23S核糖體RNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)位點(diǎn)A2063G、A2064G突變與兒童難治性肺炎支原體肺炎的相關(guān)性▲

張碧清 歐書騰 范楚平

(郴州市第一人民醫(yī)院兒童呼吸科，湖南省郴州市 423000)

肺炎支原體肺炎好發(fā)于兒童，是學(xué)齡前兒童常見的社區(qū)獲得性呼吸道感染性疾病，約占兒童肺炎的20%[1-2]。肺炎支原體肺炎患兒的臨床表現(xiàn)具有差異性，主要臨床癥狀包括刺激性干咳、喘息、低熱等，而肺部體征不明顯，嚴(yán)重時可合并胸腔積液、肺不張等，嚴(yán)重影響患兒的健康[3-4]。經(jīng)過大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療1周以上，臨床癥狀無明顯改善，即為難治性肺炎支原體肺炎。難治性肺炎支原體肺炎患兒的病情進(jìn)展迅速，臨床表現(xiàn)多變，如不能采取及時、有效的治療措施，患兒可能會出現(xiàn)多系統(tǒng)和器官損害，其健康會受到嚴(yán)重危害。而目前臨床上尚無用于治療難治性肺炎支原體肺炎有效且安全性較高的抗生素，這不僅給臨床治療帶來一定的挑戰(zhàn)，而且會給社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6]。研究表明，難治性肺炎支原體肺炎與耐藥基因突變存在一定的關(guān)系，而耐藥基因23S核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)位點(diǎn)A2063G、A2064G的突變在抗生素耐藥中扮演著重要的角色[7]，但是尚未有研究明確A2063G、A2064G位點(diǎn)突變與難治性肺炎支原體肺炎的相關(guān)性。因此，本研究探討耐藥基因rRNA位點(diǎn)A2063G、A2064G的突變與難治性肺炎支原體肺炎發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年3月至2020年3月于我院就診的184例肺炎支原體肺炎患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合肺炎支原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)患兒臨床資料完整；(3)入組前2周內(nèi)已接受正規(guī)大環(huán)內(nèi)酯類藥物抗感染治療，但未接受其他影響觀察指標(biāo)的藥物治療；(4)患兒家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肺結(jié)核者：(2)合并免疫系統(tǒng)疾病者；(3)混合感染者；(4)合并神經(jīng)精神性疾病不能配合研究者。參照《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(試行)》[9]關(guān)于難治性肺炎支原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患兒分為非難治性肺炎組128例和難治性肺炎組56例。兩組患兒性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)文號：KL-201904)。

表1 兩組患兒一般資料的比較

1.2 常規(guī)實驗室指標(biāo)檢測 于患兒入院次日，抽取其空腹外周靜脈血5 mL，檢測降鈣素原、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、血沉、ALT、AST、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平，以及白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計數(shù)。使用日立7170型全自動生化分析儀檢測ALT、AST、LDH水平；使用日本Sysmex公司XN9000型全自動血細(xì)胞分析儀行血常規(guī)檢查；采用魏氏法檢測血沉，檢測儀器為意大利ALIFAX公司的ALIFAX Test 1型全自動血沉分析儀；采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測降鈣素原，檢測儀器為廣州羅氏公司E170型分析儀；采用免疫速率比濁法檢測CRP水平，檢測儀器為美國貝克曼庫爾特公司的IMMAGE 800全自動免疫分析儀。正常值范圍如下：降鈣素原水平<0.5 ng/mL；CRP水平<10 mg/L；血沉男性為0～15 mm/h，女性為0～20 mm/h； LDH水平為40～250 U/L；白細(xì)胞計數(shù)為(3.5～10)×109/L；中性粒細(xì)胞計數(shù)為(0.5～0.7)×109/L；AST水平為0～40 U/L；ALT水平為0～40 U/L。

1.3 耐藥基因測序 于入院當(dāng)日，使用無菌生理鹽水浸濕的無菌咽拭子擦拭患兒咽后壁，置于低溫冰箱(-4 ℃)中保存待檢。檢測前將咽拭子加入含有生理鹽水的試管中，進(jìn)行震蕩搖勻后將液體移至離心管中，室溫下以10 000 r/min離心(離心半徑10 cm)2 min后棄去上清液，加入55 μL DNA裂解液，使用移液槍輕輕吹打混勻，然后加入5 μL的內(nèi)標(biāo)基因，在100 ℃條件下處理10 min，再次進(jìn)行離心。選擇試劑盒弱陽性質(zhì)控品(含23S rRNA位點(diǎn)A2063G發(fā)生突變的基因序列和P1基因序列)、試劑盒強(qiáng)陽性質(zhì)控品(含23S rRNA位點(diǎn)A2063G發(fā)生突變的基因序列和P1基因序列)與樣品進(jìn)行平衡處理，選擇生理鹽水為陰性對照，試劑盒均購自上?；瞪镉邢薰?批號：006712、06714)。在試劑盒中取出ddH2O、引物探針和緩沖液并在4 ℃條件下進(jìn)行融化，將反轉(zhuǎn)錄酶取出搖勻并在4 ℃下以1 200 r/min離心5 min，使用1支無菌無核酸酶的離心管做標(biāo)記，加入反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、引物探針2.0 μL、緩沖液6.0 μL和11.5 μL ddH2O；向PCR反應(yīng)管中加入制備好的5.0 μL標(biāo)本(抽提陰性對照品、質(zhì)控品W、強(qiáng)弱陽性質(zhì)控品和樣本)，同時加入5.0 μL無菌水作為陰性對照。PCR擴(kuò)增參數(shù)：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；91 ℃ 15 s；64 ℃ 1 min；40個循環(huán)。在64 ℃收集熒光信號，主要包括FAM(2063或2064位點(diǎn)A:G突變)、VIC(肺炎支原體)、CY5(內(nèi)標(biāo))。反應(yīng)結(jié)束后以Ct值顯示結(jié)果，如內(nèi)標(biāo)的Ct值≤35、FAM的Ct值<35.33、VIC的Ct值<35.01，則為肺炎支原體陽性而且存在耐藥基因23S rRNA位點(diǎn)A2063G和/或A2064G的突變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；采用Spearman檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析，納入有統(tǒng)計學(xué)意義的因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒觀察指標(biāo)的比較 難治性肺炎組的CRP、血沉、LDH水平，中性粒細(xì)胞計數(shù)，以及A2063G和/或A2064G位點(diǎn)突變的比例均高于非難治性肺炎組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組患兒觀察指標(biāo)的比較

組別nAST(x±s,U/L)ALT(x±s,U/L)中性粒細(xì)胞計數(shù)(x±s,×109/L)A2063G和/或A2064G位點(diǎn)突變[n(%)]難治性肺炎組5626.98±7.1832.71±5.1421.54±6.8254(96.43)非難治性肺炎組12824.98±6.2030.68±6.2710.95±6.3496(75.00) t/χ2值1.0210.9855.83511.875P值0.0620.104<0.0010.001

2.2 CRP、血沉、LDH、中性粒細(xì)胞計數(shù)、A2063G和/或A2064G位點(diǎn)突變與難治性肺炎支原體肺炎的相關(guān)性 CRP、血沉、LDH水平，中性粒細(xì)胞計數(shù)，以及A2063G和/或A2064G位點(diǎn)突變情況均與難治性肺炎支原體肺炎具有相關(guān)性(均P<0.05)，見表3。

表3 實驗室相關(guān)指標(biāo)與難治性肺炎支原體肺炎的相關(guān)性

2.3 多因素Logistic回歸分析 以難治性肺炎支原體肺炎為因變量(賦值：是=1，否=0)，以A2063G或/和A2064G位點(diǎn)突變、中性粒細(xì)胞計數(shù)、CRP、血沉、LDH水平為自變量(基因位點(diǎn)突變賦值：是=1，否=0；其他變量在正常值范圍內(nèi)賦值為0，超過正常值范圍賦值1)，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，CRP、血沉、LDH水平升高，以及A2063G或/和A2064G位點(diǎn)突變均是患兒發(fā)生難治性肺炎支原體肺炎的危險因素(均P<0.05)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

肺炎支原體肺炎是學(xué)齡前兒童常見的呼吸道感染性疾病之一。支原體是無細(xì)胞壁的微生物，機(jī)體感染肺炎支原體時可供選擇的抗生素主要有四環(huán)素類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。但是由于喹諾酮類抗生素會損害患兒的腎臟功能及聽力，四環(huán)素類抗生素會導(dǎo)致兒童發(fā)生腎損傷和牙齒、骨骼損傷，不推薦用于肺炎支原體肺炎患兒的治療，故大環(huán)內(nèi)酯類成為治療肺炎支原體肺炎患兒較為安全的藥物之一[10]。隨著肺炎支原體感染的發(fā)病率不斷增加，大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥問題成為亟需解決的難題。既往研究表明，難治性肺炎支原體肺炎與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥、合并其他病原菌感染、誤診誤治、免疫應(yīng)答異常相關(guān)，其中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥是導(dǎo)致難治性肺炎支原體肺炎的主要致病因素[11]。因此，本研究探討相關(guān)耐藥基因位點(diǎn)突變與難治性肺炎支原體肺炎的相關(guān)性。

核糖體是支原體合成蛋白質(zhì)的主要場合，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制主要是導(dǎo)致結(jié)合MP50S大亞基的23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)和Ⅱ區(qū)發(fā)生基因突變，從而使得核糖體與抗生素的親和力下降，阻礙蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致抗生素耐藥[12]。研究表明，支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的機(jī)制主要有靶位改變、基因甲基化酶修飾和靶基因23S rRNA突變，其中靶基因23S rRNA突變是目前臨床關(guān)注和研究的重點(diǎn)[13]。23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)A2063G、A2064G是其最常見的突變位點(diǎn)。因此，我們推測23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)位點(diǎn)A2063G、A2064G突變與難治性肺炎支原體肺炎可能存在相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，難治性肺炎組患兒的CRP、血沉、LDH水平，中性粒細(xì)胞計數(shù)，以及A2063G和/或A2064G位點(diǎn)突變的比例均高于非難治性肺炎組(均P<0.05)；而CRP、血沉、LDH水平，中性粒細(xì)胞計數(shù)，以及A2063G或/和A2064G位點(diǎn)突變均與難治性肺炎支原體肺炎具有相關(guān)性(均P<0.05)；進(jìn)一步進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，校正了CRP、血沉、LDH等實驗室指標(biāo)后，A2063G或/和A2064G位點(diǎn)突變?nèi)允腔純喊l(fā)生難治性肺炎支原體肺炎的危險因素(P<0.05)，這印證了上述的推測。23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)位點(diǎn)A2063G、A2064G突變會進(jìn)一步導(dǎo)致病原菌靶位改變、主動外排藥物和藥物滅活等，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不能發(fā)揮作用，導(dǎo)致肺炎支原體肺炎患兒自身免疫紊亂，病情加重[14]。因此，對于難治性肺炎支原體肺炎患兒，在臨床治療中應(yīng)該積極尋找更加安全有效的藥物。

綜上所述，存在23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ區(qū)位點(diǎn)A2063G、A2064G突變的肺炎支原體肺炎患兒發(fā)展為難治性肺炎支原體肺炎的概率更大，可根據(jù)該指標(biāo)判斷肺炎支原體肺炎患兒出現(xiàn)難治性肺炎支原體肺炎的可能性，進(jìn)而制定合理、安全的用藥方案，以盡快改善患兒癥狀、縮短患兒的住院時間和治療時間，從而減輕患兒的身心負(fù)擔(dān)和家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。