孫祿娟，何建軍，汪軍成，姚立蓉，司二靜，楊軻，李葆春，馬小樂，尚勛武，孟亞雄*，王化俊*

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

鹽生草（Halogeton glomeratus）屬于中央種子目，藜科，鹽生草屬，為廣泛分布于干旱和半干旱區(qū)的一年生草本荒漠鹽生植物［1-3］。地上部多分枝的莖和肉質(zhì)化的葉使其擁有很強(qiáng)的防風(fēng)固沙、保水保土、抗旱及耐鹽能力［4-5］。因此，鹽生草可用于大量耐鹽、抗旱基因的開發(fā)研究。鹽生草籽所含營(yíng)養(yǎng)豐富且全面，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料、油料及提取抗氧化物材料的來(lái)源［6］。此外，鹽生草具有一定的藥用價(jià)值［7］，如發(fā)汗解表、止咳平喘、祛濕等。

轉(zhuǎn)錄組是特定的細(xì)胞或組織內(nèi)全部的RNA 轉(zhuǎn)錄本，是生物體在特定的環(huán)境條件、生命階段、組織類型及生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包含mRNA、rRNA、tRNA 和非編碼RNA［8］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)從RNA 水平研究基因表達(dá)的情況，從整體水平研究基因轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律［9］，是細(xì)胞表型和功能研究的一個(gè)重要手段。其測(cè)序分析能夠有效地檢測(cè)不同器官或組織在特定時(shí)間點(diǎn)幾乎所有基因的表達(dá)情況，同時(shí)也可以檢測(cè)一些特異表達(dá)基因及簡(jiǎn)單重復(fù)序列［10-11］。因此，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序廣泛應(yīng)用于基因功能注釋、差異表達(dá)分析、單核苷酸多態(tài)性分析及ESTSSR 標(biāo)記開發(fā)等方面［12］。

SSR（simple sequence repeats）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，又名微衛(wèi)星DNA，通常由幾個(gè)核苷酸（一般為1～6 個(gè)）作為重復(fù)單位組成長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，在真核生物基因組中廣泛分布［13］，SSR 重復(fù)類型和重復(fù)次數(shù)的差異導(dǎo)致了其長(zhǎng)度的高度變異［14］。其具有多態(tài)性豐富、呈共顯性、遺傳方式簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、所需DNA 量少、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［15-16］，對(duì)于研究群體數(shù)量過大作物有著明顯的優(yōu)勢(shì)，是研究種質(zhì)資源遺傳多樣性最為方便的分子標(biāo)記，被大量應(yīng)用于作物種間遺傳差異和雜種優(yōu)勢(shì)等的研究［17］。

近年來(lái)，在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、純度鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等方面，分子標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用［18］。在木本、草本、水生等植物中，采用轉(zhuǎn)錄組序列對(duì)SSR 標(biāo)記進(jìn)行開發(fā)的技術(shù)已取得了很大成果［19］。目前，關(guān)于鹽生草的研究主要針對(duì)鹽和重金屬脅迫對(duì)種子萌發(fā)及幼苗的影響以及基因功能驗(yàn)證等方面的內(nèi)容。如在鹽脅迫環(huán)境中，探究不同重金屬濃度對(duì)鹽生草種子萌發(fā)的影響［20］，何建軍等［21］研究了不同濃度PEG和鹽脅迫下鹽生草種子的萌發(fā)特性及對(duì)鹽生草中某些基因的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化［22-23］等。但利用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)鹽生草SSR 標(biāo)記進(jìn)行開發(fā)及鹽生草種質(zhì)資源的研究還未見報(bào)道。本研究基于本實(shí)驗(yàn)室已公布的鹽生草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)［5，24-25］，在轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分析，并對(duì)18 份鹽生草材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，旨在為后續(xù)開發(fā)和利用鹽生草種質(zhì)資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019 年將甘肅省18 個(gè)不同鹽堿地區(qū)的鹽生草材料（表1）播種于10 cm×10 cm 的塑料花盆中，每個(gè)來(lái)源地材料播種5 盆，每天噴灑Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。待其長(zhǎng)至六葉期，隨機(jī)取同一來(lái)源地不同花盆中不同單株葉片，混合，作為一個(gè)樣本。用改良CTAB 法提取基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA 是否合格，并用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度和純度。將檢測(cè)合格的DNA 樣品用雙蒸水稀釋至30 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 鹽生草采樣點(diǎn)信息Table 1 Information about the sampled sites of H.glomeratus

1.2 鹽生草轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)搜索和標(biāo)記開發(fā)

參考本實(shí)驗(yàn)室已公布的鹽生草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)［5，24-25］，利用MISA 軟件在轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索及標(biāo)記開發(fā)，篩選參數(shù)為：?jiǎn)巍塑账嶂貜?fù)次數(shù)依次為12、6、5、5、4 和4 次。利用primer Premier 3.0 將獲得的鹽生草SSR 位點(diǎn)的序列以退火溫度50～60 ℃、引物長(zhǎng)度20～30 bp、PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度100～300 bp 等為條件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，隨機(jī)選擇218 對(duì)SSR 標(biāo)記引物，由擎科澤西生物公司合成。

1.3 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

參考劉乃新等［26］和孟亞雄等［27］的方法進(jìn)行PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，并稍做改進(jìn)。PCR 擴(kuò)增體系為10 μL：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，ddH2O 2 μL，模板DNA 2 μL（30 ng·μL-1），上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL。采用TD-PCR 程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，共40 個(gè)循環(huán)：首先94 ℃變性40 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，退火溫度每降1 ℃進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)，直到降至55 ℃，共10 個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，進(jìn)行30 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存至取出。吸取3～5 μL PCR 產(chǎn)物于8%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電壓為200 V，電泳90～120 min；電泳完成后，關(guān)閉電源取下凝膠進(jìn)行銀染；銀染完成后加入顯色液進(jìn)行顯色，至條帶清晰，用超純水清洗并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以二進(jìn)制和基因型記錄SSR 分析結(jié)果，同一位點(diǎn)上具有相同遷移率的條帶記為1，無(wú)帶記為0；以數(shù)字1、2、3等表示不同基因型，以此構(gòu)建出矩陣。參照Nei 等［28］的方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS），GS=2Nij×（Ni+Nj），其中Ni、Nj中i和j分別代表材料中出現(xiàn)的片段數(shù)目，Nij為材料共有的片段數(shù)目，并按非加權(quán)配對(duì)法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進(jìn)行聚類分析［29］。使用PowerMarker 3.25 軟件［30］計(jì)算等位基因數(shù)（number of alleles，AN）、基因型數(shù)量（number of genotypes，GN）、基因多樣性指數(shù)（gene diversity index，GD）及多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）［31］，PIC=1-∑ji P2ij，式中：Pij表示位點(diǎn)i的第j個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽生草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)類型及重復(fù)次數(shù)

通過對(duì)鹽生草29640 個(gè)SSR 重復(fù)單元及重復(fù)序列類型分析發(fā)現(xiàn)，SSR 種類包含1～6 核苷酸重復(fù)類型（圖1）。其中，三核苷酸重復(fù)單位最多，有10 個(gè)類型，共檢測(cè)到11337 個(gè)，占比為38.25%?；蝾愋妥罹邇?yōu)勢(shì)的為ATC/GAT，有2270 個(gè)，所占比例為20.02%；其次為AAG/CTT 模式，2113 個(gè)，占比為18.64%；AAC/GTT 模式1752個(gè)，占15.45%；AAT/ATT 類 型1508 個(gè)，占 比 為13.30%；ACC/GGT 模式1292 個(gè)，占比為11.40%；AGC/GCT 模 式907 個(gè)，占8.00%；AGG/CCT 模 式661 個(gè)，占 比 為5.83%；ACT/AGT 模 式400 個(gè)，占3.53%；CCG/CGG 模式261 個(gè)，占2.30%；出現(xiàn)頻率最低的為ACG/CGT 模式，有173 個(gè)，僅占1.53%；單核苷酸重復(fù)單位類型次之，為10063 個(gè)，占總重復(fù)單元的33.95%；位居第三的為雙核苷酸重復(fù)單位類型，有4677 個(gè)，占15.78%，其中出現(xiàn)頻率最高的為AG/CT模式，共2265 個(gè)，其次為AT/AT 模式1474 個(gè)，AC/GT 模式935 個(gè)，CG/CG 模式出現(xiàn)頻率最低，只有3個(gè)；六核苷酸重復(fù)單位類型1430 個(gè)，占比為4.82%；五核苷酸重復(fù)單位類型1168 個(gè)，占3.94%；四核苷酸重復(fù)單位類型最少，為965 個(gè)，僅占3.26%。

圖1 SSR 類型和數(shù)量分布統(tǒng)計(jì)Fig.1 Statistics of SSR type and quantity

鹽生草SSR 序列重復(fù)次數(shù)主要分布在4～20 次（表2），占全部SSR（包括復(fù)合型SSR）總數(shù)的92.94%。重復(fù)4～7 次的為16077 個(gè)，占SSR 總數(shù)的54.24%；重復(fù)12～15 次的為6454 個(gè)，占SSR 總數(shù)的21.78%；重復(fù)8～11 次的為2817 個(gè)，占SSR 總數(shù)的9.50%；重復(fù)16～20 次的為2198 個(gè)，占SSR 總數(shù)的7.42%；＞20 次的為2094 個(gè)，占總SSR 的7.06%。鹽生草SSR 中，單核苷酸重復(fù)12～20 次，有8046 個(gè)，占SSR 總數(shù)的27.15%，最短的為12 bp，最長(zhǎng)的大于20 bp。二核苷酸重復(fù)6～16 次，共4579 個(gè)，約占SSR 總數(shù)的15.45%，變化幅度較大，最短的為12 bp，最長(zhǎng)的大于40 bp。三核苷酸重復(fù)5～13 次，共11206 個(gè)，占SSR 總數(shù)的37.81%，最短的為15 bp，最長(zhǎng)的大于60 bp。四核苷酸重復(fù)5～9 次，有934 個(gè)，占SSR 總數(shù)的3.15%，最短的為20 bp，最長(zhǎng)的大于80 bp。五核苷酸重復(fù)4～7 次，有1132 個(gè)，占SSR 總數(shù)的3.82%，其長(zhǎng)度為20～80 bp。六核苷酸重復(fù)4～7 次，共有1402 個(gè)，占SSR 總數(shù)的4.73%，其長(zhǎng)度最小為24 bp，最大的大于120 bp。

表2 鹽生草轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)類型和重復(fù)次數(shù)Table 2 SSR repeat types and repeat times of transcriptome in H.glomeratus

2.2 SSR 引物篩選

以18 份鹽生草的混合DNA 為模板對(duì)218 對(duì)引物進(jìn)行初篩，有110 對(duì)引物可擴(kuò)增出條帶。隨機(jī)選取8 份鹽生草DNA 為模板進(jìn)行復(fù)篩，篩選出39 條具有多態(tài)性的引物。然后用18 份材料進(jìn)行第3 次篩選（圖2）。最終得到33對(duì)具有較高多態(tài)性的引物（表3）。

表3 多態(tài)性較高的33 對(duì)引物Table 3 Statistics of 33 pairs of primers with high polymorphism

圖2 部分引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis with partial primers

2.3 鹽生草轉(zhuǎn)錄組水平SSR 標(biāo)記分析

用多態(tài)性較好的33 對(duì)標(biāo)記對(duì)甘肅不同生態(tài)點(diǎn)的鹽生草DNA 進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)（表4），共檢測(cè)得到199 個(gè)等位基因位點(diǎn)。位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3～13 個(gè)，平均為6.03 個(gè)?；蛐蛿?shù)量為2～13，平均值為5.88。GD 為0.583～0.869，平均值為0.698。PIC 值為0.527～0.856，平均值為0.623。標(biāo)記H4 的基因型數(shù)量、等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量均最大，分別為13、13、0.869 和0.856。標(biāo)記H181 的基因型數(shù)量最小，等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量最小的為標(biāo)記H94，標(biāo)記H140 的基因多樣性指數(shù)最小。

表4 鹽生草多態(tài)性引物遺傳信息含量Table 4 Genetic information content of polymorphic primers in H.glomeratus

2.4 鹽生草種質(zhì)資源遺傳相似性系數(shù)及聚類分析

據(jù)GS 計(jì)算結(jié)果可知，甘肅18 個(gè)不同生態(tài)點(diǎn)鹽生草間的GS 值為0.528～0.859，平均值為0.683（表5）。來(lái)自平川區(qū)和酒泉市的鹽生草材料之間的GS 值最大，為0.859，說(shuō)明它們之間親緣關(guān)系較近；來(lái)自酒泉市和民勤縣-重興鎮(zhèn)的鹽生草材料之間GS 值最小，為0.528，說(shuō)明它們之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表5 18 個(gè)鹽生草種間的遺傳相似系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficient among 18 halophyte species

對(duì)來(lái)自甘肅不同生態(tài)點(diǎn)的18 份鹽生草材料進(jìn)行聚類分析（圖3），這些材料在GS 為0.68 時(shí)被劃分為四大類，第一大類包括1 份材料，為民勤縣-重興鎮(zhèn)的鹽生草。第二大類包括7 份材料，為民樂縣、高臺(tái)縣、永昌縣、蘭州新區(qū)、甘州區(qū)、蘭州市、民勤縣-收成鎮(zhèn)的鹽生草。第三類包括6 份材料，為金昌市、會(huì)寧縣、山丹縣、臨澤縣、靖遠(yuǎn)縣、景泰縣的鹽生草。第四類包括4 份材料，為平川區(qū)、酒泉市、肅南縣、武威市的鹽生草。

圖3 18 份鹽生草聚類分析Fig.3 Cluster analysis of 18 H. glomeratus

3 討論

鹽生草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中SSR 種類比較豐富，包含6 種核苷酸重復(fù)類型。最具優(yōu)勢(shì)的重復(fù)類型為三核苷酸重復(fù)單位，共檢測(cè)到11337 個(gè)，占38.25%。這與李彥等［13］對(duì)虎耳草（Saxifraga stolonifera）、左力輝等［32］對(duì)榆樹（Ulmus pumila）以及上官凌飛等［33］對(duì)杏（Prunus armeniaca）的研究結(jié)果一致，都表現(xiàn)為三核苷酸基序占SSR 總數(shù)的比例最大。但對(duì)甘蔗（Saccharum officinarum）［34］、油楠（Sindora glabra）［35］和大花四照花（Cornus florida）［36］的研究表明，單核苷酸重復(fù)類型占主導(dǎo)地位。相關(guān)研究表明，進(jìn)化水平較高的物種中短核苷酸重復(fù)類型占比較大，而以多核苷酸重復(fù)單元為主的物種進(jìn)化水平相對(duì)較低［37］。鹽生草SSR 重復(fù)類型以三核苷酸為主，說(shuō)明鹽生草在長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化過程中突變頻率較高，使其重復(fù)單元變短。在二核苷酸重復(fù)類型中，AG/CT 所占比例較大，這與燕麥（Avena sativa）［38］、甘 薯（Ipomoea batatas）與 牽牛（Ipomoea nil）［39］、苦蕎（Fagopyrum tataricum）［40］以 及 三年桐（Vernicia fordii）［41］的研究結(jié)果相符。三核苷酸重復(fù)中ATC/GAT、AAG/CTT、AAC/GTT、AAT/ATT 和ACC/GGT 所占的比例差異較小，無(wú)明顯的優(yōu)勢(shì)三核苷酸重復(fù)類型，這與對(duì)同科植物菠菜（Spinacia oleracea）［37］的研究一致。

目前，相關(guān)研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)次數(shù)與位點(diǎn)的多態(tài)性呈正相關(guān)，重復(fù)次數(shù)越多表明此物種多態(tài)性潛能較高［42］，特別是當(dāng)重復(fù)次數(shù)大于12 時(shí)，多態(tài)性位點(diǎn)含量高［43］。本研究中，鹽生草SSR 重復(fù)次數(shù)主要分布在4～20 次，占全部SSR（包括復(fù)合型SSR）總數(shù)的92.94%，重復(fù)頻率高于12 次的占27.56%，說(shuō)明鹽生草轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)次數(shù)較高，理論上具有較大的開發(fā)潛能。有研究表明，多態(tài)性高低受SSR 長(zhǎng)度的影響，多態(tài)性較高的SSR 長(zhǎng)度≥20 bp，長(zhǎng)度為12～20 bp 的多態(tài)性中等，而長(zhǎng)度＜12 bp 時(shí)多態(tài)性極低［44-45］。鹽生草中，多態(tài)性較高的SSR（≥20 bp）數(shù)量為9460，占比31.92%，多態(tài)性極低的SSR（＜12 bp）數(shù)量為0，說(shuō)明本研究中的鹽生草材料有較高的多態(tài)性。

SSR 標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)重要因素是開發(fā)高多態(tài)性比率的SSR 引物［46］。本研究用隨機(jī)合成的218對(duì)SSR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，110 對(duì)引物實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，有效擴(kuò)增率為50.46%。110 對(duì)有效擴(kuò)增引物中33 對(duì)呈現(xiàn)出較高多態(tài)性，占有效引物的30%。這個(gè)比率低于藍(lán)靛果忍冬（Lonicera caerulea）的62.50%［47］以及紅豆杉（Taxus chinensis）的38.71%［46］。引物退火溫度、位置或質(zhì)量不合適都有可能導(dǎo)致引物擴(kuò)增失?。?8］。

本研究用多態(tài)性較好的33 對(duì)SSR 標(biāo)記，擴(kuò)增出199 個(gè)等位基因。位點(diǎn)的等位基因數(shù)差異較大，為3～13 個(gè)，與楊丹丹等［49］對(duì)楸樹（Catalpa bungei）的研究結(jié)果吻合?；蛐蛿?shù)量為2～13，基因多樣性指數(shù)為0.583～0.869，多態(tài)性信息含量值為0.527～0.856，平均值為0.623。Kimaro 等［50］的研究結(jié)果顯示坦桑尼亞木豆（Cajanus cajan）的PIC 值為0.46。Oh 等［51］對(duì)韓國(guó)紫蘇（Perilla frutescens）的研究表明，其PIC 值為0.592。從分子層面來(lái)說(shuō)，PIC值越高，表明物種間遺傳差異越大，遺傳多樣性越豐富。本研究中不同鹽生草間多態(tài)性信息含量值較高，表明不同生態(tài)點(diǎn)的鹽生草材料間具有豐富的遺傳多樣性。

聚類分析結(jié)果表明，GS 為0.528～0.859，說(shuō)明18 份鹽生草材料遺傳多樣性較為豐富。在GS 為0.68 處，可將供試材料分為四大類，在第四類中，來(lái)自平川區(qū)和酒泉市的材料親緣關(guān)系很近，但兩地地理位置相差較遠(yuǎn)。張兆輝等［52］對(duì)瓠瓜（Lagenaria siceraria var.hispida）的研究以及薛楊等［53］對(duì)梨（Pyrusspp.）砧木的研究結(jié)果表明，地區(qū)分布相近的材料有聚為同一類的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與此不一致。但也有研究表明不同地區(qū)的種質(zhì)材料會(huì)聚為一類，來(lái)源相同的材料卻沒有聚為一類，這說(shuō)明來(lái)源相同的材料其遺傳背景會(huì)存在差異，來(lái)源不同的材料其遺傳背景有可能相同或相近［54］。

4 結(jié)論

本研究基于已公布的鹽生草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息，在轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分析，并對(duì)甘肅18 個(gè)不同生態(tài)點(diǎn)鹽生草材料進(jìn)行了SSR 標(biāo)記位點(diǎn)的開發(fā)及遺傳多樣性分析。得到以下結(jié)論：在鹽生草轉(zhuǎn)錄組水平，共鑒定到29640 個(gè)SSR 位點(diǎn)，平均每4.93 kb 有1 個(gè)SSR。SSR 種類包含1～6 核苷酸重復(fù)類型，重復(fù)次數(shù)主要為4～20 次。用多態(tài)性較高的33 對(duì)共檢測(cè)得到199 個(gè)等位基因位點(diǎn)，等位基因數(shù)、基因型數(shù)量、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量和遺傳相似系數(shù)分別為3～13、2～13、0.583～0.869、0.527～0.856 和0.528～0.859。聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.68 處，將供試材料分為了四大類。本研究將為進(jìn)一步研究鹽生草遺傳多樣性及相關(guān)性狀的連鎖分析提供參考。