豇豆不同部位多糖結(jié)構(gòu)特征及抗氧化性能比較

辛 玥，宋蕭蕭，王玉簫，聶少平，殷軍藝

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國-加拿大食品學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西省生物活性多糖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)，江西 南昌 330047）

豇豆（）又稱帶豆、飯豆、腰豆和長(zhǎng)豆，是我國主要食用雜豆之一，主要營養(yǎng)成分包括淀粉（50%～65%）、蛋白質(zhì)（18%～35%）、非淀粉多糖（后續(xù)簡(jiǎn)稱多糖）（1.43%～5.37%）、酚類（1.44～5.59 mg/g）等。大量研究表明，豇豆具有抗氧化、降血脂、輔助治療心血管疾病等功能。雖然豇豆的蛋白質(zhì)及酚類的研究相對(duì)較多，但作為豇豆主要活性成分之一的多糖研究報(bào)道相對(duì)較少。

雜豆主要由子葉和種皮構(gòu)成，子葉多糖和種皮多糖在結(jié)構(gòu)和生物活性上存在較大差異。鷹嘴豆種皮多糖主要由甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）和阿拉伯糖（arabinose，Ara）組成，物質(zhì)的量百分比分別為2.16%、2.96%、42.17%、9.87%、23.15%、6.29%和13.38%，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫活性、體外抗氧化等生物活性；而鷹嘴豆子葉多糖主要由Glc（40.0%～45.15%）、Gal（0.6%～0.9%）、Ara（2.6%～3.4%）組成，具有緩解高血壓等作用。上述報(bào)道顯示，鷹嘴豆子葉和種皮多糖在結(jié)構(gòu)和功能活性上存在較大的差異。現(xiàn)有研究也表明，黑豆不同部位來源多糖同樣在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異性，如黑豆種皮多糖為半乳甘露聚糖，分子質(zhì)量為7.55×10Da，可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，子葉多糖則主要由Ara、Rha、Gal、Glc和Man組成，分子質(zhì)量為1.95×10Da，則在抗氧化方面具有較好的作用。

目前，豇豆多糖相關(guān)研究與報(bào)道主要集中于全豆，如Tharanathan發(fā)現(xiàn)豇豆全豆多糖的單糖組成以Ara、Xyl為主，除此之外還含有少量的Rha、Man、Gal、Glc。Wu Guangjie等報(bào)道了豇豆全豆多糖的單糖組成以Gal、Glc為主，且以分子質(zhì)量100 kDa和24 kDa的組分為主。因此，需要進(jìn)一步關(guān)注豇豆不同部位來源多糖結(jié)構(gòu)和生物活性的差異性。

本研究以豇豆為原料，分別對(duì)全豆、子葉、種皮多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征及抗氧化性進(jìn)行比較，相關(guān)結(jié)果將為豇豆副產(chǎn)物的高值化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆（腎形豆），購于陜西省米脂縣。

JK008大孔樹脂 北京科海思科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Fluka公司；牛血清蛋白 美國Amersco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）、抗壞血酸VC、超氧陰離子自由基清除能力檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）法）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ara、Glc、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、Gal、Rha、GalA 美國Sigma公司；葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Xyl、Man 北京百靈威科技有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量8～14 kDa）上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、過硫酸鉀、乙醇、苯酚、咔唑、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS 5000離子色譜儀 美國Thermo Scientific公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；T9雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Labconco 12L冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；EYELA SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；ANKE DL-5C離心機(jī) 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；AL-104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的分離純化

1.3.1.1 多糖提取

采用熱水浸提法提取豇豆多糖。將豇豆全豆、子葉、種皮分別粉碎過篩后，80%乙醇溶液浸泡24 h，揮干乙醇，再以料液比1∶10（g/mL）將醇不溶物于95C水浴中提取4 h，離心（5 000 r/min，10 min）收集濾液，分別加入淀粉酶（95 ℃，90 min）、木瓜蛋白酶（60 ℃，30 min）、糖化酶（pH 4.5，60 ℃，30 min）進(jìn)行酶解，在100 ℃滅酶10 min，離心（8 000 r/min，10 min），上清液于透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da）中透析2 d，然后加入一定體積無水乙醇至溶液中乙醇含量為80%，所得沉淀經(jīng)溶解后再進(jìn)行冷凍干燥，分別得到豇豆全豆粗多糖、子葉粗多糖、種皮粗多糖。

1.3.1.2 多糖的純化

分別用NaOH、NaCl、HCl溶液將樹脂活化，將上一步得到的3 種粗多糖分別配制成60 mg/mL的溶液，離心（8 000 r/min，15 min）后上樣，用去離子水沖洗3 倍柱體積，收集洗脫液濃縮至一定體積，加入無水乙醇至溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，離心后將醇沉沉淀復(fù)溶，復(fù)溶液凍干得到豇豆全豆多糖（polysaccharide，VUP）、子葉多糖（cotyledon polysaccharide，VUCP）、種皮多糖（hull polysaccharide，VUHP）（圖1）。

圖1 豇豆全豆、子葉和種皮來源多糖提取制備流程示意圖Fig. 1 Flow chart for isolation of polysaccharides from whole seed,cotyledon and hull of cowpea

1.3.2 基本結(jié)構(gòu)

1.3.2.1 化學(xué)組成的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖中中性糖含量；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用咔唑-硫酸法測(cè)定多糖中酸性糖含量；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定多糖中蛋白質(zhì)含量；以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林-酚法測(cè)定多糖中總酚含量。

1.3.2.2 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

參考Wang Yuxiao等方法，采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法對(duì)多糖分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：UltrahydrogelLinear色譜柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃；樣品溶液質(zhì)量濃度1 mg/mL；進(jìn)樣20 μL；流動(dòng)相為0.1 mol/L氯化鈉；數(shù)據(jù)采集時(shí)間30 min。通過測(cè)定Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000及Glc保留時(shí)間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.2.3 單糖組成分析

參考Rombouts的方法測(cè)定多糖的單糖組成。稱取2 mg樣品置于安培耐壓管中，在加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸后再進(jìn)行氮吹20 s，繼續(xù)在120 ℃反應(yīng)1 h，再加入0.5 mL甲醇，氮?dú)獯蹈?，重?fù)操作2 次，100 mL容量瓶中定容，稀釋液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，用Dionex ICS 5000型離子色譜儀進(jìn)行分析。

色譜條件：流動(dòng)相A、B、C分別為250 mmol/L NaOH溶液、超純水和1 mol/L NaOAc溶液；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)方式為脈沖安培檢測(cè)，工作電極Au電極，進(jìn)樣量10 μL；色譜柱為CarboPacTM PA20保護(hù)柱（3 mm×30 mm，Dionex，CA）與CarboPacTM PA20分析柱（3 mm×150 mm，Dionex，CA）；洗脫程序見表1。

表1 高效陰離子色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for high performance anion exchange chromatography

1.3.2.4 紅外光譜分析

參考張曼等方法測(cè)定多糖的紅外光譜。取一定量已干燥好的多糖樣品用KBr進(jìn)行壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀在500～4 000 cm進(jìn)行掃描。

1.3.2.5 掃描電鏡分析

將樣品配制為1.0 mg/mL，冷凍干燥后進(jìn)行噴金處理，用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察。

1.3.3 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考常相娜等報(bào)道方法并稍作修改，測(cè)定多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力。將200 μL各濃度梯度的多糖樣品與400 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合后反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。以抗壞血酸（VC）為陽性對(duì)照組。對(duì)照組用400 μL無水乙醇替代DPPH溶液；空白組用200 μL去離子水替代樣品溶液；按式（1）計(jì)算清除率：

式中：為對(duì)照組吸光度；為樣品組吸光度；為空白組吸光度。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力的測(cè)定

參照Ye Zipeng等的方法。25 ℃避光條件下將濃度7.4 mmol/L的ABTS溶液與3.8 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻過夜。取適量過夜后的混合液，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）稀釋，至其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度為0.70±0.02。

將25 μL樣品溶液和250 μL的反應(yīng)溶液混勻，靜置15 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。以VC為陽性對(duì)照組，對(duì)照組用250 μL PBS代替反應(yīng)溶液；空白組用25 μL去離子水代替樣品溶液；按式（1）計(jì)算清除率。

1.3.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)檢測(cè)試劑盒說明書制備工作液。

在避光條件下將25 μL樣品與200 μL工作液混勻后加入96 孔板中，37 ℃反應(yīng)20 min，在波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。以VC為陽性對(duì)照組，對(duì)照組用200 μL PBS代替反應(yīng)溶液；空白組用25 μL去離子水代替樣品溶液；按式（1）計(jì)算清除率。

1.3.3.4 FRAP測(cè)定

依據(jù)FRAP試劑盒說明書配制FRAP工作液并預(yù)熱至37 ℃，將180 μL FRAP工作液與5 μL多糖樣品混合，于37 ℃下反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，以VC為陽性對(duì)照組。以FeSO為參照標(biāo)準(zhǔn)，作濃度變化曲線，在相同條件下測(cè)定一定濃度多糖樣品的FRAP。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖得率、化學(xué)組成及表觀形貌

圖2 VUP（A）、VUCP（B）和VUHP（C）的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscopic images of VUP (A),VUCP (B) and VUHP (C)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，種皮粗多糖較子葉擁有更高的得率和總糖含量（中性糖與酸性糖之和），得率和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.8%、88.2%，而子葉粗多糖得率和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.7%和21.2%，子葉較低的總糖含量可能與其含量較多的蛋白質(zhì)、淀粉、木質(zhì)素等雜質(zhì)有關(guān)。鑒于子葉粗多糖中的雜質(zhì)較多且去除難度大，所以對(duì)豇豆多糖的研究可選擇得率和總糖含量更高的種皮粗多糖。

由表2可知，經(jīng)JK008樹脂純化后的3 種多糖總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于80%，其中VUP、VUCP的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高至87.8%、84.8%，VUHP中總糖含量達(dá)到了97.1%，其酸性糖含量明顯高于其余2 種純化多糖，達(dá)到41.7%。此前Liu Dan等研究發(fā)現(xiàn)，白扁豆皮多糖經(jīng)DEAESepharose Fast Flow凝膠柱純化后的主要組分酸性糖含量同樣較高，可達(dá)43.5%。此外，純化后的3 種多糖中蛋白質(zhì)、淀粉及總酚含量均明顯低于粗多糖，說明JK008陽離子樹脂可以有效的吸附多糖中蛋白質(zhì)、淀粉及酚類物質(zhì)。

單糖組成結(jié)果顯示，VUCP以Ara、Gal、GalA、Glc為主，與VUP單糖組成相類似，VUHP的單糖種類則與VUP、VUCP有一定差異性，即擁有更高含量的Ara、Gala和GalA，同時(shí)未檢出Glc、Rha、GlcA等單糖，結(jié)構(gòu)相對(duì)更簡(jiǎn)單。Wu Guangjie等研究發(fā)現(xiàn)豇豆的單糖組成主要為Gal、Glc和GalA，分別占42.85%、48.97%和5.95%，同時(shí)還含有少量Ara，與本研究一致，但在組成比例上存在差異，這種差異可能是由品種不同及是否純化導(dǎo)致。三者的固體表觀形態(tài)相似（圖2），呈絲狀和片狀相纏繞的狀態(tài)，以片狀為主。

2.2 分子質(zhì)量及分布分析

圖3 VUP、VUCP、VUHP的分子質(zhì)量分布曲線Fig. 3 Molecular mass distribution curves of VUP, VUCP and VUHP

如圖3所示，VUP及VUCP具有較寬范圍的分子質(zhì)量，在12～18 min內(nèi)均出現(xiàn)多個(gè)峰，表明其分子質(zhì)量分布不均一，其中VUP以相對(duì)平均分子質(zhì)量為78.4 kDa與1 336.1 kDa的組分為主，分別占比55.6%和23.4%。此結(jié)果與Wu Guangjie等報(bào)道的100 kDa和24 kDa有較大差異，這種差異可能是豇豆品種及純化方法不同導(dǎo)致。VUCP以分子質(zhì)量為103.2 kDa與490.6 kDa的組分為主，分別占比32.7%和25.8%，而VUHP以59.8 kDa（88.1%）為主，且分子質(zhì)量分布相較其余2 種多糖更加均一。

表2 VUP、VUCP、VUHP的得率及化學(xué)組成Table 2 Yields and chemical composition of VUP, VUCP and VUHP %

2.3 紅外光譜分析

圖4 VUP、VUCP和VUHP紅外光譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of VUP, VUCP and VUHP

如圖4所示，3 種多糖紅外譜圖具有一定的相似性。3 426 cm的吸收峰為糖類O—H的伸縮振動(dòng)，在2 928 cm處的吸收峰為甲基或亞甲基C—H的伸縮振動(dòng)，這兩個(gè)峰是糖類的特征吸收峰。1 626 cm附近的吸收峰可能是羰基C＝O鍵的伸縮振動(dòng)峰，證明VUHP、VUCP、VUP中含有糖醛酸，1 436 cm的吸收峰是由C—H變角振動(dòng)引起，1 084 cm處的吸收峰為吡喃型糖苷的特征吸收峰，由此推測(cè)這3 種多糖均含有-吡喃糖環(huán)。

2.4 抗氧化分析

圖5 VUP、VUCP和VUHP的自由基清除能力測(cè)定Fig. 5 Free radical scavenging capacity of VUP, VUCP and VUHP

如圖5A所示，VUP、VUCP、VUHP均具有清除DPPH自由基能力，VUP對(duì)DPPH自由基清除能力具有顯著的劑量效應(yīng)（＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)68.4%。楊強(qiáng)等研究了豇豆全豆多糖清除DPPH自由基的效果，研究表明當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)65%，與本研究結(jié)果相一致。在相同質(zhì)量濃度下，清除能力由強(qiáng)到弱為VUHP＞VUP＞VUCP，當(dāng)VUHP的質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到94.8%，接近于同質(zhì)量濃度VC。

如圖5B所示，VUHP、VUP、VUCP均具有良好的清除ABTS陽離子自由基的能力，其中VUHP的清除能力最強(qiáng)（＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度不小于1 mg/mL時(shí)其清除能力與同質(zhì)量濃度的VC接近。此前，Jiang Lian等報(bào)道了當(dāng)綠豆皮多糖MBP-2的質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力也接近于同質(zhì)量濃度的VC。VUP與VUCP的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)清除能力達(dá)到最強(qiáng)，分別為83.5%和69.0%，這表明3 種多糖均可以作為有效的ABTS陽離子自由基清除劑。

如圖5C所示，3 種多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力具有顯著的劑量效應(yīng)（＜0.05），清除能力從強(qiáng)到弱為VUHP＞VUP＞VUCP，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，清除率分別達(dá)到56.70%、39.87%、19.08%，但都低于同質(zhì)量濃度陽性對(duì)照組的清除率。

如圖5D所示，在相同質(zhì)量濃度下，VUHP的鐵離子還原能力顯著高于其余2 種多糖（＜0.05），且清除能力具有顯著的劑量效應(yīng)（＜0.05），其FRAP在樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)達(dá)到了3.5 mmol/g，而VUP與VUCP的抗氧化效果并不顯著。3 個(gè)樣品的抗氧化效果均明顯低于陽性對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

對(duì)豇豆及其不同部位的多糖分別進(jìn)行分離純化，并對(duì)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：由單糖組成和分子質(zhì)量分布可知，VUHP與VUCP均為果膠類酸性多糖。結(jié)合粗多糖得率及純度指標(biāo)，顯示豇豆多糖主要富集于種皮。通過對(duì)比3 種多糖純化前后的化學(xué)組成發(fā)現(xiàn)，JK008陽離子樹脂可以有效吸附多糖中的蛋白質(zhì)、淀粉和酚類物質(zhì)，提高總糖含量。

通過對(duì)比3 種純化多糖的抗氧化性發(fā)現(xiàn)：VUP、VUCP與VUHP都具有一定的抗氧化活性，其中VUHP的抗氧化活性明顯高于其余2 種純化多糖。VUHP中總酚含量高于VUP與VUCP，這可能是其抗氧化能力強(qiáng)于其他2 種多糖的一個(gè)原因。除此之外，結(jié)構(gòu)的差異可能是導(dǎo)致抗氧化能力差異的主要原因。如Shang Hongmei等報(bào)道了糖醛酸殘基可以改變多糖綴合物的理化性質(zhì)及溶解度，從而影響多糖的抗氧化活性。Thambiraj等認(rèn)為半乳糖含量越高，其清除能力可能越強(qiáng)。因此，含有較高的半乳糖和酸性糖可能是VUHP抗氧化活性明顯高于VUP、VUCP另外一種因素。此前，Chen Haixia等報(bào)道了多糖的抗氧化活性可能與其單糖組成、分子質(zhì)量等結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，這與本研究結(jié)果相一致，但豇豆多糖抗氧化機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。