田 薇，李秀梅，楊 娟，王小瑩，周煒煒，李中媛，戴小楓

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081；2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

細(xì)菌感染會對禽畜養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前，普遍采取抗生素作為抑菌劑進(jìn)行防治，由于長期使用抗生素，會產(chǎn)生耐藥菌株，導(dǎo)致抗生素不斷加大使用量，造成“超級細(xì)菌”的產(chǎn)生，嚴(yán)重威脅到公共衛(wèi)生安全和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。中藥防治禽畜疾病具有悠久的歷史，而且中藥具有無殘留或低殘留、低毒副作用、不易形成耐藥性等優(yōu)勢，因此，從中草藥中尋找到一種能夠替代抗生素作為抑菌劑的方法具有重要意義。

板藍(lán)根()是中國著名的傳統(tǒng)中藥，又名菘藍(lán)、北板藍(lán)、大藍(lán)根及大青根等，其為十字花科植物菘藍(lán)的干燥根，入藥前需要炮制，被作為藥材記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有上千年歷史，其性寒，味先甘后苦，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，在臨床中應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理研究證實，其主要對常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、枯草桿菌等多種強感染性的病原微生物具有不同程度的抑制效果。板藍(lán)根抑菌藥效成分復(fù)雜、作用靶點多，但目前的研究中缺乏對板藍(lán)根抑菌作用的整體認(rèn)識。

近年來，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的研究人員將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和中醫(yī)藥研究聯(lián)系起來，從傳統(tǒng)的尋找單一靶點轉(zhuǎn)變?yōu)閺南到y(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度研究，分析具有多成分、多途徑和多靶點協(xié)同作用等特點的中藥中大多數(shù)成分的變化，更重要的是確定中藥作用靶標(biāo)，并對中藥的分子機(jī)制進(jìn)行分析，闡述了多靶點與多成分間復(fù)雜網(wǎng)狀相互作用關(guān)系。所以，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示板藍(lán)根抑菌的藥效成分及其作用分子機(jī)制，從而為板藍(lán)根抑菌作用的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫平臺

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究所用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫平臺網(wǎng)址見表1。

表1 本文所用數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)址

1.2 材料

1.2.1 菌株 大腸桿菌CVCC1515來源于本課題組。

1.2.2 藥品和試劑 豆甾醇(純度≥98%)、LB培養(yǎng)基、5×蛋白上樣緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司,SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自美國BIO-RAD公司,未預(yù)染蛋白Marker購自Thermofisher Scientific公司。

1.2.3 儀器 MultiskanTM Skyhigh酶標(biāo)儀(Thermofisher Scientific公司),SDS-PAGE蛋白電泳儀(BIO-RAD公司),凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),低溫高速離心機(jī)(Tokyo公司),落地式超凈工作臺(Airtech公司)。

1.3 方法

1.3.1 板藍(lán)根藥效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 通過數(shù)據(jù)庫TCMSP搜索板藍(lán)根的化學(xué)成分和潛在作用靶點，篩選口服生物利用度(OB)≥30%和化合物類藥性(DL)≥0.18的藥效成分，將靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Cytoscape_3.7.0軟件構(gòu)建板藍(lán)根藥效成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2 抑菌靶點搜集 以“抑菌(antibacterial)”作為檢索關(guān)鍵詞，利用GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索相關(guān)靶點，獲取并篩選抑菌靶點。

1.3.3 抑菌靶點篩選 通過Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，對板藍(lán)根抑菌靶點進(jìn)行可視化處理，并利用Cytoscape_3.7.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將板藍(lán)根藥效成分的抑菌靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，選擇“human”物種，進(jìn)行PPI預(yù)測分析，構(gòu)建關(guān)鍵靶點互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3.5 GO功能和KEGG通路富集分析 將所有板藍(lán)根抑菌關(guān)鍵靶點輸入至DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫，以≤0.01為前提進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，根據(jù)GO富集分析前10條繪制富集數(shù)量統(tǒng)計柱狀圖，選取KEGG富集分析前20條信號通路繪制富集顯著性氣泡圖。

1.3.6 分子對接 選取抑菌關(guān)鍵靶點并在PBD數(shù)據(jù)庫中查找對應(yīng)分辨率較高的蛋白,并下載3D結(jié)構(gòu)式。從Pubchem數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)藥效成分3D結(jié)構(gòu)。通過Autodock Tools 1.5.7軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行除去水分子和加氫等操作，將處理后的關(guān)鍵靶點和藥效成分結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.7軟件中進(jìn)行分子對接驗證試驗，結(jié)合能越小代表對接越穩(wěn)定，若結(jié)合能<0 kJ·mol，表示蛋白質(zhì)與小分子能夠自發(fā)地結(jié)合；結(jié)合能≤-20.93 kJ·mol，則表示結(jié)合活性良好，選取結(jié)合能≤-20.93 kJ·mol的蛋白質(zhì)-小分子對接，通過PyMol 2.4軟件構(gòu)建3D示意圖。

從式(2)可以看出，如果在t-tr時刻發(fā)射了電磁波，那么會在t時刻接收到反射回來的回波信號。由于vr遠(yuǎn)小于c,故延時tr可以近似如式(5)所示：

1.3.7 抑菌試驗 設(shè)置空白對照組和藥物處理組(1.00、0.5.00、0.25 mg·mL)，大腸桿菌終濃度1×10CFU·mL，37 ℃共培養(yǎng)12 h，取菌液稀釋至10個·mL，取100 μL稀釋菌液涂布于LB平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄菌落數(shù)。

抑菌率=(空白對照菌落數(shù)—試驗組菌落數(shù))/空白對照菌落數(shù)×100%。

1.3.8 SDS-PAGE法檢測目的蛋白含量 設(shè)置空白對照組和豆甾醇處理組(1.00、0.50、0.25 mg·mL)，大腸桿菌終濃度1×10CFU·mL，37 ℃、200 r·min條件下共培養(yǎng)12 h，每組各取3 mL菌液，5 000 r·min離心10 min，用無菌PBS重懸菌液至相同濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，12 000 r·min離心1 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié) 果

2.1 板藍(lán)根藥效成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運用TCMSP在線數(shù)據(jù)庫篩選得到33個符合條件的藥效成分，包括黃酮類、甾體類化合物、吲哚類化合物、生物堿等(表2)。通過Cytoscape_3.7.0軟件對板藍(lán)根33個藥效成分和61個藥效成分作用靶點進(jìn)行映射(圖1)，化學(xué)成分的degree值越高，說明該化學(xué)成分作用靶點越多，為關(guān)鍵成分，發(fā)現(xiàn)-谷甾醇(27)、豆甾醇(23)、金合歡素(19)、清風(fēng)藤堿(15)、甜橙黃酮(15)等可能為抑菌關(guān)鍵藥效成分。

表2 板藍(lán)根主要活性成分

綠色三角代表板藍(lán)根，黃色菱形代表板藍(lán)根的藥效成分，藍(lán)色橢圓形代表板藍(lán)根潛在作用靶點The green triangle represents Isatis indigotica, the yellow diamond represents the effective active ingredients of Isatis indigotica, and the blue oval represents the potential target of Isatis indigotica圖1 板藍(lán)根藥效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active ingredients - target network of Isatis indigotica

2.2 板藍(lán)根藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過GeneCards和OMIM在線數(shù)據(jù)庫獲得2 192個 靶點。板藍(lán)根靶點與抑菌靶點取交集后得到32個交集靶點(圖2)。利用Cytoscape_3.7.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，作用靶點越多的藥效成分，其在生理生化作用中越關(guān)鍵。

圖2 板藍(lán)根與抑菌交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Isatis indigotica and antibacterial

紅色的V形代表抑菌，綠色三角形代表板藍(lán)根，黃色菱形代表板藍(lán)根藥效成分，藍(lán)色橢圓代表交集靶點The red V shape represents bacteriostasis, the green triangle represents Isatis indigotica, the yellow diamond represents the effective active ingredients of Isatis indigotica, and the blue ellipse represents the intersection target圖3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 “Drugs-Ingredients-Diseases-Targets” network diagram

2.3 板藍(lán)根抑菌的關(guān)鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

把32個交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析，其中，一個靶點上的連線越多，則這一靶點蛋白等級越高。靶點之間的連線越多，可以說明靶點蛋白之間的結(jié)合度越高，除去游離靶點CHRM3和KCNH2后，剩余30個靶點進(jìn)行PPI分析(表3)。

表3 板藍(lán)根抑菌STRING網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

通過DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫對板藍(lán)根關(guān)鍵抑菌靶點進(jìn)行GO功能富集分析，共獲取126條GO條目，分別選取前10個分析條目繪制柱狀圖(圖4)。生物過程主要涉及對雌二醇的反應(yīng)、凋亡信號通路、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、沒有配體的外源性凋亡信號通路、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)等86個；細(xì)胞組分主要分布于細(xì)胞質(zhì)、核、膜筏、核質(zhì)、線粒體等11個；分子功能主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)同源二聚化活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、參與細(xì)胞凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等29個。KEGG通路分析共獲得TNF信號通路、NOD受體信號通路、TOLL樣受體信號通路等59個通路，選取KEGG富集顯著性統(tǒng)計前20條通路繪制氣泡圖(圖5)。

圖4 板藍(lán)根抑菌靶點的GO分析Fig.4 GO analysis of antibacterial targets of Isatis indigotica

圖5 板藍(lán)根抑菌關(guān)鍵靶點 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of key antibacterial targets of Isatis indigotica

2.5 分子對接

“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中選取degree值排名前3的核心藥效成分與抑菌關(guān)鍵靶點CASP3、PTGS2編碼的蛋白分子進(jìn)行對接(表4)，所有組合對接結(jié)合能均<0 kJ·mol，表明蛋白質(zhì)與小分子能夠自發(fā)結(jié)合。其中,結(jié)合能≤-20.93 kJ·mol的蛋白質(zhì)-小分子對接結(jié)果3D示意圖見圖6。

表4 板藍(lán)根核心藥效成分與抑菌關(guān)鍵靶點的結(jié)合能

圖6 PTGS2和CASP3與板藍(lán)根核心藥效成分分子對接3D圖(結(jié)合能≤-20.93 kJ·mol-1)Fig.6 Molecular docking 3D diagram of PTGS2 and CASP3 with core active ingredients in Isatis indigotica(binding energy≤-20.93 kJ·mol-1)

2.6 抑菌試驗

通過分子對接預(yù)測篩選出核心藥效成分，采用菌落計數(shù)法驗證-谷甾醇、豆甾醇、金合歡素對大腸桿菌的抑菌作用，因-谷甾醇和金合歡素的溶解性差，易析出，未能獲得試驗數(shù)據(jù)。通過菌落計數(shù)法證明豆甾醇對大腸桿菌的抑菌作用呈劑量依賴關(guān)系(圖7)。

A. 抑菌試驗；B.抑菌率A. Bacteriostatic test; B. Antibacterial rate圖7 豆甾醇對大腸桿菌的抑制作用Fig.7 Antibacterial effect of stigmasterol on Escherichia coli

2.7 SDS-PAGE法檢測目的蛋白含量

采用SDS-PAGE法驗證豆甾醇對目的蛋白PTGS2(74 ku)和CASP3(17 ku)表達(dá)的影響。結(jié)果表明，豆甾醇處理組與對照組相比，豆甾醇能夠下調(diào)大腸桿菌胞內(nèi)PTGS2和CASP3蛋白的表達(dá)量，且呈劑量依賴關(guān)系(圖8)，可見，豆甾醇處理組的大腸桿菌胞內(nèi)的CASP3和PTGS2可能被分泌到了胞外，說明豆甾醇通過調(diào)控CASP3和PTGS2關(guān)鍵靶點實現(xiàn)抑菌作用，與分子對接的預(yù)測結(jié)果一致。

M.Marker；1.空白對照組；2～4.豆甾醇高、中、低劑量組M. Marker; 1. The blank control; 2, 3, 4. Stigmasterol with high, medium and low dose圖8 豆甾醇對大腸桿菌菌體蛋白表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of stigmasterol on protein expression of Escherichia coli

3 討 論

板藍(lán)根是清熱解毒的代表藥物，具有抗菌、抗病毒、增強機(jī)體免疫力等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，板藍(lán)根具有廣譜的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對雞白痢沙門菌、肺炎雙球菌等革蘭陰性菌有較強的抑菌能力。但其具體抗菌作用成分和作用機(jī)制尚未知。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路篩選了33個藥效成分。金合歡素、異牡荊素、高車前素、甜橙黃酮、花旗松素、新橙皮苷等是黃酮類化合物，對許多病原微生物(革蘭陰性菌和革蘭陽性菌、真菌)具有不同程度抑制效果；其中，金合歡素可抑制金黃色葡萄球菌中膜相關(guān)蛋白SrtA的活性，結(jié)果能夠影響該細(xì)菌的蛋白 A (SpA) 與細(xì)胞壁的組裝，并減少金黃色葡萄球菌的結(jié)合，從而達(dá)到抑菌的效果；有研究發(fā)現(xiàn)，高車前素具有抑制黃曲菌、紅色毛蘚菌等真菌的能力。扶桑甾醇、谷甾醇、-谷甾醇、膽固醇、豆甾醇等甾體類化合物，具有抗菌作用；其中，-谷甾醇能夠增加抗菌肽的表達(dá)、與細(xì)胞結(jié)合位點結(jié)合等方法達(dá)到抑菌效果。-谷甾醇能一定程度抑制金黃色葡萄球菌、芽胞桿菌等。依靛藍(lán)酮、羥基靛玉紅等吲哚類化合物，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌和植物病菌均具有一定抑制能力?；诖耍茰y板藍(lán)根可以通過這33種藥效成分及其相應(yīng)的抑菌靶點起到抑菌作用。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53，TP53)、胱天蛋白酶3(apoptosis-related cysteine peptidase，CASP3)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1,JUN)、人前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)等互作頻率較大，為板藍(lán)根抑菌關(guān)鍵靶點。其中,TNF是板藍(lán)根抑菌最關(guān)鍵的靶點，TNF可通過激活T細(xì)胞免疫活性參與免疫應(yīng)答，具有殺傷轉(zhuǎn)化細(xì)胞和某些病毒感染的細(xì)胞的能力。在接受TNF-α受體阻滯劑的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中出現(xiàn)嚴(yán)重甚至具有致命性的軍團(tuán)菌和李斯特菌感染的風(fēng)險。TP53是影響細(xì)胞生長、遷移和損傷修復(fù)的關(guān)鍵感應(yīng)因子，其與先天性抗病毒免疫、抗增殖作用及病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄都有關(guān)。CASP3為caspase級聯(lián)激活下游重要成分，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的核心蛋白，在細(xì)胞凋亡早期階段，CASP3被激活時，由兩個大亞基(17 ku)和兩個小亞基組成。PTGS2為前列腺素生物合成中的核心成分，能夠參與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多種生理病理過程，其既是一種過氧化物酶也是一種雙環(huán)氧合酶，能夠?qū)⒍嘉逑┧狨マD(zhuǎn)化為13R-HDPA，13R-HDPA經(jīng)過加工修飾能夠激活巨噬細(xì)胞吞噬作用在細(xì)菌感染期間。由此推測，板藍(lán)根可能通過這些抑菌靶點發(fā)揮抑菌作用。

GO和KEGG富集分析結(jié)果表明，板藍(lán)根抑菌涉及多方面生物學(xué)過程和多條信號通路，根據(jù)值得到TNF信號通路、NOD受體信號通路、TOLL樣受體信號通路等主要信號通路。TNF是一種多功能的促炎信號因子，其與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，參與免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活、功能和分化，具有調(diào)控防止惡性細(xì)菌感染、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡等作用。TOLL樣受體為免疫系統(tǒng)里的關(guān)鍵蛋白，特異性識別病原微生物上的受體，激活一系列先天性免疫應(yīng)答，進(jìn)而調(diào)控炎癥因子、趨化因子的表達(dá)，細(xì)胞因子也通過調(diào)控各種炎癥和抑菌基因，包括趨化因子、免疫細(xì)胞的募集和激活，達(dá)到消滅金黃色葡萄球菌的目的。NOD受體信號通路是一種關(guān)鍵的先天免疫系統(tǒng)，其屬于模式識別受體的特定家族，能夠識別多種病原微生物并激活先天性免疫反應(yīng)，其中，NOD1、2能夠檢測從內(nèi)體區(qū)室中逸出的細(xì)菌肽聚糖片段的胞質(zhì)存在，從而調(diào)控NF-κB和MAPK的激活、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。推測板藍(lán)根主要通過這些通路起到抑菌作用。分子對接結(jié)果表明，板藍(lán)根核心藥效成分與關(guān)鍵靶點均能夠自發(fā)結(jié)合，其中,大部分組合擁有良好的結(jié)合活性(結(jié)合能≤-20.93 kJ·mol)，表明了板藍(lán)根藥效成分能夠通過調(diào)控上述抑菌關(guān)鍵靶點起到抑菌作用，本研究通過SDS-PAGE法發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，豆甾醇藥物處理組大腸桿菌(CVCC1515)胞內(nèi)PTGS2和CASP3的蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而下降，表明豆甾醇藥物處理組大腸桿菌(CVCC1515)胞內(nèi)PTGS2和CASP3的蛋白被分泌到胞外，胞外的PTGS2和CASP3的蛋白表達(dá)量隨藥物濃度的增加而增大，該結(jié)果與車?yán)俚难芯拷Y(jié)果相同，在車?yán)俚难芯恐?，用高氧液處理?xì)菌生長，通過實時定量PCR發(fā)現(xiàn)試驗組中CASP3和SOD基因顯著升高，說明高氧液的作用是通過氧抑制作用，使細(xì)菌程序性死亡增加實現(xiàn)的。綜上所述，板藍(lán)根具有一定的抑菌作用，驗證了上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。

4 結(jié) 論

板藍(lán)根主要通過豆甾醇調(diào)控CASP3、PTGS2等靶點，基因功能富集于細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等參與癌癥途徑、TNF信號通路發(fā)揮抑菌作用。