽（RGD）的DNA鏈（S2-RGD）及與這兩條DNA鏈堿基互補(bǔ)配對的模板鏈組成. 在可見光照射下，DNA雙鏈雜交，DNA聚合物形成線性結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形. 在紫外光照射下，DNA雙鏈解旋，模板鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象變化產(chǎn)生了11.6 nm的收縮，改變了細(xì)胞RGD之間的距離，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，呈現(xiàn)圓形；經(jīng)可見光照射后，細(xì)胞形態(tài)逆轉(zhuǎn)回紡錘形，這表明光照射后細(xì)胞的收縮和擴(kuò)張是可逆的. 這種光控可逆的動態(tài)DNA聚合物可以作為一個高效的工具用于研究細(xì)胞形態(tài)、組織修復(fù)、癌癥轉(zhuǎn)移和細(xì)胞分化等許多重要的現(xiàn)象. 利用人造細(xì)胞器模擬細(xì)胞之間物質(zhì)交換有助于深入理解細(xì)胞內(nèi)分子通信. Deng等［86］在油包水液滴中通過液-液相分離制備了無膜DNA凝聚體；然后將DNA凝聚體作為人造細(xì)胞器，偶氮苯修飾的DNA作為通訊分子，通過光調(diào)控實(shí)現(xiàn)生物雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而模擬胞內(nèi)通信［圖7（D）］. 首先，將含有2 種不同黏性末端序列（SE1 和SE2）的單鏈DNA分子通過液-液相分離形成不同的DNA凝聚體，以此模擬2種不同的細(xì)胞器；然后在DNA凝聚體中加入3種單鏈DNA（ssDNA）：修飾FITC的信號分子ssDNA1、修飾偶氮苯的ssDNA2和修飾偶氮苯的發(fā)夾DNA，ssDNA2能夠結(jié)合在SE1 DNA凝聚體上，發(fā)夾DNA能夠結(jié)合在SE2 DNA凝聚體中. ssDNA 1與ssDNA2完全互補(bǔ)配對，但與發(fā)夾DNA部分配對. 在紫外光照射下，ssDNA1與ssDNA2解離，發(fā)夾DNA解離成單鏈DNA，此時ssDNA1由SE1 DNA凝聚體轉(zhuǎn)移到SE2 DNA凝聚體與單鏈發(fā)夾DNA 結(jié)合；當(dāng)切換成可見光照射時，單鏈發(fā)夾DNA 形成發(fā)夾構(gòu)型，ssDNA1從SE2 DNA 凝聚體再轉(zhuǎn)移回到SE1 DNA凝聚體上，因此模擬了在不同細(xì)胞器之間細(xì)胞通信. 此研究展示了一種在多個細(xì)胞器中控制分子輸運(yùn)的新途徑，在微反應(yīng)器、功能材料和藥物遞送領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景.

3 總結(jié)與展望

本文概述了基于偶氮苯的DNA納米機(jī)器的構(gòu)建方式及優(yōu)缺點(diǎn)，呈現(xiàn)了其在生物、醫(yī)學(xué)、材料等方面的廣泛應(yīng)用. 毫無疑問，隨著對偶氮苯性質(zhì)探究的不斷深入，基于偶氮苯的DNA納米機(jī)器的研發(fā)將展現(xiàn)出更多的優(yōu)勢和更大的潛力.

盡管如此，基于偶氮苯的DNA納米機(jī)器的應(yīng)用仍面臨著一些障礙和挑戰(zhàn). 首先，偶氮苯類化合物存在光致異構(gòu)化的量子產(chǎn)率低、順式異構(gòu)體的熱穩(wěn)定性差、半衰期短以及順反異構(gòu)體出現(xiàn)吸收帶重疊影響異構(gòu)效率等問題. 這些問題限制了偶氮苯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用. 此外，乏氧、可見光甚至近紅外光響應(yīng)性的偶氮苯DNA納米機(jī)器的例子仍然鮮有報道. 因此，開發(fā)優(yōu)良特性的偶氮苯類光響應(yīng)單元極為重要. 然后，進(jìn)一步探究偶氮苯類化合物在乏氧環(huán)境（例如氧濃度變化和體內(nèi)還原劑）中的氧化還原性質(zhì)，有望為構(gòu)建新型偶氮苯類DNA納米機(jī)器提供思路.

目前基于偶氮苯的DNA納米機(jī)器在生物、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等方面取得了許多進(jìn)展，對其進(jìn)一步的研究能使其在更多創(chuàng)新領(lǐng)域創(chuàng)造更高的價值. 要實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，需要各領(lǐng)域?qū)I(yè)知識與創(chuàng)新思維的結(jié)合，這無疑將激勵更多生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域的研究人員來面對這些機(jī)遇和挑戰(zhàn).