木犀草素納米乳清除超氧陰離子研究

胡澤香，佟雷，耿艷萌，楊琦，謝舒，侯甲福(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

木犀草素(Luteolin)是一種黃酮類化學(xué)物質(zhì)[1]，廣泛分布于自然界中，例如金銀花、菊花、白貓夏枯草等傳統(tǒng)中藥中[2]。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[3]，在臨床多應(yīng)用在止咳、祛痰、消炎方面[4]。黃酮類化合物因其化學(xué)結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的抗氧化活性[5]，起主要作用的就是酚羥基的取代基位置和數(shù)目，尤其是B環(huán)的鄰二酚羥基[6]。木犀草素應(yīng)具有抗氧化活性[7]。但由于木犀草素在熱水中微溶，在冷水中不溶，從根本上限制了木犀草素的應(yīng)用。納米乳是由水相、油相和乳化劑組成的一種溶液體系，可提高水難溶性藥物成分的溶解度，同時體系中具有高度分散的小液滴，在體內(nèi)分布快，藥效高，可以極大地提高藥物吸收速度來發(fā)揮藥效，來提高生物利用度，本實驗將木犀草素制備成水包油型納米乳來克服水溶性差的特點(diǎn)，文章主要從木犀草素納米乳清除超氧陰離子自由基方面來研究其抗氧化活性，并以VC作為陽性對照。

1 材料與儀器

1.1 材料

木犀草素(上海泰坦科技股份有限公司)；鹽酸溶液(哈爾濱試劑化工廠)；維生素C片(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)；Tris-Base(飛凈科研試劑)；鄰苯三酚(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；乙酸乙酯(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；Tween-80(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(江蘇省蘇州市新區(qū)華山路145號)；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 超氧陰離子自由基清除能力的測定

鄰苯三酚自氧化-分光光度法可以用來初步篩選食品行業(yè)的抗氧化劑，也可以對清除超氧陰離子自由基的能力進(jìn)行評價[8]。鄰苯三酚的自氧化過程是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在堿性條件下可以自氧化生成超氧陰離子自由基[9]。鄰苯三酚在pH值＜9的條件下其自氧化速率與生成的超氧陰離子自由基的濃度成正相關(guān)。通過紫外分光光度計測量木犀草素對超氧陰離子自由基的清除作用來間接描述木犀草素的抗氧化活性[10]。

2.1.1 溶液配制

(1) Tris溶液配制：準(zhǔn)確稱取1.211 4 g Tris固體，蒸餾水溶解后定容至100 mL，得濃度為0.1 moL/L Tris溶液。

(2) Tris-HCl溶液配制：將Tris溶液50 mL與0.1 moL/L HCl溶液22.9 mL混合，加蒸餾水將體積調(diào)至100 mL，得濃度為50 mmoL/L Tris-HCl溶液。

(3)鄰苯三酚溶液配制：準(zhǔn)確稱取鄰苯三酚0.037 8 g, 10 mmol/L HCl溶解后定容至100 mL，得濃度為3 mmoL/L鄰苯三酚溶液。

(4) HCl溶液配制：準(zhǔn)確稱取10 mL的0.1 mol/L HCl溶液，蒸餾水溶解后定容至100 mL，得濃度為10 mmol/L HCl溶液。

(5)木犀草素納米乳配制：將乙酸乙酯、蒸餾水、tween-80、無水乙醇四種組分按照不同的比例加入燒杯中，加入4 mg木犀草素，攪拌混合之后共100 mL。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲，最終形成木犀草素納米乳。分別取 10、9、8、7、6、5 mL 木犀草素溶液置于試管，加入無水乙醇定容至10 mL，得到溶液的濃度分別為 0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020 mg/mL。

(6) VC溶液配制：準(zhǔn)確稱取9.8 mg VC粉末，蒸餾水溶解后定容至100 mL。分別取10、9、8、7、6、5 mL VC溶液置于試管，加入蒸餾水定容至10 mL，得到溶液的濃度分別為 0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020 mg/mL。

2.1.2 操作步驟

(1)鄰苯三酚自氧化速率測定。試管中加入Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入4.2 mL蒸餾水，混和之后進(jìn)行水浴加熱[11]。設(shè)置溫度為25 ℃，20 min取出之后，馬上加入0.3 mL相同溫度下已經(jīng)預(yù)熱好的鄰苯三酚[12]，混合均勻之后開始計時。波長設(shè)為325 nm，吸光度值每隔30 s記錄一次，時間為4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液作為空白管[13]。橫坐標(biāo)是時間，縱坐標(biāo)是吸光度值，做出的曲線斜率為鄰苯三酚自氧化的反應(yīng)速率K0。

(2)木犀草素納米乳對鄰苯三酚自氧化速率的影響。試管中加入Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入4.2 mL木犀草素納米乳，混和之后進(jìn)行水浴加熱。設(shè)置溫度為25 ℃，20 min取出之后，馬上加入0.3 mL相同溫度下已經(jīng)預(yù)熱好的鄰苯三酚，混合均勻之后開始計時。波長設(shè)為325 nm，吸光度值每隔30 s記錄一次，時間為4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液[14]，以無水乙醇4.2 mL代替木犀草素納米乳作為空白管。橫坐標(biāo)是時間，縱坐標(biāo)是吸光度值，做出的曲線斜率記為K1。然后按照下列公式計算清除率。

式中：K0為加入蒸餾水后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時間的變化率；K1為加入不同濃度木犀草素納米乳后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時間的變化率。

(3) VC對鄰苯三酚自氧化速率的影響。試管中加入Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入4.2 mL VC溶液，混和之后進(jìn)行水浴加熱。設(shè)置溫度為25 ℃，20 min取出之后，馬上加入0.3 mL相同溫度下已經(jīng)預(yù)熱好的鄰苯三酚，混合均勻之后開始計時。波長設(shè)為325 nm，吸光度值每隔30 s記錄一次，時間為4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液，以蒸餾水4.2 mL代替VC溶液作為空白管。橫坐標(biāo)是時間，縱坐標(biāo)是吸光度值，做出的曲線斜率記為K2。然后按照下列公式計算抑制率：

式中：K0為加入蒸餾水后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時間的變化率；K2為加入不同濃度VC溶液后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時間的變化率。

3 結(jié)果與分析

3.1 清除超氧陰離子自由基的能力

以VC為對照，不同濃度的木犀草素納米乳對超氧陰離子自由基的清除率如圖1所示。由圖1可以看出木犀草素納米乳對超氧陰離子具有清除作用，其清除作用效果與木犀草素納米乳濃度在一定范圍內(nèi)呈正向關(guān)系，木犀草素納米乳清除超氧陰離子自由基的能力稍弱于VC。在0.02～0.04 mg/mL 的有效范圍內(nèi)，隨木犀草素納米乳濃度的不斷增加，清除率也隨之不斷增加?？梢钥闯瞿鞠菟丶{米乳濃度越大，其對超氧陰離子的清除力越高。

圖1 木犀草素對超氧陰離子自由基的清除作用

作為一種特殊的金屬酶，超氧化物歧化酶(SOD)可以與超氧陰離子自由基發(fā)生反應(yīng)，從而對其進(jìn)行清除[15]。經(jīng)典的鄰苯三酚法是Marklund等第一次研究出了鄰苯三酚法來測定SOD活性[16]。鄰苯三酚在堿性條件下可以迅速氧化產(chǎn)生超氧陰離子而生成中間產(chǎn)物，隨著時間的延長，吸光度值增加，二者之間呈線性關(guān)系。該法簡單快速，重復(fù)性很好[17]。

3.2 木犀草素的抗氧化作用

當(dāng)氧氣與體內(nèi)某些物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時，會生成對人類有害的活性氧和自由基[18]?；钚匝鹾妥杂苫鶗茐纳锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)，引起DNA的突變，破壞生物大分子的的膜結(jié)構(gòu)和功能蛋白，由此加速機(jī)體的老化和損傷，甚至?xí)拱┌Y、惡性腫瘤的發(fā)生率增加[19]。木犀草素本身具有還原性，可作為氫供體給自由基提供氫原子[20]。主要作用于酶類抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，對抗氧自由基、活性氧等發(fā)揮抗氧化作用[21]。此外，木犀草素還可以增強(qiáng)生物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性[22]。Rooban等[23]發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)兩種酶，在被亞硒酸鹽誘導(dǎo)之后活性會降低，但是木犀草素可以緩解并可以增加其活性。Ashokkumar P等研究發(fā)現(xiàn)木犀草可以提高維生素A、維生素C和維生素E的含量，而這三種維生素是參與機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要物質(zhì)。木犀草素還能通過增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性來起到抗氧化的作用[24]。木犀草素雖有抗氧化活性，但其不表現(xiàn)為促氧化，可以很好地清除自由基[25]。

4 結(jié)語

實驗結(jié)果表明，木犀草素納米乳可有效清除超氧陰離子自由基，自由基清除能力很強(qiáng)，略弱于VC溶液，說明木犀草素納米乳具有很強(qiáng)的抗氧化活性[26]。木犀草素納米乳在抗氧化活性方面具有很好的開發(fā)潛能，可以更好地應(yīng)用于食品加工和醫(yī)療領(lǐng)域。