甲烷氧化菌素耦合脂肪酶生物傳感器差分脈沖伏安法對(duì)Cu2＋的檢測(cè)

王 艷，趙 寧，王 悅，李虹佳，辛嘉英，孫立瑞，關(guān)樺楠

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

環(huán)境中的銅易在人體中富集，根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，飲用水中Cu質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)為不高于2.0 mg/L，當(dāng)血清中Cu累計(jì)量超過0.035 mmol/L，會(huì)造成銅中毒。現(xiàn)有Cu檢測(cè)方法有光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、離子色譜法、分光光度法等，其中大部分方法存在一些限制性和弊端，如耗時(shí)較長(zhǎng)、靈敏度低、操作繁瑣、儀器昂貴以及依賴實(shí)驗(yàn)室專業(yè)的人員進(jìn)行檢測(cè)等缺點(diǎn)，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)實(shí)際應(yīng)用。電化學(xué)分析法是一種公認(rèn)的快速、靈敏、準(zhǔn)確的痕量元素分析法，操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，是其備受關(guān)注的突出優(yōu)勢(shì)。目前電化學(xué)法對(duì)Cu檢測(cè)靈敏度和選擇性較低，差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法相較于循環(huán)伏安法靈敏度更高，電流響應(yīng)信號(hào)與表面電解的待測(cè)物總量呈比例關(guān)系，可進(jìn)行定量檢測(cè)。

脂肪酶是一種三油酸甘油酯水解酶，天然酶作為綠色環(huán)保的生物催化劑，具有高效性、高選擇性、催化條件溫和以及酶活較高等特點(diǎn)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。納米材料具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和介電限域效應(yīng)等不同于塊體材料和原子或分子的介觀性質(zhì)，并且具有較高的表面自由能，能為生物酶的固載提供更多的活性位點(diǎn)，并且脂肪酶與金納米粒子可通過金硫鍵進(jìn)行鍵合從而對(duì)三油酸甘油酯的電化學(xué)行為產(chǎn)生特有的催化效應(yīng)。采用檸檬酸納法還原氯金酸制備的納米金（gold nanoparticle，AuNPs），用于制備脂肪酶生物傳感器可使傳感器表面積呈指數(shù)增加，從而顯著增加其催化效率。將AuNPs作為固定化酶的載體材料，可以增加固定分子數(shù)量，從而增強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。同時(shí)，AuNPs具有一定的生物相容性，可以增強(qiáng)脂肪酶分子間的穩(wěn)定性。甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是由甲烷氧化菌生長(zhǎng)過程中分泌的一種生物分子，是一種具有極高銅親和力的蛋白活性肽，Mb中游離的巰基與胺基可與AuNPs通過Au—S和Au—N鍵鍵合，并且Mb特異性捕獲環(huán)境中的銅且對(duì)Cu具有較強(qiáng)的專一性。

本實(shí)驗(yàn)通過循環(huán)伏安法對(duì)Mb耦合脂肪酶生物傳感器考察傳感器構(gòu)建的電化學(xué)響應(yīng)情況，采用DPV實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu的特異性定性、定量檢測(cè)研究，其原理如圖1所示。基于層層組裝技術(shù)構(gòu)建Mb耦合脂肪酶生物傳感器（Mb/Lipase@AuNPs-Gold Electrode），脂肪酶催化三油酸甘油酯的水解反應(yīng)為基礎(chǔ)反應(yīng)模型，以三油酸甘油酯為底物分子，生物傳感器可檢測(cè)水解底物時(shí)產(chǎn)生的電流信號(hào)，利用Mb可特異性捕獲Cu的特性，實(shí)現(xiàn)Cu在脂肪酶周圍產(chǎn)生富集現(xiàn)象，從而抑制脂肪酶的催化活性，導(dǎo)致電流強(qiáng)度迅速下降，通過考察加入Cu前后電流信號(hào)差值，實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu的快速定性、定量檢測(cè)。本研究構(gòu)建的脂肪酶生物傳感器可解決現(xiàn)有電化學(xué)檢測(cè)Cu靈敏度和專一性低、檢出限高的問題，為實(shí)現(xiàn)Cu現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)提供新的思路和研究基礎(chǔ)。

圖1 基于Mb耦合脂肪酶生物傳感器電化學(xué)檢測(cè)Cu2＋示意圖Fig. 1 Schematic diagram for electrochemical detection of Cu2+ based on Mb/Lipase@AuNPs-gold electrode

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基彎菌OB3b 俄羅斯科學(xué)院催化研究所；無水乙醇（純度99%） 天津富宇精細(xì)化工有限公司；氯金酸 國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司；脂肪酶 美國(guó)Sigma公司；檸檬酸鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、Tirs-HCl緩沖溶液（純度99%） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；離子溶液（Ca、Mg、Zn、Hg、Pb、Ba、Ni）均為分析純，實(shí)驗(yàn)過程配制試劑全部采用超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計(jì) 賽麗朵思公司；生化發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程公司；CHI660 E電化學(xué)工作站、金盤電極、鉑絲電極、Ag/AgCl電極（3.4 mol/L KCl溶液）上海辰華儀器公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射高分辨透射電鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

1.3.1.1 AuNPs的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備AuNPs，取100 mL質(zhì)量濃度為1×10g/L的氯金酸，加熱至沸騰，隨后加入10 g/L的檸檬酸鈉溶液1.8 mL搖晃振蕩、使之充分混合。溶液從微黃色變?yōu)榫萍t色，通過紫外吸收光譜520 nm處的吸光度，可得到AuNPs的平均粒徑為10 nm。

1.3.1.2 電解液的配制

電解液（5 mmol/L鐵氰化鉀、3 mmol/L亞鐵氰化鉀和0.1 mol/L氯化鉀）用于檢測(cè)酶生物傳感器。

1.3.2 固定化脂肪酶的制備與表征

稱取50 mg脂肪酶于10 mL具塞三角瓶中加入2 mL離子水，充分振蕩至完全溶解，配制成25 mg/mL的酶液，再添加粒徑為10 nm的AuNPs 2 mL，將其混勻后蓋上膠塞并用封口膜密封，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)6 h后，即固定化酶。通過紫外、紅外、熒光光譜以及透射電鏡對(duì)其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，判斷結(jié)合的穩(wěn)定情況。

1.3.3 Mb耦合脂肪酶生物傳感器的構(gòu)建

1.3.3.1 Mb耦合脂肪酶生物傳感器構(gòu)建方法篩選與表征

使用固體三電極體系（工作電極：金電極；參比電極：Ag/AgCl；對(duì)電極：Pt電極），固定化脂肪酶、Mb（1×10mol/L）和AuNPs，首先在3 支裸金電極表面滴涂30 μL AuNPs溶液，置于4 ℃冰箱中3 h備用，將固定化脂肪酶液與Mb分別采用滴涂法、浸泡法和電沉積法對(duì)電極層層組裝構(gòu)建脂肪酶生物傳感器。

滴涂法：將固定化脂肪酶酶液取30 μL滴涂在備用電極表面，靜置于4 ℃冰箱中12 h，再滴涂30 μL Mb于4 ℃冰箱中靜置12 h；浸泡法：將備用電極浸泡于固定化脂肪酶酶液中，靜置于4 ℃冰箱中12 h，自組裝完成后再置于Mb溶液中12 h；電沉積法：采用循環(huán)伏安法對(duì)備用電極修飾固定化脂肪酶酶液電沉積30 圈再修飾Mb溶液電沉積30 圈，將以上3 種不同方法構(gòu)建的脂肪酶生物傳感器分別在電解液和以三油酸甘油酯為底物的兩個(gè)檢測(cè)體系中選用循環(huán)伏安法考察電流信號(hào)變化情況，并用交流阻抗法通過電阻大小進(jìn)行脂肪酶生物傳感器構(gòu)建表征，電位-時(shí)間曲線法確定交流阻抗法開路電位值0.4 V。采用靈敏度更高的DPV，檢測(cè)三油酸甘油酯為底物的電化學(xué)體系電流信號(hào)強(qiáng)度，選取不同的反應(yīng)底物質(zhì)量濃度和pH值條件，使得DPV法在此檢測(cè)體系中電信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，為后續(xù)檢測(cè)Cu濃度反定量提供更寬的檢測(cè)范圍。

1.3.3.2 電沉積法構(gòu)建Mb耦合脂肪酶生物傳感器

首先將粒徑為10 nm的AuNPs溶液采用循環(huán)伏安法電沉積20 圈于打磨拋光好的裸金電極，其次電沉積修飾固定化脂肪酶酶液40 圈，再修飾Mb（1×10mol/L）電沉積30 圈；重復(fù)修飾固定化脂肪酶酶液和Mb溶液的步驟，利用DPV法檢測(cè)Mb耦合脂肪酶生物傳感器檢測(cè)性能。

1.3.4 DPV法對(duì)Cu的定量檢測(cè)

將制備好的酶生物傳感器，超純水沖洗后氮?dú)獯蹈?，采用DPV法在三油酸甘油酯為底物的檢測(cè)體系中檢測(cè)，在階躍高度0.015 V、振幅0.03 V、脈沖寬度0.06 s、取樣間隔0.02 s條件下，測(cè)出氧化電流峰值后，引入不同濃度的Cu，Mb特異性捕獲Cu，Cu會(huì)抑制脂肪酶的催化活性，進(jìn)而氧化電流峰值會(huì)隨著Cu濃度的升高而下降。確定檢測(cè)Cu最佳濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

1.3.5 Cu電化學(xué)檢測(cè)體系抗干擾研究及傳感器的使用壽命

采用DPV法在三油酸甘油酯和Tirs-HCl緩沖溶液的檢測(cè)體系中，采用時(shí)間-電流曲線法在三油酸甘油酯和Tirs-HCl緩沖溶液體系中檢測(cè)，每50 s向其中加入30 μL 100 nmol/L Cu，觀察電流變化，再依次加入30 μL濃度為10 μmol/L的離子，包括Ca、Mg、Zn、Hg、Pb、Ba、Ni，評(píng)估該檢測(cè)體系抗干擾性能。將制備好的酶生物傳感器分別放置冰箱4 ℃保存2、4、6、8、10、12 d和14 d，在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)酶生物傳感器的檢測(cè)性能進(jìn)行監(jiān)測(cè)，將制備好的酶生物傳感器重復(fù)進(jìn)行濃度100 μmol/L Cu檢測(cè)，每次檢測(cè)后采用超純水清洗，氮?dú)獯蹈珊笾糜? ℃冰箱冷藏保存，觀察檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化脂肪酶構(gòu)建機(jī)制分析

2.1.1 透射電鏡表征固定化脂肪酶

透射電鏡下觀察AuNPs溶液與固定化脂肪酶，如圖2A所示，AuNPs溶液中AuNPs顆粒分散均勻且粒徑均一，圖2B固定化脂肪酶溶液中由于脂肪酶通過共價(jià)鍵固定在AuNPs顆粒上，并未改變AuNPs顆粒粒徑，但AuNPs顆粒分布相對(duì)緊密，可證明脂肪酶固定成功。

圖2 AuNPs（A）和固定化脂肪酶（B）的透射電鏡表征Fig. 2 TEM images of AuNPs (A) and lipase-AuNPs (B)

2.1.2 光譜表征固定化脂肪酶

豬胰脂肪酶蛋白質(zhì)中的色氨酸（Try）和酪氨酸（Tyr）在280 nm附近均有紫外特征吸收峰。AuNPs的紫外吸收特征峰在520 nm左右，AuNPs可通過靜電吸附以及與脂肪酶中的巰基—SH結(jié)合形成牢固的共價(jià)Au—S鍵，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定性。如圖3A所示，AuNPs與脂肪酶結(jié)合后在520 nm處出現(xiàn)新特征吸收峰，固定化脂肪酶制備成功后此特征吸收峰發(fā)生紅移現(xiàn)象，且此時(shí)280 nm附近的氨基酸紫外特征吸收峰會(huì)下降，結(jié)果表明脂肪酶已成功固定在AuNPs上，使得AuNPs粒子與脂肪酶分子聚合程度上升。豬胰脂肪酶中的熒光基團(tuán)可以與猝滅劑發(fā)生分子間作用，如激發(fā)態(tài)反應(yīng)、分子重排、能量轉(zhuǎn)移、形成基態(tài)絡(luò)合物和分子碰撞等，均可引發(fā)熒光的猝滅。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，色氨酸和酪氨酸同時(shí)被激發(fā)。如圖3B所示，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，酶液中加入AuNPs后，/＝280/342 nm處的色氨酸和酪氨酸的特征發(fā)射峰明顯降低，熒光基團(tuán)發(fā)生猝滅現(xiàn)象，脂肪酶的發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn)生輕微的紅移，由342 nm紅移至345 nm，當(dāng)固定化脂肪酶制備成功時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)再次紅移至351 nm，這說明兩種氨基酸殘基均已暴露，固定化脂肪酶制備成功形成激基復(fù)合物導(dǎo)致波長(zhǎng)變長(zhǎng)。脂肪酶與固定化脂肪酶變化紅外圖譜對(duì)比如圖3C所示，3 437 cm處為不飽和碳上有強(qiáng)極性O(shè)—H發(fā)生伸縮振動(dòng)，2 319 cm處形成新的叁鍵和累計(jì)雙鍵區(qū)C≡N發(fā)生伸縮，1 638 cm的C＝C伸縮振動(dòng)明顯增強(qiáng)，可能是由于—SH與AuNPs溶液中羧酸的C＝O發(fā)生鍵和，此處特征吸收峰增強(qiáng)，980 cm可能為C—O伸縮振動(dòng)，872 cm處為＝CH發(fā)生面外搖擺，607 cm和531 cm可能為C—S和C—N，525 cm處為—S—S—的伸縮振動(dòng)明顯減弱，表明脂肪酶中的二硫鍵與AuNPs粒子發(fā)生偶聯(lián)，形成了Au—S離子共價(jià)鍵。鑒于二硫鍵在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要性，以及紫外與熒光光譜結(jié)果可知固定化脂肪酶制備成功。

圖3 固定化脂肪酶紫外光譜（A）、熒光光譜（B）和紅外光譜（C）表征Fig. 3 UV (A), fluorescence (B) and infrared spectra (C) of lipase-AuNPs

2.2 Mb耦合脂肪酶生物傳感器構(gòu)建方法篩選

在電解液溶液中，只修飾AuNPs溶液的金電極：由于AuNPs有放大電流信號(hào)的能力，電極導(dǎo)電性增強(qiáng)，比裸金電極捕捉電信號(hào)的能力更加靈敏，電流值增加了8.802 μA；3 種方式構(gòu)建的Mb耦合脂肪酶生物傳感器，電沉積法、浸泡法、滴涂法電流信號(hào)依次遞增，滴涂法比裸電極電流信號(hào)降低了17.861 μA，浸泡法比裸電極電流信號(hào)降低了21.992 μA，電沉積法比裸電極電流信號(hào)降低了27.093 μA，結(jié)果見圖4，說明電沉積法構(gòu)建脂肪酶生物傳感器的效果最好；圖5中3 種方法制備的單層組裝Mb耦合固定化脂肪酶的酶生物傳感器分別在三油酸甘油酯為底物的反應(yīng)體系中檢測(cè)：電沉積法電流信號(hào)值為18.449 μA、浸泡法電流信號(hào)值為12.908 μA、滴涂法電流信號(hào)值為11.426 μA，電沉積法、浸泡法、滴涂法構(gòu)建的脂肪酶生物傳感器檢測(cè)電流峰值依次遞減，兩項(xiàng)結(jié)果均表明電沉積法修飾固定化脂肪酶的效果最佳，因此本研究選擇電沉積法構(gòu)建脂肪酶生物傳感器。電沉積法可達(dá)成修飾電極理想化按設(shè)計(jì)順序修飾，且目標(biāo)物有序、相對(duì)致密，修飾的穩(wěn)定性相較于滴涂法與浸泡法更高。

圖4 脂肪酶生物傳感器在電解液中電信號(hào)強(qiáng)度Fig. 4 Electrical signal intensity of lipase biosensor in electrolyte

圖5 脂肪酶生物傳感器催化三油酸甘油酯Fig. 5 Voltammetric curves showing catalysis of triglycerides of lipase biosensor

2.3 Mb耦合脂肪酶生物傳感器構(gòu)建表征

如圖6A所示，在電解液溶液中裸電極表面修飾AuNPs可以放大電流信號(hào)，隨著修飾的脂肪酶層數(shù)不斷增加，電信號(hào)逐漸減弱。如圖6B所示，交流阻抗法檢測(cè)中實(shí)部電阻-虛部電阻曲線圓弧逐漸變大，顯示傳感器表面電阻不斷增加的同時(shí)，也證明酶生物傳感器構(gòu)建成功。

在三油酸甘油酯為底物的檢測(cè)體系中，傳遞的電流強(qiáng)度很弱，裸電極只能捕捉到微弱的氧化還原電信號(hào)；隨著電沉積法構(gòu)建脂肪酶生物傳感器酶層數(shù)不斷增加，氧化還原反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，電信號(hào)強(qiáng)度遞增，但層數(shù)為4 層時(shí)，在檢測(cè)體系中電信號(hào)驟減，結(jié)果如圖7所示，層數(shù)越多會(huì)形成空間位阻效應(yīng)，活性中心互相遮蓋掩埋，并影響傳感器對(duì)電流信號(hào)的感應(yīng)效果，且形成Au—S鍵共價(jià)鍵鍵和強(qiáng)度弱于自身重量也會(huì)引起斷裂；但修飾層數(shù)過少，則信號(hào)傳遞效率、傳感器響應(yīng)面及有效換能沒有達(dá)到飽和，使得檢測(cè)的靈敏度過低，因此選擇3 層為最優(yōu)的修飾脂肪酶層數(shù)。

圖6 伏安法（A）和交流阻抗法（B）電解液溶液中脂肪酶生物傳感器修飾層數(shù)優(yōu)化表征Fig. 6 Optimization of the number of modified layers of lipase biosensor in electrolyte solution

圖7 酶層數(shù)不同的脂肪酶生物傳感器催化三油酸甘油酯Fig. 7 Voltammetric curves showing catalysis of triglycerides by lipase biosensor with different enzyme layers

2.4 DPV法Cu2＋檢測(cè)體系的優(yōu)化

2.4.1 脂肪酶生物傳感器催化底物質(zhì)量濃度的確定

將構(gòu)建好的脂肪酶生物傳感器分別在不同質(zhì)量濃度三油酸甘油酯為底物的體系檢測(cè)電流信號(hào)強(qiáng)度，以－0.1～－0.5 V電位區(qū)間內(nèi)氧化峰電流值為響應(yīng)，如圖8A所示，在0.2 V附近電流達(dá)到峰值，如圖8B所示，質(zhì)量濃度為2 g/100 mL三油酸甘油酯溶于Tirs-HCl緩沖溶液時(shí)電信號(hào)強(qiáng)度最大為8.795 μA，構(gòu)建脂肪酶生物傳感器上酶數(shù)量一定，酶催化活性中心的活性位點(diǎn)數(shù)量也一定，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過高時(shí)，酶的催化活性中心可傳遞電信號(hào)的活性位點(diǎn)會(huì)被掩蓋發(fā)生衰減現(xiàn)象，與此同時(shí)檢測(cè)體系的雙電層擴(kuò)散系數(shù)會(huì)減小，傳感器同時(shí)期捕獲的電流信號(hào)會(huì)成倍降低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過低時(shí)酶促反應(yīng)沒達(dá)到飽和，此時(shí)雖然檢測(cè)體系的雙電層擴(kuò)散系數(shù)大于相對(duì)三油酸甘油酯質(zhì)量濃度過大時(shí)的系數(shù)，質(zhì)量濃度對(duì)脂肪酶生物傳感器上的酶促反應(yīng)傳遞電信號(hào)能力有影響，相較于兩者平衡時(shí)的電信號(hào)強(qiáng)度而言，體系雙電層的介電系數(shù)達(dá)到飽和，因此選擇三油酸甘油酯溶于Tirs-HCl緩沖溶液，2 g/100 mL為最佳反應(yīng)底物質(zhì)量濃度。

圖8 脂肪酶?jìng)鞲衅鞔呋煌|(zhì)量濃度三油酸甘油酯（A）及其電流變化曲線（B）Fig. 8 Voltammetric curves showing catalysis of different concentrations of triglycerides by lipase biosensor (A) and relationship between electric current and substrate concentration (B)

2.4.2 脂肪酶生物傳感器催化三油酸甘油酯最佳pH值的確定

將構(gòu)建好的酶生物傳感器分別在不同pH值條件下，以質(zhì)量濃度2 g/100 mL三油酸甘油酯為底物的體系檢測(cè)電流信號(hào)強(qiáng)度，以－0.1～0.5 V氧化峰電流為響應(yīng)，如圖9A所示，在電位0.2 V時(shí)氧化峰電流達(dá)到最大值，如圖9B所示，pH 7.5時(shí)電信號(hào)強(qiáng)度最大為15.81 μA，pH值對(duì)脂肪酶催化活性有明顯影響，當(dāng)雙電層界面擴(kuò)散系數(shù)一定時(shí)，酶促效果與電信號(hào)強(qiáng)度呈正比，pH值的不同會(huì)改變酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)，酶的活性氨基酸以及殘基會(huì)部分或全部失活，酶促反應(yīng)無法正常進(jìn)行，此時(shí)脂肪酶生物傳感器活性位點(diǎn)傳遞信號(hào)的強(qiáng)度成倍衰減，因此選擇pH 7.5的脂肪酶催化體系為最佳檢測(cè)體系。

圖9 脂肪酶?jìng)鞲衅髟诓煌琾H值催化三油酸甘油酯（A）及其電流變化曲線（B）Fig. 9 Voltammetric curves showing catalysis of triglycerides by lipase sensor at various pH levels (A) and relationship between electric current and pH (B)

2.5 Cu2＋檢測(cè)線性范圍擬合曲線、檢出限

采用DPV以0.2 V處氧化峰電流最大值為響應(yīng)，加入不同濃度Cu通過電流下降高度實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu的反定量檢測(cè)，Cu濃度（1、25、50、75 nmol/L和100 nmol/L）為橫坐標(biāo)，脂肪酶生物傳感器水解三油酸甘油酯產(chǎn)生的電流與加入Cu后電流強(qiáng)度差值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，如圖10所示，線性回歸方程為＝0.228＋0.774 8（＝0.995 0），表明Cu濃度在1～100 nmol/L區(qū)間與電流信號(hào)下降高度之間線性關(guān)系良好，經(jīng)計(jì)算得檢出限為0.03 nmol/L。

圖10 脂肪酶生物傳感器檢測(cè)Cu2＋線性關(guān)系Fig. 10 Linear relationship for detection of copper ion with lipase biosensor

2.6 Cu2＋檢測(cè)體系抗干擾性能

采用時(shí)間-電流曲線法，在三油酸甘油酯質(zhì)量濃度2 g/100 mL與Tirs-HCl檢測(cè)體系中每隔50 s加入20 μL的50 nmol/L Cu溶液，其他干擾離子濃度是Cu的100 倍，如圖11所示，當(dāng)檢測(cè)體系中加入Cu溶液時(shí)電流成階梯狀有序下降，但依次每隔50 s加入20 μL濃度為5 μmol/L Ca、Mg、Zn、Hg、Pb、Ba、Ni溶液時(shí)脂肪酶生物傳感器感應(yīng)電流強(qiáng)度無變化，說明在超痕量的檢測(cè)范圍內(nèi)此脂肪酶生物傳感器對(duì)Cu檢測(cè)具有特異性，其他常見的二價(jià)金屬、非金屬離子對(duì)本檢測(cè)體系無干擾。

圖11 抗干擾性能電流變化曲線Fig. 11 Current changes showing anti-interference performance

2.7 酶生物傳感器的穩(wěn)定性以及使用壽命

為證明每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果具有科學(xué)性，檢測(cè)制備的脂肪酶生物傳感器的穩(wěn)定性，在三油酸甘油酯與Tirs-HCl緩沖溶液的檢測(cè)體系中加入Cu進(jìn)行10 次連續(xù)檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.72%（＜5%說明酶?jìng)鞲衅麟娏黜憫?yīng)性能良好）。將制備好的酶生物傳感器保存于4 ℃冰箱中，分別存放2、4、6、8、10、12、14 d后取出對(duì)Cu進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)5 次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如圖12所示，在第14天對(duì)Cu響應(yīng)的峰電流達(dá)到86.96%，說明該脂肪酶生物傳感器穩(wěn)定性良好，隨著檢測(cè)次數(shù)的增加與構(gòu)建時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酶催化底物的活性位點(diǎn)逐漸減少導(dǎo)致重復(fù)性下降、檢測(cè)性能降低，因此在傳感器有效檢測(cè)時(shí)間內(nèi)及時(shí)使用。傳感器每次檢測(cè)Cu后用緩沖溶液進(jìn)行活性位點(diǎn)釋放處理，可實(shí)現(xiàn)一支傳感器多次使用的目的，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用同種方式進(jìn)行傳感器的活性位點(diǎn)釋放前10 次檢測(cè)，結(jié)果如圖13所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19%；在11～20 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.87%；在21～30 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.48%；在31～40 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.55%；在41～50 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.03%（＞5%），由此可知，此脂肪酶生物傳感器在40 次重復(fù)利用時(shí)可保持良好的檢測(cè)性能，但是在40 次以上電流信號(hào)感應(yīng)衰減情況顯著，此現(xiàn)象可能是因?yàn)閭鞲衅魃系闹久冈诿看吾尫?、檢測(cè)往返過程中部分活性位點(diǎn)掩蓋甚至失活，酶促反應(yīng)的電信號(hào)傳遞缺失，或本來可傳導(dǎo)信號(hào)的活性中心因?yàn)槭Щ?，電信?hào)湮滅，因此本脂肪酶生物傳感器在使用壽命上可完成在40 次左右的重復(fù)檢測(cè)效果良好。

圖12 脂肪酶?jìng)鞲衅鞣€(wěn)定性時(shí)間-電流響應(yīng)強(qiáng)度Fig. 12 Current response intensity versus curve showing lipase sensor stability

圖13 傳感器使用次數(shù)與電流變化曲線Fig. 13 Current changes as a function of the number of repeated use of the sensor

3 結(jié) 論

利用電沉積法通過層層組裝AuNPs、固定化脂肪酶、Mb構(gòu)建脂肪酶生物傳感器，實(shí)驗(yàn)表明本法固定化脂肪酶修飾層數(shù)為3 層時(shí)制備的傳感器最穩(wěn)定；脂肪酶催化底物三油酸甘油酯的檢測(cè)體系中三油酸甘油酯溶于100 mL的Tirs-HCl緩沖溶液質(zhì)量濃度為2 g/100 mL、pH 7.5時(shí)傳感器捕獲電流信號(hào)響應(yīng)值最高；Cu濃度為1～100 nmol/L線性范圍內(nèi)擬合程度最好，線性方程為=0.228＋0.774 8（=0.995 0），檢出限為0.03 nmol/L（=3）且在此超痕量的檢測(cè)范圍內(nèi)，濃度為1 μmol/L的Ca、Mg、Zn、Ba、Hg、Pb等常見的二價(jià)金屬、非金屬離子同時(shí)存在時(shí)，其他金屬對(duì)Cu檢測(cè)無干擾；此體系檢測(cè)Cu的抗干擾能力出色；在超痕量范圍內(nèi)采用DPV可實(shí)現(xiàn)對(duì)同離子現(xiàn)場(chǎng)快速、定量檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間僅需10 s，解決了目前對(duì)Cu檢測(cè)不能現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的實(shí)際問題。本研究建立的新型脂肪酶生物傳感器檢測(cè)Cu的方法，具有較高的靈敏度、專一性和穩(wěn)定性，為食品中痕量、超痕量重金屬檢測(cè)領(lǐng)域奠定了研究基礎(chǔ)。