異常威克漢姆酵母與釀酒酵母在混合發(fā)酵中的相互作用機(jī)制

趙劍雷，邱樹(shù)毅，王曉丹，袁 夢(mèng)，周鴻翔

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

酵母菌是果酒釀造中主要的功能性微生物，根據(jù)其在釀造過(guò)程中功能不同而分為釀酒酵母（，）和非釀酒酵母。具有較高的產(chǎn)酒能力與耐受性，在發(fā)酵過(guò)程中大多會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)并完成發(fā)酵；非釀酒酵母則能產(chǎn)生更加復(fù)雜的風(fēng)味成分以及胞外酶等代謝物，可以將原料中的物質(zhì)充分釋放，將其轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇、酯等香氣物質(zhì)，提升果酒的品質(zhì)。因此，將和非釀酒酵母用于混合發(fā)酵果酒，能將原料中獨(dú)特的風(fēng)味更好地展示出來(lái)。

非釀酒酵母中有一類(lèi)酵母菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生較多的酯類(lèi)香氣成分及其前體，這類(lèi)酵母菌可以叫做產(chǎn)酯酵母或產(chǎn)香酵母。產(chǎn)香酵母近年來(lái)被應(yīng)用于很多食品的生產(chǎn)，如面食的發(fā)酵、醬油、食醋、白酒以及果酒的釀造中，使香氣復(fù)雜化，具有提升產(chǎn)品品質(zhì)的能力。但非釀酒酵母乙醇發(fā)酵能力較弱，常常不能將之用于純種發(fā)酵。近年來(lái)很多研究將和產(chǎn)香酵母混合發(fā)酵，但在混合發(fā)酵時(shí)，需要研究混合發(fā)酵過(guò)程中的相互作用關(guān)系和規(guī)律，才能更好地控制發(fā)酵各個(gè)階段的菌種特性和代謝，優(yōu)化生產(chǎn)發(fā)酵工藝。

在前期研究中，篩選出2 株優(yōu)良酵母菌株，其一是高產(chǎn)乙醇、發(fā)酵能力強(qiáng)的ZM-005，以及對(duì)香氣成分有顯著貢獻(xiàn)的異常威克漢姆酵母（，）K-008，通過(guò)研究其相互作用，可以增加產(chǎn)品的功能特性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在混菌發(fā)酵時(shí)，會(huì)發(fā)生不同菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生具有毒性的代謝物抑制或者存在細(xì)胞接觸的影響作用等。最有代表性的代謝物就是乙醇，因?yàn)榘l(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的乙醇從而抑制非釀酒酵母的生長(zhǎng)。除乙醇外，代謝物中也會(huì)產(chǎn)生短鏈、中鏈、長(zhǎng)鏈脂肪酸、高級(jí)醇、寡聚肽或一些有毒蛋白等，會(huì)抑制其余菌種的生長(zhǎng)。在混菌發(fā)酵中相互作用的影響因素較為復(fù)雜，影響機(jī)制也較為繁瑣，不同的菌種之間也有著較大差異。

本實(shí)驗(yàn)以前期篩選出的2 種優(yōu)良酵母菌株為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行單菌種及混合培養(yǎng)，通過(guò)考察混合發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)變化規(guī)律，分析相互作用中細(xì)胞凋亡、代謝物以及細(xì)胞接觸作用，一方面旨在對(duì)酵母菌相互作用機(jī)理及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有更加深入的認(rèn)識(shí)，另一方面在混合發(fā)酵工藝提升產(chǎn)品風(fēng)味的基礎(chǔ)上，更加準(zhǔn)確調(diào)控微生物的生長(zhǎng)和代謝，使得生產(chǎn)更加系統(tǒng)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

ZM-005為從自然發(fā)酵藍(lán)莓酒中篩選出來(lái)的1 株產(chǎn)酒能力優(yōu)良且能在WL鑒別培養(yǎng)基呈現(xiàn)特有顏色和形態(tài)的酵母菌；K-008由貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min；YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min；WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸錳0.125 g/L，硫酸鎂0.002 5 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌15 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：無(wú)水葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈣、硫酸錳、硫酸鎂、氯化鐵、溴甲酚綠 上海博微生物科技有限公司；無(wú)水葡萄糖 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蛋白胨、酵母粉 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、乙醇、乳酸標(biāo)準(zhǔn)液 深圳市西爾曼科技有限公司；生物傳感器酶膜緩沖液粉、乙醇酶膜、葡萄糖酶膜 深圳市西爾曼科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQPL-200立式全溫震蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；HH-21-6電熱恒溫水浴鍋 上海助藍(lán)儀器科技有限公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JXFSTPRP-24細(xì)胞破碎儀 上海凈信發(fā)展有限公司；NP-30S渦旋混合儀 常州恩培儀器制造商有限公司；LC-LX-H185C臺(tái)式高速離心機(jī) 上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-10生物傳感器分析儀 深圳市西爾曼科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將－80 ℃甘油管保藏菌株，劃線于YPD固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，將平板上單菌落挑取至100 mL滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，使得培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)達(dá)到10CFU/mL，備于接種。

1.3.2 共同接種發(fā)酵

對(duì)照組：將和分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5×10CFU/mL，30 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵停止，發(fā)酵前2 d內(nèi)每隔4 h取樣，稀釋涂布于WL鑒別培養(yǎng)基中，2 d后每隔24 h涂布一次，觀察過(guò)程中生物量變化。

實(shí)驗(yàn)組：1）正常混合發(fā)酵：將和以1∶1（都為5×10CFU/mL）比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)方法與對(duì)照組一致；2）不同初始濃度的接種：梯度為5×10、2.5×10、1×10CFU/mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔2 d涂布于WL固體平板計(jì)數(shù)；3）高濃度接種：以10CFU/mL接種量，以5×10CFU/mL同時(shí)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)方法與對(duì)照組一致。

以上實(shí)驗(yàn)均在30 ℃下恒溫培養(yǎng)。

1.3.3 酵母細(xì)胞對(duì)乙醇耐受性

活化好的兩種菌按接種量5×10CFU/mL接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%接入培養(yǎng)基中）中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，稀釋涂平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，計(jì)算菌落總數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)組均有3 組平行，取平均值。

1.3.4 發(fā)酵上清液制備

制備純發(fā)酵、純發(fā)酵以及混合發(fā)酵上清液，將培養(yǎng)2、4、6 d后的3 個(gè)時(shí)間段發(fā)酵液靜置10 min，分別倒入50 mL已滅菌的離心管，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心2 次，取上清液，再次倒入新的離心管，重復(fù)離心步驟，在超凈臺(tái)中過(guò)0.22 μm濾膜，去除剩余酵母細(xì)胞，得到無(wú)細(xì)胞的發(fā)酵上清液備用。

1.3.5 死細(xì)胞和破碎細(xì)胞處理

參考Nissen等實(shí)驗(yàn)，100 ℃煮沸等量的細(xì)胞10 min，得到死細(xì)胞，放入100 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心2 次后備用；將5 000 r/min離心10 min后的細(xì)胞沉淀放入冷凍細(xì)胞破碎機(jī)中破碎5 min，再次重復(fù)離心，取出破碎細(xì)胞備用。

1.3.6 透析袋實(shí)驗(yàn)

通過(guò)Renault等設(shè)計(jì)的一種新型模型，模仿其設(shè)計(jì)透析袋發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，選擇1 000 Da和12 kDa截留分子質(zhì)量的透析袋，發(fā)酵罐內(nèi)加入發(fā)酵培養(yǎng)基，將透析袋和發(fā)酵罐進(jìn)行組合。透析袋100 ℃高溫煮沸10 min備用，將煮好的透析袋放入發(fā)酵罐中，透析袋內(nèi)外加入等量的發(fā)酵培養(yǎng)基，罐口封上封口膜，115 ℃滅菌20 min，發(fā)酵罐透氣測(cè)溫頂蓋65 ℃下滅菌30 min取出，經(jīng)過(guò)乙醇消毒后紫外線照射15 min，在超凈臺(tái)中組合，接菌后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

接種方式：將接種于透析袋內(nèi)，接種于透析袋外，為驗(yàn)證透析袋實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，作為對(duì)照將接種在透析袋內(nèi)，接種在透析袋外，每4 h測(cè)定每組透析袋內(nèi)外的生物量、葡萄糖、乙醇含量，測(cè)定至36 h。接種量均為5×10CFU/mL。

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次取平均值。

1.3.7 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)測(cè)定

3 組分別為純接種、純接種、與混合接種（1∶1）。其中發(fā)酵培養(yǎng)基為20%含糖量的液體YPD培養(yǎng)基，純發(fā)酵以及混合發(fā)酵接種每種菌體接種量都為5×10CFU/mL。接種后，每隔1 d稱(chēng)質(zhì)量一次，一直到發(fā)酵結(jié)束為1 個(gè)周期，以CO質(zhì)量損失測(cè)定其發(fā)酵速率，計(jì)算如下式所示：

式中：M為發(fā)酵第天總質(zhì)量損失；M為發(fā)酵第－1天總質(zhì)量損失。

1.3.8 葡萄糖和乙醇測(cè)定

緩沖液準(zhǔn)備：將緩沖液粉倒入緩沖液瓶，加入5 000 mL純水充分溶解6 h后使用（必須一次性配完5 000 mL，不能拆分配制，否則會(huì)損壞酶膜）。

生物傳感器測(cè)定：進(jìn)行葡萄糖與乙醇標(biāo)定，每次使用前，將葡萄糖（1 g/L）和乙醇（0.5 g/L）標(biāo)準(zhǔn)液從4 ℃取出，系統(tǒng)調(diào)至定標(biāo)操作，將25 μL標(biāo)準(zhǔn)液注入感應(yīng)器中，調(diào)整電極電量，定標(biāo)3 次至系統(tǒng)顯示通過(guò)，每測(cè)定10 次樣品后需重新定標(biāo)進(jìn)樣（乙醇量程0～1 g/L、葡萄糖量程0～2 g/L），樣品條件：稀釋倍數(shù)使得葡萄糖與乙醇都在量程范圍內(nèi)才能測(cè)定。

樣品測(cè)定：將發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶液混勻，在無(wú)菌超凈臺(tái)中取樣，首先取1 mL樣品放入離心管，2 000 r/min離心5 min，吸取離心清液中不同部分（上、中、下）溶液各100 μL，稀釋于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容（稀釋100 倍），再用標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定生物傳感器，使得系統(tǒng)標(biāo)定成功。測(cè)定時(shí)加入25 μL的樣品稀釋液，測(cè)定樣品葡萄糖和乙醇含量，均測(cè)定3 次取平均值。

1.3.9 生物量測(cè)定

平板計(jì)數(shù)法：在混合培養(yǎng)條件下，由于和在電子顯微鏡下生長(zhǎng)形態(tài)相似，肉眼難以區(qū)分，有研究發(fā)現(xiàn)，WL選擇培養(yǎng)基能分辨不同的酵母菌，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在WL鑒別培養(yǎng)基中呈現(xiàn)黃色凸起狀，而在WL鑒別培養(yǎng)基中呈現(xiàn)白色扁平狀，故可以采用WL鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。

血球計(jì)數(shù)板法：添加亞甲基藍(lán)溶液對(duì)酵母活細(xì)胞進(jìn)行染色再計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用OrginPro 2018C軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析、利用Adobe illustrator CS6進(jìn)行優(yōu)化作圖和組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 純發(fā)酵和混合發(fā)酵2 種酵母菌發(fā)酵性能比較

圖1 純發(fā)酵與混合發(fā)酵動(dòng)態(tài)指標(biāo)監(jiān)測(cè)Fig. 1 Fermentation characteristics of pure and mixed cultures

由圖1A、C可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖添加量為200 g/L時(shí)，純培養(yǎng)和均能正常生長(zhǎng)且在發(fā)酵2 d后能趨于穩(wěn)定，此時(shí)的生物量為4.38×10CFU/mL，而的生物量為3.54×10CFU/mL。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，混合發(fā)酵時(shí)通常會(huì)在發(fā)酵早期影響非釀酒酵母的生長(zhǎng)，或者產(chǎn)生負(fù)面影響，使非釀酒酵母提前停滯生長(zhǎng)，得到低于的菌體濃度，由圖1E可知，混合發(fā)酵1 d后，生物量達(dá)到2.75×10CFU/mL，但生物量?jī)H為4.32×10CFU/mL，此時(shí)在體系中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位并生長(zhǎng)到較高濃度。在初期生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)速率均小于，在2～15 d發(fā)酵中生物量逐漸下降，第16天時(shí)生物量下降到4.53×10CFU/mL，因?yàn)榘l(fā)酵后期隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，乙醇質(zhì)量濃度的上升以及大量酵母競(jìng)爭(zhēng)生存空間，使不能正常生長(zhǎng)。

由圖1B、D、F可知，以葡萄糖的消耗為例，純發(fā)酵約7 d后將發(fā)酵體系中的葡萄糖完全消耗，混合發(fā)酵9 d后也能將葡萄糖消耗殆盡，表明在混合發(fā)酵時(shí)同樣可以完全發(fā)酵底物。純發(fā)酵雖然速率較慢，直到13 d后才將糖消耗殆盡，但也可以完成發(fā)酵。對(duì)于乙醇生成量，純發(fā)酵從2 d開(kāi)始產(chǎn)生乙醇，7 d后乙醇發(fā)酵完成，質(zhì)量濃度達(dá)到115 g/L，而純發(fā)酵產(chǎn)生乙醇能力較弱，乙醇發(fā)酵從2 d開(kāi)始到14 d才結(jié)束，最終乙醇產(chǎn)量?jī)H有84 g/L?；旌习l(fā)酵中，乙醇發(fā)酵9 d才結(jié)束，此時(shí)乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到110 g/L，與純發(fā)酵相似。相比下純的發(fā)酵能力比純發(fā)酵能力弱，混合發(fā)酵過(guò)程中生物量占比大，數(shù)量和純發(fā)酵相近，所以混合發(fā)酵能力與純發(fā)酵相似，對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程沒(méi)有較大影響。

圖2 發(fā)酵速率變化Fig. 2 Fermentation rate as a function of fermentation time

有研究表明通過(guò)發(fā)酵前300 h的CO產(chǎn)生量可以衡量菌種的發(fā)酵能力，從圖2可知，實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算每天生產(chǎn)CO的速率比較發(fā)酵性能，純發(fā)酵在第3天達(dá)到最大速率（1.10±0.02）g/（L·h），同期純發(fā)酵為（0.71±0.02）g/（L·h），混合發(fā)酵為（0.81±0.02）g/（L·h）。因此，純發(fā)酵能力大于混合發(fā)酵和純發(fā)酵能力，混合發(fā)酵的發(fā)酵能力也大于純發(fā)酵。

2.2 混合發(fā)酵早期現(xiàn)象

圖3 混合發(fā)酵酵母菌生物量變化Fig. 3 Yeast biomass in mixed culture fermentation as a function of fermentation time

由圖3可知，在混合發(fā)酵前36 h，體系中的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)量都與純培養(yǎng)時(shí)相似，而在混合發(fā)酵24 h后呈下降趨勢(shì)，生物量?jī)H為4.30×10CFU/mL，未達(dá)到純培養(yǎng)時(shí)最大生物量，生長(zhǎng)受到影響，繼而成為體系中優(yōu)勢(shì)菌種并大量生長(zhǎng)。混合發(fā)酵早期出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯或抑制現(xiàn)象，可能是混合培養(yǎng)中存在細(xì)胞自身凋亡、酵母菌產(chǎn)生的代謝物影響生長(zhǎng)或酵母中存在的間接細(xì)胞接觸作用。

2.3 Wa前期死亡因素分析

2.3.1的自然死亡現(xiàn)象

圖4 酵母菌自身凋亡現(xiàn)象Fig. 4 Yeast apoptosis as a function of fermentation time

為判定混合培養(yǎng)中早期死亡機(jī)制是否和純培養(yǎng)時(shí)死亡機(jī)制相同，將不同初始接種量的（5×10、2.5×10、1×10CFU/mL）分別接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)變化。由圖4可知，不同接種量的均能正常生長(zhǎng)，直到發(fā)酵后期才出現(xiàn)菌體死亡，是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，細(xì)胞出現(xiàn)自溶死亡。初始接種濃度越高，營(yíng)養(yǎng)消耗越快，后期細(xì)胞死亡現(xiàn)象越早。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的自溶凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)在發(fā)酵后期而不是在發(fā)酵前期，由上可以初步排除混合發(fā)酵前期（圖1E）生物量下降是細(xì)胞凋亡和自溶。

2.3.2 發(fā)酵上清液實(shí)驗(yàn)

圖5 不同階段發(fā)酵上清液中酵母菌生長(zhǎng)曲線圖Fig. 5 Growth curves of yeast in supernatant at different fermentation stages

圖6 兩種酵母菌對(duì)乙醇的耐受能力Fig. 6 Ethanol tolerance of two yeasts

分別將與純培養(yǎng)時(shí)不同發(fā)酵階段的無(wú)細(xì)胞濾液當(dāng)作培養(yǎng)體系，向其中分別加入兩種酵母細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)變化。有研究表明，混合發(fā)酵時(shí)在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生抑制非釀酒酵母生長(zhǎng)的物質(zhì)（抗菌肽、有毒化合物等），使得非釀酒酵母不能正常生長(zhǎng)。由圖5A可知，在發(fā)酵2、4 d后上清液中生長(zhǎng)情況與純發(fā)酵時(shí)相似，這表明純發(fā)酵前期幾乎沒(méi)有產(chǎn)生能抑制生長(zhǎng)的物質(zhì)。從圖5B可以發(fā)現(xiàn)，在混合發(fā)酵4 d后上清液中生長(zhǎng)量略小于在純發(fā)酵4 d上清液中的生長(zhǎng)量，通過(guò)圖1D、F數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵4 d上清液中糖含量剩余55%，而在混合發(fā)酵4 d的上清液中糖含量?jī)H剩38%，同時(shí)由圖6可知，兩種酵母菌乙醇耐受能力相似，所以發(fā)酵前期乙醇含量沒(méi)有明顯抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象，由此發(fā)現(xiàn)在混合發(fā)酵4 d上清液中生物量小于在發(fā)酵4 d上清液中的生物量是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制造成的。

從圖5C可知，在發(fā)酵2 d上清液中，也能維持一個(gè)正常的生長(zhǎng)狀態(tài)，生物量可以達(dá)到10CFU/mL，所以在發(fā)酵前期生長(zhǎng)幾乎不受前期代謝物的影響。隨著發(fā)酵和混合發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，生物量逐漸下降，例如在發(fā)酵4 d以及混合發(fā)酵上清液中只能生長(zhǎng)在10CFU/mL左右，同時(shí)對(duì)比圖5C、D，在混合發(fā)酵6 d和發(fā)酵6 d后的上清液中，最大生物量?jī)H能生長(zhǎng)到10CFU/mL。結(jié)合圖1E和圖5D，發(fā)酵后期生物量從10CFU/mL降到10CFU/mL，與在混合發(fā)酵6 d后的上清液中生長(zhǎng)量相似，無(wú)論是在發(fā)酵6 d還是混合發(fā)酵6 d后的上清液中，乙醇質(zhì)量濃度都高于100 g/L，而糖質(zhì)量濃度都低于40 g/L，可以發(fā)現(xiàn)后期死亡現(xiàn)象是由于乙醇的大量積累導(dǎo)致微生物細(xì)胞破壞，使得酵母菌死亡。綜上所述，在發(fā)酵后期起到抑制生長(zhǎng)的主要原因是高濃度的乙醇和營(yíng)養(yǎng)物缺乏，而在發(fā)酵前期，純發(fā)酵上清液和混合發(fā)酵上清液都沒(méi)有對(duì)的生長(zhǎng)起到明顯的抑制作用，可以初步排除發(fā)酵前期代謝物的影響。

2.4 高濃度活Sc細(xì)胞的影響

圖7 高濃度Sc添加時(shí)酵母菌生長(zhǎng)情況Fig. 7 Growth of yeast in the presence of high concentration of Sc

圖8 添加死亡和破碎的Sc細(xì)胞條件下Wa的生長(zhǎng)Fig. 8 Growth of Wa in the presence of dead or broken Sc cells

從Nissen等的研究中發(fā)現(xiàn)，高密度細(xì)胞的存在可能會(huì)通過(guò)細(xì)胞接觸影響體系中其他酵母菌正常生長(zhǎng)，當(dāng)溶液中活細(xì)胞濃度達(dá)到1×10CFU/mL時(shí)，就會(huì)增加體系中高密度接觸作用，從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。為證實(shí)是高濃度細(xì)胞產(chǎn)生的影響，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)添加1×10CFU/mL高濃度的和5×10CFU/mL的于同一體系中，由圖7可知，當(dāng)添加高濃度的時(shí)，在12 h生長(zhǎng)到1.37×10CFU/mL就開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖8可知，將等量細(xì)胞進(jìn)行高溫煮沸滅活和冷凍破碎細(xì)胞兩種方法處理后，再加入培養(yǎng)基中，依舊能正常生長(zhǎng)繁殖并在12 h后達(dá)到10CFU/mL。所以在混合發(fā)酵前期，高濃度活細(xì)胞的存在導(dǎo)致生長(zhǎng)受到抑制。

2.5 細(xì)胞-細(xì)胞接觸機(jī)制

圖9 透析袋內(nèi)外變化監(jiān)測(cè)（1 000 Da）Fig. 9 Biomass, ethanol concentration and glucose concentration inside and outside dialysis bag as a function of fermentation time (1 000 Da)

圖10 透析袋內(nèi)外變化監(jiān)測(cè)（12 kDa）Fig. 10 Biomass, glucose concentration and ethanol concentration inside and outside dialysis bag as a function of fermentation time (12 kDa)

實(shí)驗(yàn)采用透析袋隔離不同酵母細(xì)胞，透析袋可以使得其余溶質(zhì)自由出入和混合均勻，保證體系中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)趨于平衡，酵母細(xì)胞這種較大分子質(zhì)量的物質(zhì)能有效被隔絕在兩個(gè)體系內(nèi)，使兩種不同的生物細(xì)胞之間沒(méi)有細(xì)胞接觸作用。使用1 000 Da和12 kDa兩種截流分子質(zhì)量不同的透析袋將兩種酵母細(xì)胞分為兩個(gè)體系，初始接種5×10CFU/mL細(xì)胞量。由圖9、10可知，在截留分子質(zhì)量為1 000 Da和12 kDa的透析袋內(nèi)外兩個(gè)體系中，乙醇、葡萄糖的變化趨勢(shì)和含量均無(wú)明顯差異，由于葡萄糖是培養(yǎng)基中主要的營(yíng)養(yǎng)成分且含量最多，乙醇是產(chǎn)生代表性的小分子物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)，可以初步判定實(shí)驗(yàn)中所選擇的兩種透析袋對(duì)發(fā)酵中主要物質(zhì)有著充分的滲透性，使得透析袋內(nèi)外兩種菌生長(zhǎng)基礎(chǔ)條件相同。可以觀察到，發(fā)酵前期與生物量和生長(zhǎng)趨勢(shì)均與純發(fā)酵近似，所以在透析袋體系中，排除發(fā)酵前期小分子代謝物的產(chǎn)生對(duì)兩種酵母菌生長(zhǎng)的影響。由圖9可知，在1 000 Da的透析袋中，生物量經(jīng)過(guò)36 h后為3.65×10CFU/mL，而透析袋外生物量為4.42×10CFU/mL，說(shuō)明在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下兩種酵母菌的生長(zhǎng)情況與純培養(yǎng)時(shí)幾乎一致，同樣的情況也出現(xiàn)在12 kDa透析袋實(shí)驗(yàn)中（圖10）。但在1 000 Da中生物量略低于純發(fā)酵組，分析可能是透析袋截留分子質(zhì)量太小，兩側(cè)的濃度差不夠大，一些小分子物質(zhì)經(jīng)過(guò)透析袋時(shí)動(dòng)力不足，透析袋內(nèi)小空間中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流動(dòng)較慢，交換較少，最終使透析袋內(nèi)的菌種受到營(yíng)養(yǎng)限制。以上實(shí)驗(yàn)中，和都可在其對(duì)應(yīng)的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液中生長(zhǎng)，也可以初步排除分子質(zhì)量高于12 kDa的可溶性生長(zhǎng)抑制化合物的潛在效應(yīng)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)使用的酵母菌在混合培養(yǎng)前期存在影響菌體生長(zhǎng)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸機(jī)制，早期的死亡現(xiàn)象是在高濃度存在下，通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié) 論

與混合發(fā)酵前期，正常生長(zhǎng)而出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制和死亡現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)體系中，首先接種不同初始濃度發(fā)酵后，初步排除在發(fā)酵前期細(xì)胞自身凋亡作用引起其生物量下降。再通過(guò)發(fā)酵性能和上清液實(shí)驗(yàn)，在早期死亡原因，初步排除是發(fā)酵前期產(chǎn)生乙醇等有毒物質(zhì)抑制的作用。當(dāng)已滅活細(xì)胞、破碎后細(xì)胞、高濃度活細(xì)胞分別與混合時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有在高濃度活細(xì)胞存在的發(fā)酵體系中對(duì)生長(zhǎng)有抑制作用。最后通過(guò)透析袋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度的活會(huì)通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸對(duì)生長(zhǎng)起到抑制作用，使得在發(fā)酵前期，出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯和死亡現(xiàn)象。混合發(fā)酵研究中相互作用是復(fù)雜且多樣的，在本實(shí)驗(yàn)體系中僅發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞接觸抑制作用，其余相互作用以及之間主次關(guān)系還有待更加深入的探討，接下來(lái)可以運(yùn)用代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)對(duì)微生物之間不同的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。