熊威威，汪 鵬，李文恒，向東山?，翟 琨?

1. 湖北民族大學(xué)生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北恩施445000

0 引 言

氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一種應(yīng)用廣泛的廣譜抗生素，對大多數(shù)霉菌感染都有良好的抑制作用[1，2]。研究表明，人體吸收過量的CAP 會導(dǎo)致再生障礙性貧血、白血病和灰嬰綜合征等疾病[3]。CAP 在許多國家已被禁止使用，在我國也被禁止用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖[4]。然而，由于CAP 的低成本和廣譜性，現(xiàn)在仍然被廣泛使用[5]。因此，建立一種快速、靈敏及簡便的定量檢測CAP 的新方法具有十分重要的意義。目前，CAP 的定量分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、拉曼散射法[9]和基于抗體技術(shù)分析法[10]等。然而，在這些分析方法中，拉曼散射法和基于抗體技術(shù)分析法檢測過程復(fù)雜、耗時長，GC-MS 法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員，高效液相色譜法在復(fù)雜樣品中分離效果不理想，檢測特異性相對較差，不適合對CAP 進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測。

核酸適配體(aptamer)是通過體外篩選技術(shù)得到的一段可與目標(biāo)物特異性結(jié)合的寡核酸片段[11～15]。隨著核酸適配體技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，很多物質(zhì)的適配體被篩選出來[16，17]。CAP 特異性適配體于2011年被Mehta 等人[18]篩選出來，并成功地應(yīng)用于CAP的檢測中[19，20]。與已有的CAP 檢測方法相比，基于核酸適配體的CAP 檢測方法具有選擇性好、準(zhǔn)確度高、操作簡單及檢測成本低等優(yōu)點(diǎn)。

SYBR Green Ⅰ(SG-Ⅰ)是一種可與雙鏈DNA無選擇性結(jié)合的核酸染料[21]，毒性低、穩(wěn)定性好，在水溶液中背景信號較低，與單鏈DNA 幾乎不發(fā)生作用，而與雙鏈DNA 作用后產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號，常用于無標(biāo)記熒光分析檢測中[22]。

基于上述工作，本文利用熒光染料ROX 標(biāo)記的CAP 核酸適配體及核酸染料SG-Ⅰ構(gòu)建了一種比率型熒光探針，并利用該熒光探針實(shí)現(xiàn)了對CAP 高選擇性的定量檢測。與利用單一熒光信號建立的檢測方法相比，本方法具有兩個主要的優(yōu)勢：第一，利用高靈敏的核酸染料SG-Ⅰ產(chǎn)生熒光信號，可顯著提高方法的靈敏度，降低檢出限，適合低濃度CAP 的定量檢測；第二，利用兩種熒光信號的比值實(shí)現(xiàn)CAP 的定量檢測，可顯著減少環(huán)境因素對檢測結(jié)果的干擾，從而提高檢測結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

所有的熒光數(shù)據(jù)和熒光光譜均由RF-5301PC型熒光光譜儀(Shimadzu 公司)測定和采集；緩沖溶液的pH 值由PHS-3C 型pH 計(jì)(INESA 公司)測定。核酸染料SG-Ⅰ（用二甲基亞砜DMSO 配制的10 000倍濃縮液）由上海瑞安生物技術(shù)有限公司提供；氧化石墨烯（GO）購于中科院成都有機(jī)化學(xué)研究所。

實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純，購自中國國藥化學(xué)試劑有限公司；CAP 核酸適配體PLV 與有機(jī)猝滅基團(tuán)標(biāo)記且與CAP 核酸適配體部分互補(bǔ)的單鏈DNA（PC）均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成并用高效液相色譜法純化，PLV 的3′端標(biāo)記熒光染 料6-carboxy-x-rhodamine（ROX），PC 的5′端 標(biāo)記猝滅基團(tuán)Black Hole Quencher 2（BHQ-2）。其核酸的堿基序列如下：

1.2 樣品的制備及檢測

基于比率型熒光探針檢測CAP 的樣品配制中，用0.1 mol/L 的Tris-HCl(pH 7.7)緩沖溶液將CAP配制成不同濃度的溶液，并放置于4 °C 下冷藏備用；用0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液分別將PLV和PC配制成1×10-7mol/L 和1.2×10-7mol/L 的溶液備用；用Tris-HCl 緩沖溶液將核酸染料SG-Ⅰ稀釋10 000 倍得到SG-Ⅰ工作液，放置于4 °C 下儲存?zhèn)溆?。樣品制備時，分別取50 μL 配制好的CAP和PLV溶液于離心管中，然后加入50 μL 的PC 溶液與50 μL 的SG-Ⅰ工作液，并補(bǔ)充緩沖溶液至總體積為500 μL，在溫度為37 °C 的水浴鍋中反應(yīng)30 min，冷卻到常溫后對其進(jìn)行同步熒光分析。在進(jìn)行同步熒光分析時，初始激發(fā)波長設(shè)置為454 nm，同步掃描的波長間隔(Δλ)設(shè)置為26 nm，熒光檢測范圍為480～700 nm，激發(fā)光狹縫的寬度設(shè)置為10 nm，發(fā)射光狹縫的寬度設(shè)置為5 nm。SG-Ⅰ和ROX 的最大發(fā)射波長分別為525 nm 和613 nm，在進(jìn)行定量分析時所使用的數(shù)據(jù)為SG-Ⅰ和ROX 的最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度。

基于GO 猝滅的單色熒光樣品的配制中，用0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液(pH 7.7)將PLV 配制成1.4×10-7mol/L 濃度。樣品制備時，分別取50 μL配制好的PLV 溶液和10μL濃度為0.5 mg/mL 的GO 溶液于離心管中，在室溫下孵育10 min，然后加入50 μL 的CAP 溶液，補(bǔ)充Tris-HCl 緩沖溶液至總體積為500 μL，在37 °C 的水浴鍋中反應(yīng)30 min 后，冷卻到常溫后對其進(jìn)行同步熒光分析。在進(jìn)行同步熒光分析時，初始激發(fā)波長設(shè)置為536 nm，同步掃描的Δλ設(shè)置為28 nm，熒光檢測范圍為564～670 nm，激發(fā)光狹縫的寬度設(shè)置為10 nm，發(fā)射光狹縫的寬度設(shè)置為5 nm。在進(jìn)行定量分析時所使用的數(shù)據(jù)為ROX 最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度。

1.3 實(shí)際樣品的處理與檢測

主要對CAP 純牛奶和滴眼液中CAP 的含量進(jìn)行測定。1）對于純牛奶中CAP 的檢測。取5 mL純牛奶置于10 mL 離心管中，加入5 mL 乙酸乙酯后進(jìn)行振蕩，然后離心10 min (4 000 r/min)，取上清液，再加入5 mL 乙酸乙酯重復(fù)上述操作兩次。將收集的上清液用氮?dú)獯蹈?，然后?.01 mol/L 的Tris-HCl(含10%甲醇)定容至100 mL，再用本方法進(jìn)行檢測。2）對于CAP 滴眼液中CAP 的檢測。根據(jù)其說明書中標(biāo)注的濃度，在本實(shí)驗(yàn)可檢測濃度范圍內(nèi)，用Tris-HCl 緩沖溶液將樣品稀釋成3 組不同濃度的溶液，然后分別用本方法進(jìn)行檢測，計(jì)算檢測結(jié)果的平均值并與說明書中標(biāo)注的濃度進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

利用PLV、PC 及SG-Ⅰ檢測CAP 的基本原理如圖1 所示。其中，CAP 核酸適配體的3′端標(biāo)記了熒光染料ROX，與CAP 核酸適配體部分互補(bǔ)的單鏈DNA 的5′端修飾了猝滅基團(tuán)BHQ-2。當(dāng)體系中不存在CAP 時，PLV 與PC 通過堿基互補(bǔ)配對形成雙鏈DNA，熒光染料ROX 與猝滅基團(tuán)BHQ-2 相互靠 近，ROX 的熒光被BHQ-2 猝滅，ROX的熒光信號很弱，但形成的雙鏈DNA 與核酸染料SG-Ⅰ結(jié)合，使SG-Ⅰ的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，此時IROX/ISG-Ⅰ較小。當(dāng)體系中存在CAP 時，由于CAP 與PLV 的親和力更強(qiáng)，CAP 優(yōu)先與PLV 結(jié)合形成穩(wěn)定性更好的復(fù)合物，此時PLV 不能與PC 反應(yīng)形成雙鏈DNA，熒光染料ROX 無法靠近猝滅基團(tuán)BHQ-2，熒光不能被BHQ-2 猝滅，ROX 熒光信號很強(qiáng)。另外，由于體系中沒有雙鏈DNA，SG-Ⅰ只能游離于溶液中，其熒光信號很弱，此時IROX/ISG-Ⅰ較大。體系中CAP 的濃度越大，與PLV 結(jié)合形成的復(fù)合物就越多，ROX 的熒光信號就越強(qiáng)，SG-Ⅰ的熒光信號就越弱，IROX/ISG-Ⅰ就越大。根據(jù)體系中加入CAP 后IROX/ISG-Ⅰ的變化即可實(shí)現(xiàn)對CAP 定量分析。

圖1 基于比率型熒光探針檢測CAP 的原理Fig.1 The principle of detection for CAP based on ratiometric fluorescent probe

利用PLV 和GO 對CAP 定量檢測的基本原理如圖2 所示。當(dāng)體系中存在目標(biāo)物CAP 時，CAP 與PLV 結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，PLV 的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致ROX 遠(yuǎn)離GO，ROX 與GO 之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)消失，ROX 的熒光得到恢復(fù)，體系熒光信號很強(qiáng)；當(dāng)體系中不存在目標(biāo)物CAP 時，PLV 中的單鏈DNA 與GO 通過強(qiáng)烈的π-π 堆疊作用使PLV 吸附在GO 的表面[23]，標(biāo)記在PLV 上的熒光染料ROX 靠近GO，其熒光通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方式被GO 猝滅，體系熒光信號很弱。據(jù)此，通過體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)的程度即可實(shí)現(xiàn)CAP 的定量分析。

圖2 基于核酸適配體與GO 檢測CAP 的原理Fig.2 The principle of detection for CAP with aptamer and GO

2.2 方法的可行性分析

圖3 為基于比率型熒光探針檢測CAP 分析法中，PLV 與不同濃度的CAP 反應(yīng)后，體系中核酸染料SG-Ⅰ和熒光染料ROX 的同步熒光光譜圖。結(jié)果表明，當(dāng)體系中不存在CAP 時，熒光染料ROX 的熒光信號很弱而核酸染料SG-Ⅰ的熒光信號很強(qiáng)；當(dāng)體系中存在CAP 時，熒光染料ROX 的熒光信號顯著增強(qiáng)而SG-Ⅰ的熒光信號明顯減弱。體系中CAP 的濃度越大，熒光染料ROX 熒光信號就越強(qiáng)，SG-Ⅰ的熒光信號就越弱，這說明利用該方法對CAP 進(jìn)行定量檢測是可行的。

圖3 不同濃度的CAP 所對應(yīng)體系的同步熒光光譜Fig.3 The synchronous fluorescence spectra of system at different concentrations of CAP

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

核酸染料SG-Ⅰ工作液的加入量對檢測結(jié)果具有很大影響。根據(jù)檢測CAP 的原理，SG-Ⅰ工作液應(yīng)該保持相對過量，但過量太大又會產(chǎn)生一定的背景熒光，因此本實(shí)驗(yàn)對SG-Ⅰ工作液的體積進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4 所示，當(dāng)SG-Ⅰ工作液的體積小于50 μL 時，SG-Ⅰ的熒光強(qiáng)度隨體積的增加而增強(qiáng)；當(dāng)SG-Ⅰ工作液的體積達(dá)到50 μL 后，再增加SG-Ⅰ工作液的體積，其熒光強(qiáng)度幾乎不再變化。這說明在PLV 的濃度為1×10-8mol/L，PC 的濃度為1.2×10-8mol/L 時，SG-Ⅰ工作液的體積達(dá)到50 μL 時即可滿足本實(shí)驗(yàn)的需求。本實(shí)驗(yàn)所有樣品中SG-Ⅰ工作液的體積均選擇為50 μL。

圖4 SG-Ⅰ工作液體積的影響Fig.4 Effect of working solution volume of SG-Ⅰ

PLV 與CAP 的反應(yīng)時間直接影響著PLV 與CAP 配位反應(yīng)的程度，因此本實(shí)驗(yàn)考察了PLV 與CAP 配位反應(yīng)的時間。如圖5 所示，當(dāng)反應(yīng)時間在10～30 min 之間時，IROX/ISG-Ⅰ隨著反應(yīng)時間的增加逐漸增大；當(dāng)反應(yīng)時間超過30 min 后，IROX/ISG-Ⅰ基本保持不變。這表明在30 min 之內(nèi)，PLV 與CAP 配位反應(yīng)已基本完成。因此本實(shí)驗(yàn)所有樣品中PLV與CAP 的反應(yīng)時間均選擇為30 min。

圖5 反應(yīng)時間對IROX/ISG-Ⅰ的影響Fig.5 Effect of reaction time on IROX/ISG-Ⅰ

緩沖體系的pH 值會直接影響熒光染料ROX和核酸染料SG-Ⅰ的熒光強(qiáng)度，同時也會影響PLV與CAP 的配位反應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)考察了緩沖溶液的pH 值。如圖6 所示，當(dāng)緩沖體系的pH 值在6.8～7.7 之間時，IROX/ISG-Ⅰ隨 著pH 值的增加逐漸增大；當(dāng)pH 值大于7.7 時，IROX/ISG-Ⅰ隨著pH 值的增加逐漸減弱。因此，本實(shí)驗(yàn)中緩沖溶液的pH 值為7.7 時效果最好。

圖6 pH 值對IROX/ISG-Ⅰ的影響Fig.6 Effect of pH value on IROX/ISG-Ⅰ

反應(yīng)體系中溶液的離子強(qiáng)度會影響PLV 與CAP 形成配合物的穩(wěn)定性，因此本實(shí)驗(yàn)通過加入不同濃度的NaNO3溶液，考察了溶液離子強(qiáng)度對檢測結(jié)果的影響。如圖7 所示，當(dāng)NaNO3濃度低于60mmol/L 時，IROX/ISG-Ⅰ隨著NaNO3濃度的增大而 增大；當(dāng)NaNO3濃度大于60 mmol/L 時，IROX/ISG-Ⅰ趨于穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇NaNO3溶液的濃度為60 mmol/L。

圖7 NaNO3濃度對IROX/ISG-Ⅰ的影響Fig.7 Effect of NaNO3 concentration on IROX/ISG-Ⅰ

2.4 工作曲線及檢出限

在優(yōu)化條件下，考察了IROX/ISG-Ⅰ與CAP 濃度之間的關(guān)系。圖8（a）為不同濃度CAP 所對應(yīng)體系中ROX 及SG-Ⅰ的同步熒光光譜圖，圖8（b）為ROX與SG-Ⅰ在最大發(fā)射波長處熒光強(qiáng)度的比值（IROX/ISG-Ⅰ）與CAP 濃度c（mol/L）之間擬合的回歸曲線圖。結(jié)果表明，在CAP 濃 度 為2×10-10～100×10-10mol/L 范圍內(nèi)，IROX/ISG-Ⅰ隨CAP 濃度的增大而增大，擬合的回歸方程為IROX/ISG-Ⅰ=0.072e0.055c(相關(guān)系數(shù)R=0.993)。將空白樣品平行測定11 次，分別計(jì)算ROX 和SG-Ⅰ熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，再將它們標(biāo)準(zhǔn)偏差比值的3 倍代入上述回歸方程，計(jì)算得到方法的檢出限為8×10-11mol/L。對9 個濃度均為1×10-9mol/L 的平行樣品進(jìn)行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.05%，說明該方法具有良好的精密度。

圖8 (a)不同濃度CAP 所對應(yīng)體系中ROX 與SG-Ⅰ的同步熒光光譜圖；(b)IROX/ISG-Ⅰ與CAP 濃度之間擬合的回歸曲線Fig.8 (a)The synchronous fluorescence spectra of ROX and SG-Ⅰin the system with different concentrations of CAP;(b)the fitting regression curve between IROX/ISG-Ⅰand the concentration of CAP

2.5 與單色熒光定量檢測的比較

利用PLV 和GO 建立單色熒光定量檢測CAP的方法，并與比率型熒光探針進(jìn)行比較。首先對單色熒光定量檢測CAP 方法的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳檢測條件為：GO 的濃度為10 μg/mL，PLV 與CAP 的反應(yīng)時間為30 min，緩沖溶液的pH 值為7.7，緩沖溶液中NaNO3的濃度為60 mmol/L。然后，在優(yōu)化的條件下，考察了ROX 熒光強(qiáng)度的變化值ΔI(ΔI=I-I0，I為CAP 存在時ROX 的熒光強(qiáng)度，I0為CAP 不存在時ROX 的熒光強(qiáng)度)與CAP 濃度之間的關(guān)系。圖9(a)為不同濃度CAP 所對應(yīng)體系中ROX 的同步熒光光譜圖，圖9(b)為ROX 最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度與CAP 濃度之間的線性關(guān)系。結(jié)果表明，CAP濃度在2.8×10-10～140×10-10mol/L 范圍內(nèi)，ROX 熒光強(qiáng)度的變化值與CAP 濃度之間具有良好的線性關(guān)系，擬合工作曲線的回歸方程為ΔI=6.776c+0.574 (R2=0.998)。將空白樣品平行測定11 次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，用3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以工作曲線的斜率得方法檢出限為1.6×10-10mol/L；對9 個濃度均為1×10-9mol/L的平行樣品進(jìn)行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.52%，說明該方法也具有較好的精密度，但與比率熒光分析法較差。

圖9 (a)不同濃度CAP 所對應(yīng)體系中ROX 的同步熒光光譜；(b)ROX 的熒光強(qiáng)度與CAP 濃度之間的線性關(guān)系Fig.9 (a)The synchronous fluorescence spectra of ROX in the system with different concentrations of CAP;(b)the linear relationship between the fluorescence intensity of ROX and the concentration of CAP

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步地比較兩種方法的準(zhǔn)確性。分別用兩種方法對加入牛奶樣品中CAP 標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行檢測。取4 份相同的純牛奶樣品，按1.3 節(jié)中的步驟對純牛奶處理后，按表1 所示加入不同濃度的CAP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后分別用單色熒光分析法（A1～A4）及比率熒光分析法(B1～B4)進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率。結(jié)果（表1）表明，比率熒光分析法的RSD 更小，回收率更接近100%，這說明在復(fù)雜的檢測環(huán)境中，比率熒光分析法對CAP 的檢測重復(fù)性更好，準(zhǔn)確度更高。

表1 采用兩種檢測方法測定牛奶中CAP 的含量(n=3)Table 1 Determination of CAP in milk using two assay methods (n=3)

2.7 特異性分析

為了考察方法的特異性，本實(shí)驗(yàn)選擇與CAP 性質(zhì)相近的幾種抗生素:卡那霉素(kanamycin)、甲砜霉素(thiamphenicol)、土 霉 素(oxytetracycline)、四 環(huán) 素(tetracycline)、鏈霉素(streptomycin),進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。分別配制1×10-6mol/L 的各種抗生素溶液，在最優(yōu)條件下使用比率熒光分析CAP 的方法進(jìn)行檢測。如圖10 所示，在其他抗生素濃度遠(yuǎn)高于CAP 濃度（1×10-8mol/L）的情況下，體系中ROX 的熒光信號很弱，而SG-Ⅰ的熒光信號很強(qiáng)，說明該檢測方法具有很高的特異性。

圖10 方法的特異性分析Fig.10 The specificity analysis of the method

2.8 實(shí)際樣品分析

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)對CAP 滴眼液中的CAP 含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，滴眼液中CAP 的含量為2.486 mg/mL，與說明書中標(biāo)注的CAP 含量2.500 mg/mL 基本一致，說明該方法對實(shí)際樣品的檢測具有較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)基于PLV、PC 及核酸染料SG-Ⅰ構(gòu)建了一種比率型熒光探針，并利用該探針建立了一種CAP 的定量檢測新方法。與單色熒光定量檢測CAP 的方法相比，該方法重復(fù)性更好、檢出限更低、準(zhǔn)確度更高。同時，該方法操作簡單、檢測時間短，能用于實(shí)際樣品中CAP 的分析與檢測。