棉酚降解菌的篩選、鑒定及棉粕固態(tài)發(fā)酵效果研究

汪 豐，張維樹，崔 穎，葉林燕，李夢(mèng)托，曾維斯，周 煥，劉 楠，閆達(dá)中,

（1.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430023；2.武漢中糧食品科技有限公司，湖北武漢 430023）

棉籽粕為棉籽經(jīng)過脫殼、壓榨等工序得到的副產(chǎn)品，我國年產(chǎn)量600 萬噸。棉籽粕作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物，價(jià)格低廉，粗蛋白含量可達(dá)40%左右，是極具開發(fā)潛力的植物蛋白質(zhì)飼料資源。然而其含有棉酚、單寧、植酸等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它的應(yīng)用價(jià)值受到限制。按棉酚的存在形式，可將其分為游離棉酚和結(jié)合棉酚，而前者會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成動(dòng)物肝損傷，生殖功能障礙，引發(fā)呼吸窘迫、心律失常和溶血性貧血，有研究報(bào)道飼糧游離棉酚含量為162.5 mg/kg 時(shí)，導(dǎo)致育肥豬中毒死亡，更嚴(yán)重的是不同畜禽體內(nèi)殘留的游離棉酚通過食物鏈累積威脅著人類的健康。盡管我國棉籽粕產(chǎn)量很高，但受限于游離棉酚的毒性，其在飼料生產(chǎn)中的利用率還不到35%。因此，研究如何去除棉粕中的棉酚具有重要意義。

通過物理方法或者化學(xué)方法去除棉酚還存在諸多問題，或是能耗太高，或是會(huì)造成溶劑殘留、破壞原有營(yíng)養(yǎng)成分等。近年來，微生物處理法逐漸成為研究熱點(diǎn)，它不僅可以降解包括棉酚在內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子，無二次污染，還可以提高棉籽粕的蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵產(chǎn)物中存留的許多酶類、維生素、氨基酸以及促生長(zhǎng)因子，大大改善棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值。目前文獻(xiàn)報(bào)道的棉酚降解菌有曲霉、酵母菌、紅球菌、芽孢桿菌、乳桿菌等，侯敏等通過對(duì)比飼喂正常飼料和棉粕飼料下棉鈴蟲（）腸道微生物的異同，分離棉酚耐受性腸道內(nèi)生菌32 株，對(duì)棉酚最高降解率達(dá)90.83%。在棉酚降解產(chǎn)物鑒定方面，周生飛運(yùn)用LC-MS/MS 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，獲得18 種棉酚降解產(chǎn)物，推導(dǎo)出相應(yīng)分子結(jié)構(gòu)，提出了近平滑假絲酵母菌降解棉酚的代謝途徑。棉酚與萘的結(jié)構(gòu)相似，可以將其看成萘的衍生物，有學(xué)者認(rèn)為微生物降解棉酚的過程可能與萘的降解相似；同時(shí)棉酚是一種多環(huán)芳烴，目前已報(bào)道的參與多環(huán)芳烴降解的酶有加氧酶、脫氫酶和木質(zhì)素降解酶。關(guān)于微生物降解棉酚蛋白組學(xué)方面的研究報(bào)道寥寥無幾，目前僅有Yang 等以黑曲霉（）AN-1 為研究對(duì)象，以棉酚為唯一碳源培養(yǎng)后對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并利用MALDI-TOFMS測(cè)定其中可能參與棉酚降解的20種蛋白質(zhì)。

目前微生物降解棉酚的研究大多集中在降解菌的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化，對(duì)于菌體利用棉酚為唯一碳源的生長(zhǎng)和降解過程關(guān)注較少，而該部分研究對(duì)于闡明棉酚的微生物降解途徑及生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。本研究從山東棉花種植地及棉籽榨油廠附近采集土壤樣品，篩選出一株可高效降解棉酚的菌株，研究該菌在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)降解特性，根據(jù)底物譜分析初步推斷棉酚的開環(huán)途徑，旨在為棉粕的微生物脫毒產(chǎn)業(yè)化提供更多的微生物降解菌種資源，也為深入研究棉酚降解機(jī)理提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉籽粕 來自新疆棉粕加工廠；土樣 山東濱州薊縣棉花種植地及棉籽榨油廠（土樣取自土表層3 cm 以下）；醋酸棉酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4；篩選培養(yǎng)基：醋酸棉酚5.0 g，（NH）SO2.0 g，MgSO·7HO 0.2 g，KHPO0.5 g，CaCl·2HO 0.1 g，KHPO0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4；無機(jī)鹽培養(yǎng)基（Mineral salts medium，MM）（1000 mL）：（NH）SO2.0 g，NaHPO·12HO 14.3 g，KHPO3 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.3 mg，儲(chǔ)存緩沖液（500×）2 mL；儲(chǔ) 存 緩 沖 液：MnSO·HO 0.07 g，MgSO·7HO 0.015 g，CuSO0.0125 g，ZnSO0.0125 g，HBO0.0125 g，溶于蒸餾水，定容至500 mL，過濾除菌。

T-GRADIENT PCR 儀 德國Biometra 公司；SPX-3008SH-II 生化培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；ZQLY300F 振蕩培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DYY-6C 電泳儀、DYY-6C 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 北京六一儀器廠；SW-CJ-IBM 超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣有限公司；5417R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；EC20 pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；UV1780 紫外分光光度計(jì)日本島津；Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜 美國安捷倫；LDZM-80L-Ⅲ高壓自動(dòng)滅菌鍋 上海申安；ZF-288 瓊脂糖電泳凝膠成像系統(tǒng) 上海金鵬分析儀器廠；YS100 顯微鏡 日本尼康。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棉酚降解菌株的篩選 來自山東的土壤取10 g樣品分散到90 mL 無菌水中，放入28 ℃恒溫?fù)u床180 r/min 培養(yǎng)，24 h 后將土壤懸液取出，并進(jìn)行梯度稀釋。分別取10和10的梯度稀釋液100 μL，涂布于無機(jī)鹽加棉酚的培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱5 d。挑取不同形態(tài)的單菌落，分別劃線轉(zhuǎn)接到以棉酚為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，獲得可以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的純培養(yǎng)物。同時(shí)利用添加5 g/L 棉酚的篩選培養(yǎng)基加入土壤懸液進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)4～5 周，富集后稀釋涂布平板。從上述平板上挑選長(zhǎng)出的單菌落，接種到添加1 mmol/L棉酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基，鑒定是否可以利用底物棉酚作為碳源生長(zhǎng)。

1.2.2 棉酚降解菌的鑒定 從土樣中篩選到一株以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，并將其命名為 YL01。將YL01 制片，進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

YL01 生理生化鑒定參考文獻(xiàn)[23-24]進(jìn)行。

用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為PCR Buffer （5×）10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，引物27F （5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'） 1 μL，引物1492R （5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3'） 1 μL，Taq 酶(5 U/μL) 0.5 μL，模板4 μL （單菌落加50 μL 無菌水100 ℃煮8 min，離心后取上清為模板），無菌水32.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，測(cè)得的序列登錄NCBI用blastn 進(jìn)行序列比對(duì)，利用Clustal W 和MEGA 7.0 軟件進(jìn)行分析，Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 YL01 抗生素抗性分析 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種到添加不同抗生素（氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸、慶大霉素和鏈霉素的濃度分別為50、34、10、15、20、10、10 μg/mL）的5 mL 1/4 LB 培養(yǎng)基中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三重復(fù)，對(duì)照組為不加抗生素的1/4 LB 培養(yǎng)基。180 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)，分別在第1、2、3 d 觀察其是否生長(zhǎng)，以測(cè)試其對(duì)抗生素的抗性情況。

1.2.4 菌株生長(zhǎng)曲線和對(duì)棉酚的降解效果

1.2.4.1 棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 配制摩爾濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mmol/L 的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶劑為0.2%磷酸-乙腈（15:85 V/V）溶液，每個(gè)濃度設(shè)置三重復(fù)，經(jīng)HPLC 測(cè)定計(jì)算峰面積。色譜條件如下，色譜柱：Thermo Fisher Accucore C柱，流動(dòng)相：0.2%磷酸-乙腈（20:80 V/V），流速：0.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm，進(jìn)樣量：5 μL，柱溫：25 ℃。以棉酚標(biāo)準(zhǔn)液的摩爾濃度（mmol/L）為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程為：y=（2×10）x-0.004，=0.999。

1.2.4.2 菌體生物量和棉酚降解率的測(cè)定 在以0.65 mmol/L 濃度的醋酸棉酚為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，接種YL01 單菌落，180 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置不接菌的空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與空白組均設(shè)置三重復(fù)。通過平板稀釋計(jì)數(shù)法檢測(cè)其10 d 內(nèi)的生長(zhǎng)情況。在第3、15、24、36、48、72、96、132、168、204、240 h 取100 μL 菌液，稀釋后取50 μL 涂布于1/4 LB 平板（稀釋倍數(shù)為10～10，以長(zhǎng)出的單菌落數(shù)量在30～300 之間為宜），每個(gè)稀釋度設(shè)置三重復(fù)，置于28 ℃培養(yǎng)，1 d 后計(jì)菌落數(shù)，按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

同時(shí)取1 mL 菌液加入等體積的乙酸乙酯，渦旋充分萃取，靜置分層后取上清液，重復(fù)兩次后合并上清液，取1 mL 用氮?dú)獯蹈?，?.2%磷酸-乙腈（15:85 V/V）溶液重新溶解后，經(jīng)HPLC 測(cè)定，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算棉酚含量。根據(jù)下式計(jì)算降解率。

式（2）中：c為最后一天實(shí)驗(yàn)組棉酚含量，mmol/L；c為第0 d 實(shí)驗(yàn)組的棉酚含量，mmol/L。

1.2.5 YL01 底物譜分析 將新活化的單菌落，接種到添加2 mmol/L 不同底物（萘、聯(lián)苯、水楊酸、鄰苯二酚、原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)苯醌）的MM 培養(yǎng)基中，通過測(cè)定OD觀察其是否生長(zhǎng)。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源實(shí)驗(yàn) 為將來大規(guī)模培養(yǎng)菌株sp. YL01，考慮使用廉價(jià)的原料，降低生產(chǎn)成本，確定玉米漿為氮源，探索YL01 的最佳碳源及碳源濃度條件。固定氮源為濃度40 g/L 的玉米漿，設(shè)置5 mmol/L 和10 mmol/L 濃度梯度的甘油、淀粉和葡萄糖為碳源，每組三重復(fù)，保持其余組分添加濃度與種子培養(yǎng)基濃度相同。分別接種，于28 ℃ 200 r/min 搖床過夜培養(yǎng)，除去過夜時(shí)間，每隔3 h 取樣測(cè)定吸光度OD，探究菌株在組分優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。

1.2.7 固態(tài)發(fā)酵過程中蛋白含量以及棉酚降解效率測(cè)定

1.2.7.1 Bradford 法制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制1 mg/mL 牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 和0 mL 的雙蒸水，混勻后準(zhǔn)確吸取40 μL 于離心管中，加入考馬斯亮藍(lán)試劑2 mL，混勻后遮光反應(yīng)5 min，以雙蒸水為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程為：y=0.565x+0.108，=0.971。

1.2.7.2 固態(tài)發(fā)酵 稱量0.1156 g 醋酸棉酚，溶解到5 mL 丙酮中，在100 g 滅菌棉粕（精確至0.001 g）中逐滴加入棉酚溶液，拌勻后取12 g 棉粕接種YL01 菌液10 mL（接種量為7×10CFU），同時(shí)設(shè)置不加菌的空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與空白組均設(shè)置三重復(fù)。放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.7.3 棉粕中棉酚含量的測(cè)定 從第0 d 開始，每48 h 取1 g 樣品加入14 mL 丙酮后進(jìn)行渦旋，超聲輔助萃取，靜置取上清1 mL 氮吹至干，用0.2%磷酸-乙腈（15:85 V/V）溶液溶解后，經(jīng)HPLC 測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算棉酚含量。

1.2.7.4 棉粕粗蛋白的提取 準(zhǔn)確稱取1 g 棉柏樣品，粉碎過80 目篩，按1:15（W/V）的料液比加水渦旋5 min，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)體系pH 至11.5，50 ℃浸提2 h，6000 r/min 離心10 min，分離得上清液，再往殘?jiān)屑?0 mL 水渦旋2 min，50 ℃浸提過夜，6000 r/min 離心10 min，分離得上清液，合并兩次提取液。

1.2.7.5 棉粕蛋白含量的測(cè)定 取40 μL 棉粕蛋白提取液，加水稀釋至2 mL，再取40 μL 稀釋液和2 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑混合，遮光反應(yīng)5 min 后在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)吸光值。平行重復(fù)三次，以40 μL 水和2 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑混勻后調(diào)零。將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 棉酚降解菌株的篩選

從土樣中篩選到一株以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，并將其命名為YL01。菌株YL01 在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上菌落濕潤(rùn)、粘稠、邊緣整齊，如圖1。在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)球形。

圖1 YL01 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of bacterium YL01

2.2 棉酚降解菌的鑒定

2.2.1 菌株YL01 革蘭氏染色鑒定 對(duì)棉酚降解菌YL01 進(jìn)行革蘭氏染色，呈現(xiàn)紅色，因此鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌（G），如圖2。

圖2 YL01 革蘭氏染色鑒定Fig.2 Gram staining identification of bacterium YL01

2.2.2 YL01 生理生化特征 YL01 能在5、10、41 ℃生長(zhǎng)，不能在50 ℃生長(zhǎng)，能水解尿素，不能產(chǎn)吲哚，也不能使L-鳥氨酸脫羧（見表1），這些特征與相同。但是YL01 能利用L-阿拉伯糖、淀粉和葡萄糖生長(zhǎng)，而.不能；YL01 能在5 ℃生長(zhǎng)，能利用L-鼠李糖、D-果糖、淀粉和葡萄酸鈣，而1GBT 不能；YL01 不能利用松三糖，而1GBT、可以。YL01 能在41 ℃生長(zhǎng)、能水解尿素、能利用淀粉、葡萄糖、葡萄酸鈣和檸檬酸鈉生長(zhǎng)，而不能；YL01 不能產(chǎn)吲哚，也不能使L-鳥氨酸脫羧，而可以。經(jīng)過全基因組測(cè)序，YL01 的DNA 的GC 含量為55.64%，與.NBRC 14939 的55.4% GC 含量相接近。結(jié)果表明，YL01 的生理生化性質(zhì)與和較為接近。

表1 YL01 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of YL01

2.2.3 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將測(cè)得的16S rRNA 序列與NCBI GenBank 中所有已測(cè)定的原核生物的16S rRNA 序列進(jìn)行比對(duì)，與IL11 的一致性達(dá)到99%以上。使用MEGA7.0 軟件處理所得數(shù)據(jù)，得到了YL01及相關(guān)菌株的進(jìn)化距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。初步鑒定YL01 為拉烏爾菌屬（sp.）。

圖3 菌株YL01 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strainYL01

2.3 YL01 抗生素抗性分析

在1/4 LB 培養(yǎng)基中添加不同的抗生素，通過測(cè)定OD觀察YL01 生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示菌株可以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表明其具有氨芐青霉素的抗性，而對(duì)氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸、慶大霉素、鏈霉素均無抗性（表2）。因此YL01在環(huán)境中釋放較為安全，具有較好的應(yīng)用前景。

表2 YL01 在含有不同抗生素的1/4 LB 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of YL01 in 1/4 LB medium containing different antibiotics

2.4 YL01 生長(zhǎng)曲線和對(duì)棉酚的降解效果

在以棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中，YL01 從24 h開始進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，第168 h 生物量達(dá)到最大值并進(jìn)入穩(wěn)定期（圖4）。第10 d 棉酚降解率為48%。由于底物棉酚難溶于水，當(dāng)用丙酮溶解后加入液體培養(yǎng)基會(huì)形成渾濁的懸濁液，無法使用分光光度計(jì)測(cè)定OD了解菌體生長(zhǎng)情況，因此采用平板稀釋涂布計(jì)數(shù)法來監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)，菌落總數(shù)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)存在一定計(jì)數(shù)誤差。

圖4 YL01 的生長(zhǎng)曲線和底物棉酚濃度隨時(shí)間的變化Fig.4 The growth curve of YL01 and the change of substrate gossypol concentration with time

2.5 YL01 底物譜分析

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加不同的底物（濃度均為2 mmol/L），觀察YL01 7 d 內(nèi)的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示其除了可以利用棉酚外，還能利用鄰苯二酚、原兒茶酸和對(duì)苯醌作為唯一碳源生長(zhǎng)，不能利用萘和聯(lián)苯作為唯一碳源生長(zhǎng)（表3）。說明菌株YL01 可能以鄰苯二酚或原兒茶酸開環(huán)途徑代謝棉酚，可能存在多條與芳香族化合物代謝相關(guān)的基因簇，但是降解途徑不經(jīng)過萘和聯(lián)苯，具體開環(huán)方式仍需進(jìn)一步研究。

表3 YL01 在不同底物中的生長(zhǎng)情況Table 3 The growth of YL01 in different substrates

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源實(shí)驗(yàn)

在不同碳源（甘油、淀粉、葡萄糖）組成的培養(yǎng)基中，YL01 均在第9 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（圖5），在第27 h 生物量達(dá)到最大值，其在10 mmol/L 葡萄糖中OD最高，可以達(dá)到11.5。但是考慮到原料價(jià)格成本因素，確定5 mmol/L 淀粉為最適碳源培養(yǎng)YL01用于后續(xù)固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖5 YL01 在不同碳源中的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of YL01 in different carbon sources

2.7 固態(tài)發(fā)酵效率及蛋白含量變化

對(duì)棉粕固態(tài)發(fā)酵不僅能降低棉酚含量，還可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善飼料適口性，同時(shí)檢驗(yàn)YL01的實(shí)際脫毒效果。與空白對(duì)照組相比，8 d 內(nèi)棉酚含量極顯著降低（＜0.01），降解率為43%（圖6），同時(shí)蛋白含量增加了10%（圖7）。隨著時(shí)間延長(zhǎng)棉粕中水分蒸發(fā)會(huì)使其質(zhì)量減少，帶來棉酚含量的上升，考慮到這一點(diǎn)，實(shí)際降解率應(yīng)高于測(cè)定值。蛋白含量的增加是由于在發(fā)酵的過程中，菌株分泌的各種酶。由于菌體接種量較小，僅為5.83×10CFU/g，通過加大接種量可以提高固態(tài)發(fā)酵過程中對(duì)棉酚的降解率。為了排除棉粕中土著菌株和高溫高壓對(duì)棉酚含量的影響，本實(shí)驗(yàn)將棉粕滅菌后額外加入棉酚，在部分已發(fā)表的文獻(xiàn)中，固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并沒有這一步操作，其真實(shí)降解效率值得商榷。

圖6 棉粕中棉酚含量隨時(shí)間的變化Fig.6 Changes of gossypol content in cottonseed meal with time

圖7 棉粕中蛋白含量隨時(shí)間的變化Fig.7 Changes of protein content in cottonseed meal with time

3 結(jié)論

從土壤中篩選分離到一株以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，經(jīng)16S rRNA 基因測(cè)序和生理生化鑒定，鑒定其為sp.。YL01 在以棉酚為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 d，棉酚的降解率為48%；接種該菌株到棉粕中，固態(tài)發(fā)酵8 d 后棉酚的降解率達(dá)43%，蛋白含量增加10%。YL01 與其他拉烏爾菌屬的種在進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是否是一個(gè)新種，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。本研究在以棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中測(cè)定菌株的生長(zhǎng)和對(duì)棉酚的降解，還同時(shí)測(cè)定了液體培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵條件下的棉酚降解效率，二者互相印證了該菌對(duì)棉酚的降解能力。本研究提供了更多降解棉酚的微生物菌種資源，對(duì)運(yùn)用生物技術(shù)消除棉粕中棉酚具有潛在的應(yīng)用前景，也為進(jìn)一步開展棉酚的微生物降解機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。