芽孢桿菌加強菌對醬香型白酒酒醅微生物群落及蛋白酶活力的影響

聶士昊，張志偉，汪俊卿，王瑞明，張子洋，申作樹，王龍祥，李丕武

（1.齊魯工業(yè)大學 生物工程學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250300；2.山東福瑞王酒業(yè)有限公司，山東 臨沂 276600）

醬香型白酒在我國已有上千年歷史，因其香味獨特、應(yīng)用廣泛、獨具魅力而受到大眾喜愛，同時其產(chǎn)香機理及風味成分復雜，使得眾多研究者致力于醬香風味成分的研究[1-4]。醬香型白酒具有“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長、貯存周期長”四高兩長的工藝特點[5]。以耐熱真菌、細菌為主的發(fā)酵菌群形成了醬香型白酒獨特的風味，其酒體具有“醬香突出，幽雅細膩，酒體醇厚，空杯留香持久”的風味特征，深受消費者青睞[6]。

微生物及其酶系的作用關(guān)系是影響香型白酒風味特征形成的重要因素。這些微生物產(chǎn)酶及代謝活動相互作用，最終形成了白酒特殊風味物質(zhì)。釀酒微生物研究水平直接影響白酒生產(chǎn)技術(shù)水平，進而影響白酒的質(zhì)量、微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其是風味微生物菌群結(jié)構(gòu)，對于白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量起著決定性的作用。醬香型白酒特殊的酒體風格就在于其獨特釀造工藝所形成的特殊微生物區(qū)系[7]。酸性蛋白酶首先能夠促進微生物生長；其次能夠提高原材料的利用率；還能夠提供生香前體物質(zhì)和風味物質(zhì)。目前，已有關(guān)于產(chǎn)醬香微生物的研究報道，結(jié)果表明，芽孢桿菌與產(chǎn)醬香風味關(guān)聯(lián)度比較大[8-9]，這些微生物的代謝活動與發(fā)酵過程中物理化學反應(yīng)的相互重迭作用，最終形成了醬香型白酒中一系列特殊的風味物質(zhì)[10]。王鵬[11]將地衣芽孢桿菌強化后的大曲應(yīng)用到窖池中，改變了酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，顯著提高了酒醅中芳香族化合物的含量。黃曉寧等[12]將優(yōu)選得到的具有產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）B.L-1和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B.S-1分別應(yīng)用于清香型白酒釀造過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過強化發(fā)酵后均出現(xiàn)了差異代謝物，且4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和四甲基吡嗪含量均顯著增加。胡寶東等[13]從醬香型大曲中分離出了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）（現(xiàn)已歸屬于貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）），因其能產(chǎn)高活性的中性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶等，對提高醬香型大曲的品質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。芽孢桿菌的種類和數(shù)量將直接決定曲的優(yōu)劣，在白酒發(fā)酵中起著增香、特別是改善白酒后味的重要作用，進而影響酒醅發(fā)酵程度和酒的風格特征。關(guān)于堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過程酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)研究有利于進一步認識醬香型白酒發(fā)酵機理及生產(chǎn)特性[14]。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，又稱第二代測序技術(shù)，可以對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行深入、細致、全面的分析，因此也有人把它稱為深度測序[15]。目前，高通量測序技術(shù)在各個分子生物學領(lǐng)域已經(jīng)有很廣泛的應(yīng)用[16]，如人體微生物、水中微生物、土壤微生物等領(lǐng)域[17-18]。高通量測序技術(shù)用于環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)研究具有明顯的先進性和優(yōu)勢，它能夠快捷方便地讀取樣品中復雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)，有利于對樣品中微生物群落多樣性進行全面、系統(tǒng)的分析，具有高通量、速度快、準確定量、實時檢測等優(yōu)點[19-20]。通過高通量測序技術(shù)，能夠從種的水平上鑒定出樣品中微生物菌種的組成，并能體現(xiàn)出生產(chǎn)工藝對菌屬數(shù)量變化的影響，為更好地研究醬香型白酒微生物的功能、對醬香風味的貢獻提供技術(shù)支持[21]。

為改善白酒酒醅的菌系組成，本研究將芽孢桿菌加強菌接種至白酒酒醅中，通過高通量測序技術(shù)考察其對酒醅微生物Alpha多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響，通過解析第五輪次出池酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律提高酒醅蛋白酶活力，以期達到提高醬香型白酒品質(zhì)及產(chǎn)率的目的，進一步為芽孢桿菌加強菌在釀造醬香型白酒中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

第五輪次出池酒醅樣品：由山東福瑞王酒業(yè)有限公司和濟南瑞豐生物工程有限公司提供。芽孢桿菌（Bacillus）：從高溫大曲中篩選出的芽孢桿菌。

1.1.2 化學試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：北京百奧萊博科技有限公司；氯化鈉（分析純）：浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；MagPure土壤脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）LQ試劑盒：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；量子比特dsDNA檢測試劑盒：上海典森科技有限公司；Tks Gflex DNA聚合酶：日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biotek SynergyNeo2多功能酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水槽：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；FA2204B歐萊博精密天平：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；580BR10905聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-rad公司；NextSeq 500高通量測序儀：美國illumlina公司；Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計：上海在途生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理[22-23]

福瑞王1號和瑞豐1號酒醅：未加入芽孢桿菌加強菌；福瑞王2號和瑞豐2號酒醅：加入芽孢桿菌加強菌。首先分別取酒醅固體樣品各5 g分別放入4個100 mL的燒杯中，分別向4個燒杯中加入0.9%NaCl溶液各50 mL，并在每個燒杯中加入玻璃珠后放入渦旋振蕩器中攪拌30 min后，放入離心管中在6 000 r/min 條件下冷凍離心8 min，取上清液10 mL于離心管中，備用。

1.3.2 酒醅樣品的DNA提取及擴增子測序

采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測DNA的濃度。以酒醅樣品的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶barcode的特異引物進行PCR擴增，以確保擴增效率和準確性。所有細菌使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[19]擴增V4高變區(qū)。真菌使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[24]擴增高變區(qū)。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并采用上述方法進行二輪PCR擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對PCR擴增產(chǎn)物進行Qubit定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，通過Illumina MiSeq 2500平臺對文庫進行測序。

1.3.3 序列分析

原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式。使用Trimmomatic軟件[25]對原始雙端序列進行去雜，去雜后的雙端序列利用FLASH[26]軟件（1.2.11）進行拼接后進行精準去雜，利用UCHIME檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數(shù)據(jù)進行預處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用Vsearch軟件[27]（2.8.1），根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），參數(shù)為序列相似度≥97%被歸為一個OTU。使用QIIME2（v2020.11）軟件包[28]挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。16S rRNA、18S rRNA使用Silva（version138）數(shù)據(jù)庫比對，物種比對注釋使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）classifier[29]軟件插件的join-pairs、quantity-filter、dereplicatesequences模塊對去除引物的雙端序列進行拼接、質(zhì)控和去冗余，保留置信區(qū)間＞0.7的注釋結(jié)果。引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribed spacer，ITS）使用Unite數(shù)據(jù)庫比對。物種比對注釋使用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）[30]軟件?；谝陨蠙z測結(jié)果計算Alpha多樣性指數(shù)。本研究將在酒醅中存在且平均相對豐度＞1%的細菌和真菌的門、屬定義為優(yōu)勢細菌和真菌的門、屬；在酒醅中存在且平均相對豐度＞30%的細菌和真菌的門、屬定義為第一優(yōu)勢細菌和真菌的門、屬。

1.3.4 酸性蛋白酶活力的測定

酸性蛋白酶活力的測定：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》。蛋白酶活力定義：在一定pH值和溫度條件下，1 mL酶液每分鐘內(nèi)酪蛋白水解所產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅樣品中真菌及細菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果

2.1.1 酒醅樣品中真菌和細菌群落分布豐度

用Chao1算法估計群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1指數(shù)在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)，Chao1指數(shù)越大，說明群落分布豐度越高[31]。酒醅樣品中真菌和細菌群落的Chao1指數(shù)見表1。

表1 酒醅樣品中真菌和細菌群落的Chao1指數(shù)Table 1 Chao1 index of fungal and bacterial communities in fermented grains samples

由表1可知，在群落豐度方面，加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王2號和瑞豐2號）真菌菌群的Chao1值分別為174.6、55，細菌菌群的Chao1指數(shù)分別為200.4、218.9，均高于未加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王1號和瑞豐1號）的真菌、細菌菌群Chao1指數(shù)，說明加入芽孢桿菌能夠提高微生物群落豐度。

2.1.2 酒醅樣品中真菌和細菌群落分布多樣性

Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高[32]。酒醅樣品中真菌和細菌群落的Shannon指數(shù)見表2。

表2 酒醅樣品中真菌和細菌群落的Shannon指數(shù)Table 2 Shannon index of fungal and bacterial communities in fermented grains samples

由表2可知，在群落分布多樣性方面，加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王2號和瑞豐2號）真菌菌群Shannon指數(shù)分別為3.08、0.96，細菌菌群Shannon指數(shù)分別為1.29、2.91，均高于未加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王1號和瑞豐1號）的真菌、細菌菌群Shannon指數(shù)，說明加入芽孢桿菌能夠提高微生物群落分布多樣性。

2.2 不同酒醅樣品微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.1 福瑞王樣品基于門、屬水平真菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計算福瑞王樣本真菌菌群物種的相對豐度，結(jié)果見圖1。

圖1 基于門水平（A）和屬水平（B）福瑞王酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 1 Analysis results of fungal community structure in Furuiwang fermented grains samples based on phylum (A) and genus (B) level

由圖1（A）可知，福瑞王1號共檢出3個優(yōu)勢真菌門，包括子囊菌門（Ascomycota）（82.53%）、擔子菌門（Basidiomy cota）（13%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（1.10%）；福瑞王2號共檢出3個優(yōu)勢真菌門，包括子囊菌門（Ascomycota）（95.54%）、擔子菌門（Basidiomycota）（2%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（1.8%）。在兩個樣品中，第一優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota）。

由圖1（B）可知，福瑞王1號共檢出5個優(yōu)勢真菌屬，包括曲霉屬（Aspergillus）（34%）、伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（12%）、紅曲菌屬（Monascus）（11%）、皮絲孢子菌屬（Cutaneotrichosporon）（9%）、青霉屬（Penicillium）（5%），第一優(yōu)勢真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）；福瑞王2號共檢出5個優(yōu)勢真菌屬，包括接合酵母屬（Zygosaccharomyces）（36%）、曲霉屬（Aspergillus）（18%）、紅曲菌屬（Monascus）（10%）、青霉屬（Penicillium）（10%）、伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（10%），第一優(yōu)勢真菌屬為接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。

2.2.2 福瑞王樣品基于門、屬水平細菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計算福瑞王樣本細菌菌群物種的相對豐度，結(jié)果見圖2。

圖2 基于門水平（A）和屬水平（B）福瑞王酒醅樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 2 Analysis results of bacterial community structure in Furuiwang fermented grains samples based on phylum (A) and genus (B) level

由圖2（A）可知，福瑞王1號共檢出3個優(yōu)勢細菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（62%）、變形菌門（Proreobacteria）（35%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（2%）；福瑞王2號共檢出2個優(yōu)勢細菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（84%）、變形菌門（Proreobacteria）（15%），第一優(yōu)勢細菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）。

由圖2（B）可知，福瑞王1號共檢出2個優(yōu)勢細菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）（58%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（32%）；福瑞王2號共檢出3個優(yōu)勢細菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）（84%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（15%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（1%），第一優(yōu)勢細菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.2.3 瑞豐樣品基于門、屬水平真菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計算瑞豐樣本真菌菌群物種的相對豐度，結(jié)果見圖3。

圖3 基于門水平（A）和屬水平（B）瑞豐酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 3 Analysis results of fungal community structure in Ruifeng fermented grains samples based on phylum (A) and genus (B) levels

由圖3（A）可知，瑞豐1號共檢出2個優(yōu)勢真菌門，包括子囊菌門（Ascomycota）（86.98%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（13%）；瑞豐2號共檢出1個優(yōu)勢真菌門，為子囊菌門（Ascomycota）（99.7%）。在兩個樣品中，第一優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota）。

由圖3（B）可知，瑞豐1號共檢出3個優(yōu)勢真菌屬，包括伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（89%）、曲霉屬（Aspergillus）（7%）、紅曲菌屬（Monascus）（2%）；瑞豐2號共檢出3個優(yōu)勢真菌屬，包括伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（77%）、根酶屬（Rhizopus）（13%）、紅曲菌屬（Monascus）（3%）。在兩個樣品中，第一優(yōu)勢真菌屬均為伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）。

2.2.4 瑞豐樣品基于門、屬水平細菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計算瑞豐樣本細菌菌群物種的相對豐度，結(jié)果見圖4。

圖4 基于門水平（A）和屬水平（B）瑞豐酒醅樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 4 Analysis results of bacterial community structure in Ruifeng fermented grains samples based on phylum (A) and genus level (B)

由圖4（A）可知，瑞豐1號共檢出3個優(yōu)勢細菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（65%）、變形菌門（Proreobacteria）（30%）、放線菌門（Actinobacteria）（3%）；瑞豐2號共檢出2個優(yōu)勢細菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（84%）、變形菌門（Proreobacteria）（15%）。在兩個樣品中，第一優(yōu)勢細菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）。

由圖4（B）可知，瑞豐1號共檢出5個優(yōu)勢細菌屬，包括片球菌屬（Pediococcus）（15%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（6%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（6%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（4%）、魏斯式菌屬（Weissella）（2%）；瑞豐2號共檢出6個優(yōu)勢細菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）（55%）、片球菌屬（Pediococcus）（17%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（9%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（8%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（4%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（2%），第一優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.3 酒醅樣品的酸性蛋白酶活力

福瑞王1號樣品的酸性蛋白酶活力為2.04×104U/mL，福瑞王2號樣品的酸性蛋白酶活力為3.00×104U/mL，蛋白酶活力提高了9.6×103U/mL。瑞豐1號酸性蛋白酶活力為3.22×104U/mL，瑞豐2號樣品酸性蛋白酶活力為3.57×104U/mL，蛋白酶活力提高了3.5×103U/mL。其中，福瑞王2號樣品的酸性蛋白酶活力提高尤為明顯，增加了47.1%。因此，加入芽孢桿菌加強菌可以明顯影響樣品中酸性蛋白酶的活力，可以使樣品中酸性蛋白酶的活力明顯提高。

3 結(jié)論

從高通量測序結(jié)果分析來看，加強菌芽孢桿菌的加入明顯提升了微生物群落的分布豐度和群落分布多樣性，同時促進了微生物的生長，進而能夠更好的提高白酒的風味與品質(zhì)；加入芽孢桿菌加強菌的實驗組樣品的酸性蛋白酶活力均明顯高于未加入芽孢桿菌的空白組樣品，其中，福瑞王樣品的酸性蛋白酶活力提高尤為明顯，增加了47.1%。該研究可為醬香型白酒品質(zhì)和風味的提高鑒定理論研究基礎(chǔ)。