陸峰 安妮妮 陳輝 何國慶 占雄 吳謀東 汪丹 王蔚 彭金普

隱睪癥是常見的先天性泌尿生殖系統(tǒng)畸形，在足月男嬰中的發(fā)病率高達(dá)3%～4%[1]。隱睪已成為男性不育的重要原因。早期睪丸固定術(shù)或激素治療能使隱睪睪丸降至陰囊內(nèi)，但不能有效恢復(fù)患者的生精功能[2-3]。視黃酸(retinoic acid, RA)是維生素A在體內(nèi)氧化代謝的一類具有生物活性的產(chǎn)物，具有維持雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育和正常的作用[4]。研究證實，RA及其受體是精子發(fā)生的重要因素，缺乏維生素A的動物精子生成過程停止，大多數(shù)生殖細(xì)胞被降解，但RA治療可恢復(fù)生精過程[5]。近期研究證實，微小RNA(micro RNAs, miRNAs)在男性不育等相關(guān)疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用。例如，miR-4485-3p在特發(fā)性弱精子癥男性精子中低表達(dá)，并可能是線粒體功能障礙與弱精子癥的關(guān)鍵分子[6]。MiR-509-5p與男性不育呈負(fù)相關(guān)，在伴有成熟停滯的不育男性中低表達(dá)，可抑制睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞體外增殖，并促進(jìn)凋亡[7]。此外，有研究證實，RA可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)影響疾病的發(fā)展進(jìn)程[8-9]。本研究通過構(gòu)建氟他胺致隱睪小鼠模型，探討RA對隱睪生精細(xì)胞增殖分化及對隱睪組織中miR-210表達(dá)的影響及機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑

氟他胺及RA購于美國Sigma公司。一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司。RT-qPCR引物購于北京金唯智生物技術(shù)有限公司。Trizol試劑和RIPA裂解液購于南京KeyGEN公司。C-kit和PLZF一抗、HRP標(biāo)記的二抗購于美國Abcam公司。

二、研究方法

1.隱睪小鼠模型構(gòu)建及分組：所有BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后將雌雄小鼠按2：1比例合籠，隨機(jī)分為：正常對照組(Control組)、氟他胺組(Flu組)、視黃酸治療組(RA組)、Flu+miR-210敲降組、Flu+miR-210過表達(dá)組及Flu+miR-210過表達(dá)+RA組，每組各10只。合籠后檢測陰栓，以觀察到陰栓之日為妊娠0 d。從妊娠后12～21 d每天給孕鼠灌胃，700 mg/kg。判斷標(biāo)準(zhǔn)：幼鼠出生后4周觀察幼鼠有無陰囊或睪丸是否下降至陰囊。在氟他胺組基礎(chǔ)上，將antagomiR-210和agomiR-210通過尾靜脈分別注射至幼鼠體內(nèi)，8 mg/kg。

2. RT-qPCR實驗檢測miR-210、C-kit和PLZF mRNA的表達(dá)水平：使用Trizol試劑提取各組小鼠睪丸組織中的總RNA，使用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將全部RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行RT-qPCR檢測miR-210、C-kit和PLZF mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)程序為：預(yù)變性95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s、45個循環(huán)。以U6和GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法定量。

3. Western blot檢測C-kit和PLZF蛋白的表達(dá)水平：使用RIPA裂解液提取各組小鼠睪丸組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以30 μg/孔上樣量行10% SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶2 000稀釋好一抗，4℃過夜孵育；次日，棄一抗，加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，最后在凝膠成像儀上進(jìn)行曝光拍照，Image J分析蛋白條帶灰度值。

結(jié) 果

一、RA促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞增殖分化

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，F(xiàn)lu組睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，RA治療后C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯恢復(fù)(圖1A和圖1B)。該結(jié)果說明，RA可促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞增殖分化。

**P<0.01, vs Control group; △△P<0.01, vs Flu group

二、RA下調(diào)隱睪睪丸組織中miR-210的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與Control組相比，F(xiàn)lu組睪丸組織中miR-210表達(dá)水平顯著上調(diào)，而RA治療可回復(fù)氟他胺對miR-210的上調(diào)作用(圖2)。該結(jié)果說明，RA可下調(diào)隱睪睪丸組織中miR-210的表達(dá)水平。

**P<0.01, vs Control group; △P<0.05, vs Flu group

三、敲降miR-210促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞增殖分化

RT-qPCR結(jié)果顯示，與Flu組相比，敲降miR-210顯著下調(diào)隱睪睪丸組織中miR-210的表達(dá)水平(P<0.05，圖3A)。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與Flu組相比較，敲降miR-210組顯著上調(diào)睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05，圖3B和圖3C)。該結(jié)果說明，敲降miR-210可促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞增殖分化。

**P<0.01, vs Flu group

四、RA下調(diào)miR-210促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞增殖分化

RT-qPCR結(jié)果顯示，與Flu組相比，過表達(dá)miR-210組顯著上調(diào)睪丸組織中miR-210的表達(dá)水平，而過表達(dá)miR-210同時用RA治療，可回復(fù)miR-210的表達(dá)水平(圖4A)。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，miR-210過表達(dá)組睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于Flu組(P<0.05)，而RA治療可回復(fù)睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達(dá)水平，即RA治療可回復(fù)過表達(dá)miR-210對隱睪生精細(xì)胞增殖分化的抑制作用(圖4B和C)。該結(jié)果說明，RA可下調(diào)miR-210促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞增殖分化。

**P<0.01, vs Flu group; △P<0.05, △△P<0.01, vs Flu + agomiR-210 group

討 論

精原干細(xì)胞的分裂呈現(xiàn)為邊復(fù)制邊分化的不對稱性，這是雄性哺乳動物能夠連續(xù)不斷進(jìn)行生精過程的基礎(chǔ)[10]。而 PLZF和C-kit是精原干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵基因[11-12]。研究表明，PLZF參與精原干細(xì)胞的自我復(fù)制過程，是維持精原干細(xì)胞數(shù)目不可或缺的因子[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，隱睪睪丸組織(氟他胺組)中PLZF mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯下降，表明隱睪小鼠精原細(xì)胞的自我增殖發(fā)生異常，精原細(xì)胞數(shù)量減少。而使用RA治療后，RA組中PLZF mRNA和蛋白的表達(dá)水平較氟他胺組顯著上調(diào)，這說明RA可促進(jìn)精原細(xì)胞的自我增殖，維持精原細(xì)胞數(shù)量。C-kit即跨膜酪氨酸激酶受體，在精原細(xì)胞分化過程中起著重要作用[14]。近期研究表明，C-kit通過與其配體干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)結(jié)合，可促使精原細(xì)胞進(jìn)行DNA合成，在一定程度上反應(yīng)了精原細(xì)胞分化活動的強(qiáng)弱，是精原細(xì)胞分化的標(biāo)志之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，C-kit在隱睪睪丸組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)，RA治療明顯恢復(fù)其表達(dá)水平。這反映出隱睪精原細(xì)胞分化出現(xiàn)障礙，而RA能上調(diào)C-kit的表達(dá)，促進(jìn)精原細(xì)胞分化。

MiRNAs是一類長約22 nt的單鏈非編碼小RNA，在機(jī)體生理和病理過程發(fā)揮重要調(diào)控作用[16]。研究表明，miRNAs在包括隱睪在內(nèi)的多種男性不育疾病中異常表達(dá)[17]。例如，miR-34c在隱睪患者睪丸組織和隱睪小鼠模型中均顯著下調(diào)，其異常表達(dá)破壞了精原干細(xì)胞的自我更新和分化平衡，最終破壞了隱睪精子的產(chǎn)生[18]。Moritoki等人[19]研究證實，miR-135a-5p在隱睪中低表達(dá)，并通過與叉頭框蛋白O1重組蛋白(Forkhead box transcription factor O1,FOXO1)相互作用參與精原干細(xì)胞的維持。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在隱睪睪丸組織中高表達(dá)，而RA治療可下調(diào)其表達(dá)水平。在隱睪小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)miR-210拮抗劑antagomiR-210后,PLZF和C-kit mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，穩(wěn)定表達(dá)agomiR-210后，PLZF和C-kit mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯低于氟他胺組，而穩(wěn)定表達(dá)agomiR-210后，再進(jìn)行RA治療則可恢復(fù)PLZF和C-kit的表達(dá)水平。這說明，高水平的miR-210能引起精原細(xì)胞增殖和分化異常，而RA治療可下調(diào)隱睪睪丸組織中miR-210的表達(dá)，促進(jìn)PLZF和C-kit的表達(dá)。

綜上所述，miR-210在隱睪睪丸組織中高表達(dá)，RA可下調(diào)miR-210的表達(dá)，并通過miR-210促進(jìn)隱睪生精細(xì)胞的增殖和分化。