孕酮和骨化三醇通過(guò)miR-590-5p靶向RelA調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的細(xì)胞因子分泌

趙麗潔 趙 慧 郭 丹 林麗紅 （安陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安陽(yáng) 455000）

細(xì)胞因子/趨化因子是癌癥相關(guān)炎癥的關(guān)鍵因素，越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子是其轉(zhuǎn)移介質(zhì)［1］。NF-κB 是一種強(qiáng)大的促炎調(diào)節(jié)劑，在腫瘤中被組成激活，并將炎癥和致癌作用聯(lián)系起來(lái)［2］。NF-κB 控制多種功能400 余個(gè)基因的表達(dá)，這些功能包括炎癥、生長(zhǎng)、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。其通常在細(xì)胞中處于靜止?fàn)顟B(tài)，并且僅在響應(yīng)壓力信號(hào)（例如促炎性細(xì)胞因子）時(shí)被激活［2］。NF-κB 由一系 列亞 基組 成，包括RelA、RelB、c-Rel、p50、p52［2］。子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤［3］。炎癥過(guò)程伴隨著月經(jīng)周期內(nèi)膜的正常生長(zhǎng)，脫落和修復(fù)，這由性激素控制，也可能由炎癥介質(zhì)自身控制［4］。此外，慢性炎癥可能通過(guò)內(nèi)在（促進(jìn)腫瘤）及外在（引發(fā)腫瘤）癌癥途徑在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。已有研究表明孕酮和骨化三醇抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞因子分泌［6-7］。但孕酮和骨化三醇抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞因子分泌的分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 為研究對(duì)象，旨在探討孕酮和骨化三醇處理Ishikawa細(xì)胞減少細(xì)胞因子分泌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（Ishikawa）購(gòu)自廣州速研生物科技有限公司（貨號(hào)：Ishikawa）。RelA、RelB、c-Rel、p50、p52、GAPDH 抗體購(gòu)自Abcam 公司（貨 號(hào)：ab16502、ab33907、ab133251、ab133492、ab264236、ab8245）。胎牛血清購(gòu)自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司（貨號(hào)：HQ30071）。孕酮購(gòu)自上海賢鼎生物科技有限公司（貨號(hào)：PG427-25g）。第一鏈cDNA 合成試劑盒購(gòu)自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司（貨號(hào)：C1802）。骨化三醇購(gòu)自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司（貨號(hào)：C3078-1MG）。青鏈霉素混合液（100×）購(gòu)自上海億言生物科技有限公司（貨號(hào)：SL6040-100ml）。hsa-miR-584-3p、hsa-miR-1251-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-4455、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-7977、hsa-miR-4468、hsa-miR-5093、hsa-miR-939-3p、hsa-miR-610、hsa-miR-7850-5p、hsa-miR-6134、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-493-3p的mimics 和qPCR 引物均由北京擎科合成。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司（貨號(hào)：M052460-500T）。siRelA 由吉?jiǎng)P基因合成。轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州一科生物科技有限公司（貨號(hào)：BB-4601-2）。RelA 基因從Ishikawa cDNA 中擴(kuò)增并插入pCDNA3.1，記為pCDNA3.1-RelA。pEZX-MT01購(gòu)自BioVector 質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心（貨號(hào)：pEZX-MT01）。RT2 First Strand 試劑盒購(gòu)自昆明皇寶商貿(mào)有限公司（貨號(hào)：330404）。熒光素酶標(biāo)記試劑盒購(gòu)自廣州一科生物科技有限公司（貨號(hào)：A1001-8）。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自廣州泰勒生物科技有限公司（貨號(hào)：SH30023.01）。Trizol購(gòu)自派瑞金（北京）生物科技有限公司（貨號(hào)：T8361）。CXCL1 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海群己生物科技有限公司（貨號(hào)：KA3337）。CXCL2 ELISA 試劑盒購(gòu)自廣州徠智生物科技有限公司（貨號(hào)：BS-E6201H1）。TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自廣州一科生物科技有限公司（貨號(hào)：EK0584）。IL-1β ELISA 試劑盒購(gòu)自北京萊科百奧生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：JL29721）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Ishikawa 細(xì)胞于含10%FBS 及1%P/S 的DMEM/F12 培 養(yǎng) 基 中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。分別用25 μmol/L 孕酮、100 μmol/L 骨化三醇處理Ishikawa細(xì)胞72 h，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。hsamiR-584-3p、hsa-miR-1251-3p、hsa-miR-590-5p、hsamiR-4455、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-7977、hsa-miR-4468、hsa-miR-5093、hsa-miR-939-3p、hsa-miR-610、hsa-miR-7850-5p、hsa-miR-6134、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-493-3p 的mimics、miR-590-5p inhibitor、siRelA及pCDNA3.1-RelA 與轉(zhuǎn)染試劑以1∶3 比例混合，室溫靜置15 min，緩慢滴入Ishikawa細(xì)胞。

1.2.2 RNA 抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR RNA 提取試劑盒從對(duì)照，分離Ishikawa 細(xì)胞總RNA。DNase處理后，通過(guò)RT2 First Strand 試劑盒按說(shuō)明合成cDNA。按說(shuō)明應(yīng)用7500RT-PCR 系統(tǒng)（AB Applied Biosciences）定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR（RT-PCR）。采用2-ΔΔCt法確定相對(duì)基因表達(dá)。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pEZX-MT01 包含RelA 野生型或突變型3'UTR。采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析熒光素酶活性前，分別將miR-590-5p 及陰性對(duì)照（NC）與熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞（1×104個(gè)）48 h。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 25 μmol/L 孕酮及100 μmol/L骨化三醇分別處理Ishikawa細(xì)胞72 h，測(cè)定CXCL1、CXCL2、TNF-α、IL-1β 分泌水平。收獲Ishikawa 細(xì)胞上清。通過(guò)BCA 蛋白測(cè)定上清液總蛋白濃度，應(yīng)用相應(yīng)ELISA 試劑盒一式兩份定量靶蛋白表達(dá)。

1.2.5 免疫印跡 應(yīng)用針對(duì)NF-κB 亞基RelA、RelB、c-Rel、p50、p52 的抗體分析孕酮、骨化三醇處理以及未處理的Ishikawa 細(xì)胞提取物。對(duì)等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，分析細(xì)胞內(nèi)GAPDH 為上樣對(duì)照。按照制造商（Pierce）建議，增強(qiáng)后化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)用于可視化蛋白質(zhì)條帶。采用Image J 軟件對(duì)免疫印跡條帶結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.2.6 RNA-Seq 通過(guò)Trizol法抽取孕酮和骨化三醇處理后Ishikawa 細(xì)胞總RNA、未處理的Ishikawa細(xì)胞總RNA。樣品送至北京基因組研究所（中國(guó)深圳）進(jìn)行商業(yè)性RNA-Seq 服務(wù)和數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用SOAPaligner/SOAP2 不匹配，將明確讀段映射到human 數(shù)據(jù)庫(kù)。計(jì)算每個(gè)基因純凈讀數(shù)數(shù)，將其標(biāo)準(zhǔn)化為每百萬(wàn)分之一讀數(shù)（TKM），該讀數(shù)將讀數(shù)數(shù)與基因表達(dá)相關(guān)。利用log2 比率確定基因調(diào)控，選擇log2 比率為-1或log2比率為1的差異基因進(jìn)一步分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 處理。數(shù)據(jù)以表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕酮和骨化三醇抑制Ishikawa 細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 分泌 孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細(xì)胞后，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 分泌水平明顯下降（P＜0.05，圖1A～D），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 的mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖1E）。

圖1 孕酮和骨化三醇抑制Ishikawa 細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2分泌Fig.1 Progesterone and calcitriol inhibit secretion of cytokines IL-1β，TNF-α，CXCL1 and CXCL2 in Ishikawa cells

2.2 孕酮和骨化三醇在mRNA 水平下調(diào)NF-κB 亞基RelA 表達(dá) 孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa細(xì)胞后，免疫印跡發(fā)現(xiàn)NF-κB 亞基RelA 表達(dá)下調(diào)，NF-κB 亞基RelB、c-Rel、p50、p52 表達(dá)無(wú)明顯改變（圖2A、B）。定量結(jié)果見圖2C。轉(zhuǎn)染RelA promoter-luciferase 質(zhì)粒后，應(yīng)用孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其熒光素酶報(bào)告活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3A），實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)NF-κB 亞基RelA mRNA 水平降低（P＜0.05，圖3B）。

圖2 孕酮和骨化三醇處理后NF-κB亞基表達(dá)Fig.2 Expression level of NF-κB subunit after progesterone and calcitriol treatment

圖3 孕酮和骨化三醇處理后NF-κB 亞基RelA 轉(zhuǎn)錄水平及啟動(dòng)子活性Fig.3 Transcription level and promoter activity of NF-κB subunit RelA after treatment with progesterone and calcitriol

2.3 miR-590-5p靶向NF-κB亞基RelA的-3'端非編碼區(qū) 使用孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細(xì)胞后，通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)孕酮處理后有110 種mi-RNAs表達(dá)上調(diào)，而骨化三醇處理后有57種miRNAs表達(dá)上調(diào)（圖4）。兩組均上調(diào)者有14種miRNAs，分別 是hsa-miR-584-3p、hsa-miR-1251-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-4455、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-7977、hsa-miR-4468、hsa-miR-5093、hsa-miR-939-3p、hsa-miR-610、hsa-miR-7850-5p、hsa-miR-6134、hsamiR-4789-5p、hsa-miR-493-3p（圖5）。通過(guò)miRNA mimics 表達(dá)上述miRNA 后，發(fā)現(xiàn)miR-590-5p 可降低NF-κB 亞基RelA mRNA 水平（P＜0.05，圖6A）。通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-590-5p 靶向NF-κB亞基RelA-3'端非編碼區(qū)（P＜0.05，圖6B）。同時(shí)，通過(guò)miR-590-5p mimic 過(guò)表達(dá)miR-590-5p 后，NF-κB亞基RelA蛋白水平降低。通過(guò)miR-590-5p inhibitor敲低miR-590-5p 后，NF-κB 亞基RelA 蛋白水平升高（圖6C、D）。定量結(jié)果見圖6E。

圖4 孕酮和骨化三醇處理后Ishikawa細(xì)胞的高通量測(cè)序Fig.4 High-throughput sequencing of Ishikawa cells treated with progesterone and calcitriol

圖5 孕酮和骨化三醇處理Ishikawa細(xì)胞的高通量測(cè)序結(jié)果交集Fig.5 Intersection of high-throughput sequencing results of progesterone and calcitriol treated Ishikawa cells

圖6 miR-590-5p靶向NF-κB亞基RelA的-3'端非編碼區(qū)Fig.6 miR-590-5p targets 3' terminal non-coding region of NF-κB subunit RelA

2.4 miR-590-5p靶向NF-κB信號(hào)通路調(diào)控Ishikawa細(xì)胞細(xì)胞因子分泌 miR-590-5p mimic 過(guò)表達(dá)miR-590-5p后，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。miR-590-5p inhibitor 敲低miR-590-5p 后，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。但同時(shí)過(guò)表達(dá)或 敲 低miR-590-5p 和RelA 時(shí)，細(xì) 胞 因 子IL-1β、TNF-α、CXCL1 和CXCL2 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05，圖7）。

圖7 miR-590-5p 靶向NF-κB 信號(hào)通路調(diào)控Ishikawa 細(xì)胞細(xì)胞因子分泌Fig.7 miR-590-5p targets NF-κB signaling pathway to regulate secretion of cytokines in Ishikawa cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)孕酮和骨化三醇降低Ishikawa 細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 的表達(dá)和分泌。越來(lái)越多的證據(jù)支持炎癥能夠加速多種癌癥發(fā)展和進(jìn)展［8］。子宮內(nèi)膜癌是由炎癥驅(qū)動(dòng)的疾病，涉及復(fù)雜細(xì)胞因子和趨化因子網(wǎng)絡(luò)激活［9］。最近的研究表明骨化三醇和孕酮具有抗腫瘤作用［10］，可能是得益于其抑制細(xì)胞因子表達(dá)和分泌。

臨床、流行病學(xué)和基礎(chǔ)科學(xué)證據(jù)表明，骨化三醇可能是高效的卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌預(yù)防劑，可直接調(diào)節(jié)許多細(xì)胞中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NF-κB 活性［11-12］。亦可抑制乳腺和前列腺細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)，降低血管生成及促炎性細(xì)胞因子IL-8 的水平［13］。孕酮是女性生殖道一種強(qiáng)大的抗炎和抗增殖激素［14］。在分化較差的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Hec50c中，孕酮顯示 可 以抑制NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性［15］。但GEISERT 等［16］發(fā)現(xiàn)孕酮可以激活子宮上皮NF-κB轉(zhuǎn)錄活性并增加細(xì)胞因子表達(dá)。提示孕酮與NF-κB轉(zhuǎn)錄活性具有較高相關(guān)性?；诖?，本研究使用骨化三醇和孕酮處理后，檢測(cè)NF-κB 各個(gè)亞基表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NF-κB 亞 基RelA 表達(dá) 下 調(diào)，而NF-κB 亞 基RelB、c-Rel、p50、p52 表達(dá)無(wú)明顯改變。因此，孕酮和骨化三醇的作用靶點(diǎn)可能是RelA。孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細(xì)胞，RelA 啟動(dòng)子活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但RelA mRNA水平降低（P＜0.05）。提示孕酮和骨化三醇在mRNA 水平降低RelA 表達(dá)。miRNA 是一個(gè)小型非編碼RNA 分子，包含約22 個(gè)核苷酸，在RNA 沉默和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起作用［17］。憑借這些特性，miRNA 可以調(diào)節(jié)參與癌癥發(fā)展的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，例如細(xì)胞增殖、凋亡和遷移［18］。通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa細(xì)胞后，有110種miRNAs表達(dá)上調(diào)，骨化三醇處理后有57 種miRNAs 表達(dá)上調(diào)，其中均上調(diào)的有14種miRNAs。在這些miRNAs中僅有miR-590-5p 可降低NF-κB 亞基RelA mRNA水平（P＜0.05）。但其他被孕酮和骨化三醇調(diào)節(jié)的miRNA 是否在抗腫瘤中發(fā)揮其他功能值得進(jìn)一步探索。雖然本研究和GEISERT 等［16］的研究對(duì)象都是子宮細(xì)胞，但GEISERT 等人應(yīng)用的模式生物是豬，人和豬的NF-κB 并非完全同源，兩個(gè)物種蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不相同，且豬無(wú)miR-590-5p 表達(dá)，因此孕酮可能導(dǎo)致人和豬產(chǎn)生不同的NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性。

最近miRNA 被引入，有希望成為癌癥治療靶標(biāo)。miRNA 有抑制腫瘤的調(diào)節(jié)潛力，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)整個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，這使其成為開發(fā)癌癥治療劑的選擇之一［19］。miR-590-5p 可消除細(xì)胞因子，有望成為治療子宮內(nèi)膜癌的新miRNA工具。

綜上所述，孕酮和骨化三醇處理Ishikawa 細(xì)胞后miR-590-5p 表達(dá)上升，miR-590-5p 靶向NF-κB 亞基RelA 的-3'端非編碼區(qū)，降低RelA 蛋白水平，降低NF-κB 復(fù)合體活性，最終下調(diào)細(xì)胞因子IL-1β、TNFα、CXCL1、CXCL2的表達(dá)。