沈麗艷，楊玉婷，李 星，高 歡，趙智勇，潘洪彬*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650201)

我國肉雞養(yǎng)殖量巨大，肉雞產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國畜牧業(yè)中現(xiàn)代化、規(guī)?；?、集約化、組織化和市場化程度最高的產(chǎn)業(yè)之一，其中溫度是影響肉雞生長發(fā)育的主要因素，溫度不適會降低肉雞的成活率，影響肉雞生長，誘發(fā)疾病。研究顯示，急性熱應(yīng)激影響肉仔雞的生長發(fā)育、生產(chǎn)性能及腸道免疫，使采食量、平均日增重及飼料效率顯著降低；短期冷應(yīng)激增加肉雞采食量和死亡率，降低肉雞腸道免疫細(xì)胞的性能，引起肉仔雞腹水癥和疾病發(fā)生率升高。

動物腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要器官，也是機體內(nèi)最大的免疫器官，腸道微生物發(fā)揮營養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)控、腸道上皮細(xì)胞修復(fù)、腸道黏膜免疫激活、宿主行為調(diào)控、抵抗病原微生物等重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，42日齡肉雞5個不同腸道部位(十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸)在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、維持免疫系統(tǒng)、抵抗病原體和增強身體健康方面發(fā)揮著獨特的作用，且不同的腸道微生物組成導(dǎo)致不同的腸道功能。其中十二指腸菌群組成和功能的顯著變化可能會影響宿主對膳食營養(yǎng)素的生物利用率。然而，目前研究多集中在急性或短期冷熱應(yīng)激對肉雞生長性能和機體健康影響方面，對于長期相對高、低溫飼養(yǎng)環(huán)境下肉雞十二指腸微生物鮮見報道，因此本研究開展長期相對高、低溫飼養(yǎng)環(huán)境對肉雞十二指腸微生物多樣性及腸道菌群組成的影響，以期為環(huán)境溫度通過十二指腸微生物影響肉雞健康提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物飼養(yǎng)與管理

1.1.1 試驗設(shè)計 選取300只1 d健康艾維茵肉仔雞，隨機分為3組，每組100只，NRC無抗日糧兩階段飼喂，以北京畜禽育種公司推薦的AV500肉雞飼養(yǎng)管理手冊的溫度控制參數(shù)為對照，分為高溫組(HD組)、對照組(CD組)和低溫組(LD組)，各組1日齡的初始溫度分別為36.5 ℃、33.5 ℃和30.5 ℃，溫度隨日齡平行遞減，與CD組的溫差均為3 ℃，至42 d各組分別降至22 ℃、19 ℃和16 ℃，其他飼養(yǎng)條件一致。

1.1.2 飼養(yǎng)管理 試驗在云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院畜禽環(huán)境研究所家禽實驗基地進行，棟舍自動控溫、通風(fēng)，稻殼墊料地面平養(yǎng)，光照、相對濕度等飼養(yǎng)條件均一致，肉仔雞按常規(guī)管理，自由采食與飲水。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 隨機選取42 d肉雞36只(12只/組，公母各半)進行屠宰，迅速采集十二指腸食糜，凍存管液氮保存。

1.3 序列數(shù)據(jù)分析

1.3.1 OTU聚類分析 利用Usearch序列分析軟件在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU。

1.3.2 Alpha多樣性分析 利用QIIME軟件基于OTU結(jié)果計算每個樣本的物種的Alpha多樣性，包括Chao1、Good's Coverage、Shannon、Observed Species、PD whole tree和Simpson指數(shù)，并作出相應(yīng)的稀釋曲線。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都是用來估算微生物群落的多樣性，Shannon、Simpson值越大，多樣性越高。其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的計算公式分別為：

式中：Sobs：實際觀察到的OTU數(shù)量；ni：第i個OTU的序列數(shù)量；N：所有的序列數(shù)。Note: Sobs: OTU number observedni: the number of sequences of the i-th OTUN: all the sequences.

1.3.3 Beta多樣性分析 利用MRPP組間差異分析檢驗組間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異是否顯著。利用相似性分析Anosim分析檢驗組間(兩組或多組)的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，判斷分組是否有意義。

1.3.4 物種豐度分析 從各個OTUs中挑選出豐度最高的一條序列，作為該OTU的代表序列，將該代表序列與已知物種的 16S數(shù)據(jù)庫(RDP，http://rdp.cme.msu.edu)進行比對，從而對每個 OTU 進行物種歸類。根據(jù)物種注釋情況，統(tǒng)計每個樣品注釋到各分類水平(門、綱、目、科、屬)上的序列數(shù)目。

1.3.5 LEfSe分析 利用LEfSe(LDA Effect Size，Linear discriminant analysisEffect Size)分析確定三組之間差異最大的OTU。

1.3.6 功能注釋與差異表達(dá)分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.jp/kegg)，進行PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)基因功能預(yù)測分析，探索各樣品的菌群功能分布，挑選出主要的功能分布進行分析。

1.3.7 相關(guān)性分析 在GraphPad Prism 7.0中執(zhí)行Spearman，分析十二指腸差異屬與KEGG途徑之間的相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 22.0軟件進行單因素統(tǒng)計分析，用LSD法進行平均值的多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。<0.05表示差異顯著(n=12)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU聚類分析

如圖1所示，HD、CD和LD組分別獲得1079，1273和1327個OTU，三組共有OTU數(shù)量為585個，分別占比54.22%，45.95%和44.08%；HD、CD和LD組特有OTU的數(shù)量分別為257，345和380個，其占比分別為23.82%，27.10%和28.64%。

圖1 組間OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution between groups

2.2 Alpha多樣性分析

如表1所示，與CD組相比，HD組Shannon指數(shù)顯著增加，LD組Shannon、Simpson指數(shù)顯著增加(<0.05)，表明在長期相對高、低溫飼養(yǎng)環(huán)境下肉雞十二指腸微生物多樣性增加。

表1 Alpha多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis

2.3 Beta多樣性分析

如表2所示，基于UniFrac分析利用系統(tǒng)進化的信息來比較組間的物種群落差異，在Unweighted Unifrac情況下，=0.014，expect delta=0.62 > observe delta=0.61，=0.007，組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。如圖2所示，Anosim分析結(jié)果也表明，在Unweighted Unifrac情況下，=0.103，=0.011，組間差異大于組內(nèi)差異，表明組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

圖2 十二指腸微生物16S rRNA樣品的組間Anosim相似性指數(shù)分析圖Fig. 2 Analysis of intergroup Anosim similarity index of duodenum microbial 16s rRNA samples

表2 物種MRPP組間差異分析Table 2 Analysis of differences between species MRPP groups

2.4 十二指腸食糜微生物物種豐度與分類統(tǒng)計

如表3所示，在門水平，與CD組相比，HD組Firmicutes的豐度顯著增加31.55%(<0.05)，Proteobacteria和Verrucomicrobia的豐度分別顯著降低28.75%、0.27%(<0.05)，Actinobacteria的豐度增加1.09%(>0.05)；LD組Firmicutes、Actinobacteria的豐度分別增加13.93%、0.89%，Proteobacteria和Verrucomicrobia的豐度分別降低14.93%、0.15%(>0.05)。

表3 肉雞十二指腸微生物門水平組成及差異分析Table 3 Composition and difference analysis of duodenum microbiota at phylum level in broilers

如表4所示，在屬水平，與CD組相比，HD組、的豐度分別顯著增加49.07%、1.34%；Alistipes的豐度顯著降低2.34%(<0.05)；LD組的、、、、的豐度分別顯著增加7.01%、1.33%、6.35%、1.6%、0.2%(<0.05)。

表4 肉雞十二指腸微生物屬水平組成及差異分析Table 4 Composition and difference analysis of duodenum microbial at genus levels in broilers

2.5 組間十二指腸食糜微生物顯著性差異分析

如圖3所示，CD組中疣微菌門(Verrucomicrobia)顯著富集。在目水平，HD組中乳酸桿菌目(Lactobacillales)、放線菌目(Actinomycetales)、脫硫桿菌目(Desulfobacterales)顯著富集；LD組中酸微菌目(Acidimicrobiales)顯著富集。對照組中短桿菌科(Brevibacteriaceae)、Sutterellaceae、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)顯著富集；HD組中乳桿菌科(Lactobacillaceae)、脫硫球菌科(Desulfobulbaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)顯著富集；LD組中假諾卡氏科(Pseudonocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae 1)顯著富集。等8個屬在CD組顯著富集；HD組中，等5個屬顯著富集；LD組中，等5個屬顯著富集。

圖3 三組在L3層級的LEfSe分析藍(lán)色，CD組；紅色，HD組；綠色，LD組。僅顯示LDA >2的物種。下同。Fig.3 LEfSe analysis of HD, CD and LD groups at L3 levelBlue: CD group;Red :HD group;Green: LD group.Only species of LDA >2 are shown.The same below.

2.6 十二指腸食糜微生物功能注釋及組間差異分析

如圖4所示，CD組在L3層級顯著富集的信號通路為維生素B6代謝；HD組在L3層級顯著富集的信號通路為二惡英降解、脂類代謝、二甲苯降解；LD組在L3層級顯著富集的信號通路為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、組氨酸代謝、氨基酸代謝、葉酸生物合成、泛酸和輔酶A的生物合成、新生霉素生物合成、其他轉(zhuǎn)運蛋白、鐵載體基團非核糖體肽的生物合成。

圖4 三組在L3層級富集信號通路的KEGG分析Fig. 4 KEGG analysis of enriched signal pathways in the HD,CD and LD groups at L3 hierarchy

2.7 差異微生物與信號通路關(guān)聯(lián)分析

差異微生物與信號通路相關(guān)性的熱圖分析見圖5。如圖5所示，CD組富集的Vitamin B6 metabolism信號通路與、呈負(fù)相關(guān)，與、、、呈正相關(guān)；HD組富集的Dioxin degradation信號通路與呈正相關(guān)，與呈負(fù)相關(guān)；LD組富集的Folate biosynthesis和Amino acid metabolism信號通路與、呈正相關(guān)。

圖5 差異微生物與信號通路相關(guān)性的熱圖分析圖中數(shù)值為Spearman相關(guān)系數(shù)，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)的絕對值大于0.38表示P<0.05Fig. 5 Heatmap analysis of the correlation between differential microbial and signal pathways The value in the figure is Spearman correlation coefficient,red indicates positive correlation, blue indicates negative correlation, the absolute value of the correlation coefficient is greater than 0.38, which means P<0.05

3 討 論

腸道菌群是機體內(nèi)環(huán)境中不可缺少的組成部分，腸道菌群的動態(tài)平衡對維持機體的健康有著重要的作用。肉雞各段消化道微生物區(qū)系組成和功能不同，其中嗉囊微生物組成與十二指腸相似，并且當(dāng)機體外界環(huán)境波動較大或遭受應(yīng)激時，會破壞腸道菌群平衡。持續(xù)偏熱環(huán)境使肉雞盲腸微生物多樣性指數(shù)和豐富度下降，但回腸的微生物豐富度顯著增加。短期急性熱應(yīng)激使肉雞盲腸Firmicutes、Proteobacteria的相對豐度增加，Bacteroidetes的相對豐度減少；而在短期急性熱應(yīng)激時，蛋雞糞便微生物群落中Firmicutes的相對豐度減少，Bacteroidetes的相對豐度顯著增加；在急性冷應(yīng)激時，雛雞盲腸微生物大腸桿菌()相對豐度呈逐漸增多趨勢，相對豐度呈現(xiàn)下降趨勢，并且影響了腸道的生物屏障功能。研究發(fā)現(xiàn)，肉雞消化道腸道微生物以Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和 Actinobacteria為主。結(jié)果顯示，HD、CD、LD組肉雞十二指腸主要菌群均為菌群為Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria，與前人的研究結(jié)果一致。

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是反映菌群的多樣性的主要指標(biāo)，受樣品群落中物種豐富度和均勻度的影響，值越大說明樣品群落中物種分配越均勻，多樣性越高。研究發(fā)現(xiàn)，長期相對低溫環(huán)境下顯著增加了肉雞空腸的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。本研究中，LD組肉雞十二指腸Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)增加和HD組肉雞十二指腸Shannon指數(shù)指數(shù)增加，表明長期相對高溫和低溫環(huán)境均使肉雞十二指腸微生物多樣性增加。

腸道菌群在脂質(zhì)代謝和吸收中起著重要作用，其中是人類和其他哺乳動物微生物群的重要組成部分，存在于呼吸道、胃腸道和生殖道，是目前廣泛使用的益生菌之一，Lactobacillus可以通過利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸，其發(fā)酵產(chǎn)物可調(diào)節(jié)脂代謝。據(jù)報道，腸道微生物群可以通過調(diào)節(jié)空腹誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞因子(Fiaf)基因表達(dá)來調(diào)控脂質(zhì)代謝，而脂質(zhì)代謝與脂肪酸沉積密切相關(guān)。長期相對高溫環(huán)境下飼養(yǎng)肉雞，空腸的相對豐度增加，且與Lipid metabolism信號通路呈負(fù)相關(guān)。本研究中，HD組肉雞十二指腸的相對豐度增加，與Lipid metabolism信號通路呈負(fù)相關(guān)，表明相對高溫環(huán)境下肉雞可能通過負(fù)向影響脂類的吸收與利用。

研究發(fā)現(xiàn)，肉雞糞便微生物群中隨著熱應(yīng)激而減少。葉酸是一種水溶性B族維生素，在核酸生物合成、甲基化反應(yīng)和含硫氨基酸代謝的單碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并且葉酸缺乏癥會增加促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-的表達(dá)，而腸道菌群會增加腸道內(nèi)葉酸的含量，在人體結(jié)腸中被吸收，且與腸道葉酸生物合成功能呈極強的正相關(guān)。氨基酸作為人類飲食的重要組成部分，在促進生物活性分子的產(chǎn)生、維持信號通路和新陳代謝發(fā)揮著重要作用，其中腸道微生物在調(diào)節(jié)氨基酸消化和吸收過程中起著重要作用。通過比較無菌小鼠和常規(guī)小鼠，發(fā)現(xiàn)常規(guī)小鼠在胃腸道中的游離氨基酸的分布發(fā)生了改變，表明腸道微生物對宿主氨基酸的動態(tài)平衡和健康至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，長期相對低溫環(huán)境下肉雞十二指腸Bacteroides的相對豐度增加，與Folate biosynthesis信號通路呈正相關(guān)(r=0.60)，與Amino acid metabolism信號通路呈正相關(guān)(r=0.59)，提示長期相對低溫環(huán)境可能通過提高肉雞十二指腸Bacteroides的豐度增加葉酸的合成，起到抑炎的作用；并可能通過正向調(diào)控Amino acid metabolism信號通路的表達(dá)促進氨基酸的代謝，進而促進氨基酸的動態(tài)平衡和健康。

4 結(jié) 論

長期相對高溫和低溫均使肉雞十二指腸菌群多樣性增加。長期相對高溫可能通過增加肉雞十二指腸Lactobacillus的相對豐度增加負(fù)向調(diào)控脂類的吸收與利用；而長期相對低溫可能通過增加十二指腸Bacteroides的相對豐度增加葉酸的合成和氨基酸的代謝。