方 劍， 王 惠， 馮政軒， 汪泓成， 樊子怡

(1)紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江紹興 312000；2)紹興市人民醫(yī)院肛腸外科， 浙江紹興 312000;3)浙江中醫(yī)藥大學護理學院， 杭州 310000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性復發(fā)性炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，以持續(xù)緩解和復發(fā)為特征，目前在世界各地非常常見，特別是亞洲國家發(fā)病率快速上升[1]。臨床上常使用抗炎或免疫制劑藥物治療UC，通常不能維持長期的臨床緩解。大量研究顯示，UC患病30年時腸癌患病率從患病20年的5%～10%躍升至12%～30%[1]，而且UC患者腸癌發(fā)病年齡低(<20歲)、預后差，發(fā)現(xiàn)時多已是癌癥晚期。但目前通常忽視維持緩解治療的重要性，顯著增加了結腸炎復發(fā)和結、直腸癌的發(fā)病風險[2]。為此，尋求能有效維持緩解治療UC，對提高患者生活質(zhì)量，預防腸癌具有重要意義。

n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)主要來源于海產(chǎn)魚類，是魚油的主要成分，其成員主要包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)[3]。近年來，大量研究表明，n-3 PUFAs在控制UC發(fā)生[4]、發(fā)展中發(fā)揮積極作用[5]，n-3 PUFAs干預有望成為UC輔助治療措施[6]。目前，關于n-3 PUFAs與維持緩解治療UC的效果尚無明確答案，影響了n-3 PUFAs的臨床應用。本研究以葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)構建急性期腸炎小鼠模型(誘導期)和慢性期腸炎小鼠模型(緩解期)，比較魚油對急慢性期腸炎小鼠的影響，并從結腸黏膜機械屏障和炎癥通路活化，以及腸道菌群等角度深入挖掘魚油對急慢性期腸炎小鼠的差異調(diào)控，為探索誘導緩解和維持緩解治療UC提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠60只上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于紹興文理學院附屬第一醫(yī)院實驗動物中心SPF級實驗室。溫度(24±3)℃，相對濕度(50±5)%，噪聲強度≤60 dB，每12 h明暗更替，小鼠自由攝水取食，隔日更換墊料和飲水瓶。動物飼養(yǎng)及使用符合紹興文理學院附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會的相關規(guī)定并獲得允許。

1.2 材料

高純度魚油訂購于上海互眾藥業(yè)有限公司，魚油中總n-3 PUFAs含量為98.05%，其中DHA含量為47.25%，EPA含量為48.24%。分子量為36 000～50 000的DSS(美國MP Biomedicals公司)；糞便飲血試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；Claudin1、Oclaudin、ZO1、MCT1、GPR43、CPT1A、CPT2、CS、LDH和β-肌動蛋白抗體(英國Proteintech公司)。

1.3 動物模型建立和治療方案

參考《Nature Protocols》的方法建立DSS誘導的小鼠結腸炎模型[7]，具體操作如下：誘導緩解模型組小鼠接受2% DSS水自由飲水1周，換無菌水持續(xù)3 d；維持緩解模型組小鼠接受2% DSS水自由飲水1周，換無菌水持續(xù)2周，再自由飲用2% DSS水1周，最后換無菌水持續(xù)1周。治療方案如下：將60只8周齡的C57BL/6J分為急性期空白對照組、誘導緩解模型組、誘導緩解魚油組、慢性期空白對照組、維持緩解模型組和維持緩解魚油組，每組10只。急性期腸炎小鼠：誘導緩解魚油組小鼠給予4周魚油灌胃(400 mg/kg·bw魚油阿拉伯膠)，其中急性期空白對照組和誘導緩解模型組小鼠給予10%阿拉伯膠灌胃。之后，除急性期空白對照組外，誘導緩解模型組和誘導緩解魚油組小鼠接受2% DSS水自由飲水1周，換無菌水持續(xù)3 d。在急性建模期間，急性期空白對照組和誘導緩解模型組小鼠繼續(xù)給予每天10%阿拉伯膠灌胃，誘導緩解魚油組小鼠繼續(xù)給予400 mg/kg·bw魚油阿拉伯膠灌胃。慢性期腸炎小鼠：慢性期魚油組小鼠給予4周魚油灌胃(400 mg/kg·bw魚油阿拉伯膠)，其中慢性期空白對照組和維持緩解模型組小鼠給予10%阿拉伯膠灌胃。之后，除慢性期空白對照組外，維持緩解模型組和維持緩解魚油組小鼠接受2% DSS水自由飲水1周，接著換無菌水持續(xù)2周；再自由飲用2% DSS水1周，最后換無菌水持續(xù)1周。在慢性建模期間，慢性期空白對照組和維持緩解模型組小鼠繼續(xù)給予每天10%阿拉伯膠灌胃，維持緩解魚油組小鼠繼續(xù)給予400 mg/kg·bw魚油阿拉伯膠灌胃，實驗分組見Fig.1A所示。在造模期間每日記錄小鼠體重，從小鼠體重下降、糞便性狀及便血情況進行疾病活動指數(shù)計算。結束實驗后，留取糞便、血清和結腸組織樣本。

1.4 小鼠糞便、組織樣本采集與處理

收集新鮮小鼠糞便50～100 mg(約2～3粒)，置于無菌離心管，封口后于-80 ℃保存，用于糞便中短鏈脂肪酸及16 S rRNA擴增子檢測。通過摘除眼球收集小鼠外周血到無菌離心管，經(jīng)4 ℃，1 000 g離心15 min，獲得的上清用于炎癥指標分析。小鼠經(jīng)頸椎脫臼后，行腹部消毒，解剖小鼠獲得回盲部到肛門的完整結腸，測量結腸重量和長度。用預冷的生理鹽水漂洗掉結腸中血液及污物，取一小段結腸入10%福爾馬林溶液固定，用于H&E(haematoxylin eosin, H&E)染色；剩余部分裝到無菌無酶EP管中后入液氮，最后保存在-80 ℃冰箱，用于結腸中脂肪酸含量和Western印跡檢測。

1.5 氣相色譜法檢測小鼠糞便中短鏈脂肪酸及結腸中脂肪酸含量

稱取約2 g小鼠糞便(每組10只)，加10 mL無菌去離子水，漩渦振蕩10 min，12 000 r/min離心30 min，取上清，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾2次，取500 μL過濾液待機檢測，GC條件參考趙亞婷等人的報道[8]。將小鼠組織解凍，稱取約50 mg于離心管，在液氮中充分碾磨，4 ℃過夜浸提。加0.9% NaCl 1 mL，分層后保留氯仿層，加1 mL正己烷和1 mL 14%三氟化硼/甲醇溶液，入金屬浴90～110 ℃加熱1 h。冷卻后，加1 mL去離子水，2 000 r/min離心5 min，取上清，于30 ℃氮吹儀吹干，加200 μL正己烷，上機檢測。

1.6 小鼠結腸組織H&E染色

對充分固定的結腸組織進行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、貼片、烤片、脫蠟復水、H&E染色、梯度脫水、透明和樹膠封片，委托臨床病理中心專家全盲閱片，并參考方劍等人發(fā)表的論文中小鼠結腸炎組織學評分標準進行評分[9]。

1.7 Western 印跡檢測

稱取100 mg結腸組織于液氮中，加組織裂解液200 μL，用組織勻漿機充分碾磨組織，漩渦振蕩后，冰水浴30 min，4 ℃離心20 000 g 20 min，按照細胞核蛋白質(zhì)中與細胞漿蛋白質(zhì)抽提試劑盒說明書(碧云天生物技術有限公司)提取蛋白質(zhì)。用Bio-Rad DC蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad生物公司)測定蛋白質(zhì)濃度。按《分子克隆實驗指南(第四版)》中的方法，以5%濃縮膠和12%分離膠電泳。

1.8 腸道微生物16 S rRNA擴增子測序

將小鼠糞便樣本(每組5只)委托南京集思慧遠生物科技有限公司進行高通量16 S rRNA擴增子測序，用簡并引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTRAGTTT-3′)對16 S rRNA基因的可變區(qū)V4～V5進行PCR擴增。對最終文庫的擴增子于Illumina HiSeq 2500上機測序，獲得fastq格式數(shù)據(jù)由本課題組進行下游分析。用VSEARCH中fastq_mergepairs seq對雙端序列進行合并，然后用fastx_filter temp切除上下游引物，derep_fulllength temp對序列去冗余。之后用USEARCH的unoise3 temp去噪，VSEARCH中的uchime_ref temp進一步去嵌合，接著用USEARCH中的usearch_global temp命令基于UPARSE算法按97%相似度聚類為可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。最后基于SILVA數(shù)據(jù)庫去除質(zhì)體、非細菌和古菌，此外使用VSEARCH中的sinta命令進行物種注釋(sintax_cutoff=0.6)?；谒@得的OTU表可在R 4.1.2環(huán)境下實現(xiàn)alpha多樣性分析、beta多樣性分析、PICRUSt功能預測及組間差異等分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 魚油對維持緩解期腸炎小鼠的抗炎作用優(yōu)于誘導緩解期腸炎小鼠

2.1.1 誘導緩解與維持緩解腸炎小鼠模型構建的確定 通過監(jiān)測小鼠體重變化、疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)和結腸長度與水腫程度結果見Fig.1，相比于空白對照組，急性期模型組小鼠在實驗周期第5 d和第10 d DAI評分明顯升高(P<0.01)；慢性期模型組小鼠在實驗周期第10 d、24 d和第32 d DAI評分顯著升高(P<0.05)。急慢性小鼠模型組結腸充血、水腫均高于空白對照組。此外，實驗周期結束時，對小鼠結腸組織進行H&E染色發(fā)現(xiàn)(Fig.2)，相比于空白對照組，急慢性模型組小鼠組織病理學評分顯著提高(P<0.01)。血清學檢測結果同樣證實急慢性模型組中促炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6顯著高于空白對照組(P<0.01)，抗炎因子IL-10的表達水平明顯低于空白對照組(P<0.01)。可見，已成功構建誘導緩解與維持緩解腸炎小鼠模型。

2.1.2 魚油對急慢性期腸炎小鼠結腸組織脂肪酸構成存在差異 取各組結腸組織進行氣相色譜(gas chromatography, QC)法檢測結腸組織脂肪酸組成，結果正如Fig.1E。急慢性期空白對照組和模型對照組全程無魚油干預，4組小鼠結腸n-3 PUFAs含量差別無統(tǒng)計學意義。與模型對照組相比，急慢性期魚油組n-3 PUFAs含量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；慢性期魚油干預組小鼠結腸中n-3 PUFAs含量高于急性期魚油干預組(P<0.05)。說明魚油干預可提高小鼠結腸中n-3 PUFAs含量，且干預時間越長富集效果越好。與模型對照組相比，急慢性期魚油組結腸中的DHA和EPA富集程度提高(P<0.01)，其中慢性期魚油組小鼠結腸中DHA和EPA含量高于急性期魚油干預組(P<0.05)，值得注意的是慢性期魚油組小鼠結腸中EPA含量高于DHA。與模型對照組和急性期魚油組相比，慢性期魚油組花生四烯酸(arachidonic acid, AA)含量最低(P<0.01)。與空白對照組相比，急性期模型組AA含量顯著升高(P<0.01)?？梢?，魚油可顯著提高急慢性期腸炎小鼠結腸組織中n-3 PUFAs、DHA和EPA含量，本文推測，魚油富集程度可能與干預時間相關；同時魚油能有效降低小鼠結腸組織中AA含量。

2.1.3 從疾病活動指數(shù)分析魚油緩解急慢性期腸炎小鼠結腸組織炎癥存在差異 整個實驗周期內(nèi)各組小鼠體重變化監(jiān)測結果正如Fig.1B和Table 1，急慢性期空白對照組全程體重無較大波動，呈平穩(wěn)增長；與急性期空白對照組相比(28.23 ± 0.15 g)，急性期模型組DSS飲水第5 d小鼠體重(24.2 ± 0.09 g)大幅度降低(P<0.01)，急性期魚油組體重(25.34 ± 0.11 g)顯著下降(P<0.05)；DSS飲水結束，自由飲水第3 d，急性期模型組體重(20.44 ± 0.20 g)降低仍然明顯(P<0.01)，急性期魚油組(21.63 ± 0.13 g)也明顯下降(P<0.05)。與慢性期空白對照組相比，慢性期模型組在實驗周期第10 d、24 d和32 d小鼠體重下降程度最明顯(P<0.01)；慢性期魚油組在實驗周期第10 d、24 d和32 d小鼠體重也呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05)，但小鼠體重下降程度低于慢性期模型對照組，體重恢復速度快于慢性期模型對照組。相比于急性期魚油組，慢性期魚油組隨著干預時間延長，DSS引起小鼠體重丟失的程度逐漸減少，體重恢復速度明顯加快。

計算各組小鼠體重丟失典型時間點的DAI變化趨勢結果見Fig.1D。與急性期模型組相比，急性期魚油干預組在實驗周期第5 d和第10 d小鼠DAI評分明顯降低(P<0.01)；與慢性期模型組相比，慢性期魚油干預組在實驗周期第10 d、24 d和第32 d小鼠DAI評分明顯降低(P<0.01)，且隨著魚油干預時間延長，DAI下降幅度越明顯(P<0.01)。在構建腸炎小鼠模型中，DSS會引起小鼠結腸充血、水腫及結腸變短，結果由圖Fig.1C所示，急慢性期模型組小鼠結腸長度短于空白對照組(P<0.01)，而結腸重量/長度比值高于空白對照組(P<0.05)；急性期魚油組小鼠結腸長度和結腸重量/長度比值與急性期模型組無差異；慢性期魚油組小鼠結腸長度長于慢性期模型(P<0.01)，結腸重量/長度比值低于慢性期模型組(P<0.05)；與急性期魚油組相比，慢性期魚油組小鼠能顯著增長結腸長度(P<0.01)，降低結腸重量/長度比值(P<0.05)。相比于空白對照組，急慢性模型組小鼠體重顯著降低、疾病活動指數(shù)和結腸長度與水腫程度顯著升高。魚油干預則能有效改善慢性期腸炎小鼠結腸長度，降低小鼠疾病活動指數(shù)。

Fig.1 Effects of fish oil on DSS-induced colitis in mice (A) Experimental protocol. The acute DSS group and acute DSS+FO group were exposed to 2.0% DSS (weight/ volume) drinking and and three days of water drinking. Then the chronic DSS group and chronic DSS+FO group intervened by fish oil was exposed to two cycles of 2.0% DSS (weight/ volume) drinking, while the control group was given autoclaved distilled water. During this time, fish oil intervention continued. To be more specific, the first DSS cycle consisted of 7 days of DSS drinking followed by 14 days of water drinking, and second DSS cycle contained 7 days of DSS drinking and 7 days of water drinking. (B) Body weight loss of mice. (C) Colon length and colon weight per unit length. Mice were sacrificed at the end of experiment, the length and weight of colon segment were measured. (D) DAI scores. The mice were weighed every day and monitored for weight loss, stool consistency and rectal bleeding to calculate disease activity index (DAI) score, which is commonly used to evaluate the severity of colitis. (E) The content of long chain polyunsaturated fatty acids in the colon of mice (*P<0.05,**P<0.01, compared with the control group.#P<0.05,##P<0.01, compared with the DSS model group.&P<0.05,&&P<0.01, compared with the acute DSS+FO group). At the end of the experiment, fatty acid profiles in colonic samples were analyzed by gas chromatography

2.1.4 組織病理學分析魚油緩解急慢性期腸炎小鼠結腸組織炎癥存在差異 對小鼠結腸組織的隱窩形態(tài)、組織損傷和炎癥細胞浸潤等方面進行組織病理學評分，結果見圖Fig.2(A, B)。空白對照組小鼠結腸上皮結構清晰完整，隱窩結構排列有序，杯狀細胞顆粒飽滿，無炎性細胞浸潤，黏膜肌層結構正常；模型組小鼠結腸上皮結構紊亂隨著進入慢性期進程逐漸加重，隱窩結構嚴重變形或喪失，杯狀細胞大量耗竭，上皮細胞中彌漫中性粒細胞和單核細胞，在急性期模型組中尤為明顯，并深入肌層；急性期魚油干預組小鼠結腸上皮結構較模型組完整，存在大量中立性細胞浸潤，但不涉及肌層；慢性期中魚油干預組炎癥癥狀逐漸好轉，上皮結構更加有序，炎性細胞偶見，隱窩結構排列有序和杯狀細胞顆粒飽滿。各組小鼠結腸組織學評分有差異(P<0.01)，其中急性期模型組組織學評分最高，其次為慢性期模型組和急性期魚油組，慢性期魚油組最低；與模型組相比，在急慢性期中魚油干預均能有效降低組織學評分(P<0.01)，但慢性期效果優(yōu)于急性期(P<0.01)。

檢測各組小鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10的表達水平(Fig.2B和Table 2)，3種促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6在急性期模型對照組中表達最高，其次為慢性期模型組和急性期魚油組，慢性期魚油組最低；與模型組相比，在急慢性期中魚油干預均能有效降低3種促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平(P<0.05)，但慢性期效果優(yōu)于急性期(P<0.01)。與空白對照組相比，急慢性期模型組抗炎因子IL-10表達水平顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，在急慢性期中魚油干預均能有效提高抗炎因子IL-10的表達水平(P<0.05)，但慢性期效果優(yōu)于急性期(P<0.05)?？梢婔~油干預能有效促進慢性期腸炎小鼠抗炎因子IL-10表達，且抑制抗促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達。

Fig.2 Histopathological analysis and serum inflammtatory factor evaluation in mice with DSS-induced colitis (A) Distal colon specimens were taken and fixed in 4% formalin for 24 hours followed by being embedded in paraffin. The 5 μm tissue sections were prepared and stained with Hematoxylin and eosin (H&E) for histopathological examination of colonic inflammation (×100, scale bar 200 μm). (B) Histological scores and serum inflammatory cytokine levels at the end of the experiment (*P<0.05,**P<0.01, compared with the control group.#P<0.05,##P<0.01, compared with the DSS model group.&P<0.05,&&P<0.01, compared with the acute DSS+FO group). At the end of the experiment, blood samples were collected from the retroorbital sinus after 12 hours of food deprivation, and the serum was isolated from whole blood by centrifuging. The concentrations of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α were quantified by ELISA kits

Table 2 Inflammatory cytokines contents in serum of mice

2.2 魚油顯著增加慢性期腸炎小鼠糞便中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬和益生菌比例

2.2.1 魚油影響急慢性期腸炎小鼠糞便腸道菌群組成存在差異 30個樣品測序共獲得4 050 807條高質(zhì)量有效序列，平均135 027條，每個樣本讀段數(shù)從110 020條到156 023條不等，用USEARCH對高質(zhì)量序列進行去引物、質(zhì)量分析、去冗余和去嵌合體等，以97%相似度進行聚類共獲得982個OTUs。小鼠糞便腸道微生物多樣性分析結果見Fig.3(A, B)，腸炎小鼠腸道菌群受疾病程度和干預的影響。與急性期空白對照組相比，急性期模型組alpha多樣性(ACE指數(shù))顯著下降(P<0.05)；與急慢性期模型組相比，急慢性期魚油組小鼠糞便中ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)無統(tǒng)計學差異；與慢性期空白對照組，慢性期模型組小鼠糞便中ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)無統(tǒng)計學差異。本研究對樣本間Bray-Curtis距離做非限制性主坐標分析(principal coordinate analysis, PCoA)(Fig.3B)，結果顯示，在第一主坐標軸(PCo1)上DSS誘導腸炎導致小鼠糞便微生物組成不同，這是本研究中最主要的微生物差異來源。魚油干預是導致第二主坐標軸(PCo2)上樣本糞便微生物組差異的主要因素，急性期魚油組和慢性期魚油組在第二軸上的位置不一致，慢性期魚油組與急慢性空白對照組位置比較接近，提示魚油干預可更有效影響慢性期腸炎小鼠糞便腸道菌群，使其微生物組組成更接近正常小鼠。

在微生物分類的目水平分析可見，各組主要由擬桿菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、乳桿菌目(Lactobacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)和紅蝽菌目(Coriobacteriales)組成。與空白對照組相比，急慢性期模型組具有產(chǎn)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)的梭菌目比例顯著下調(diào)(P<0.01)，其中慢性期模型組較急性期模型組下調(diào)比例大；與其相反，具有致病性及兼性厭氧的腸桿菌目比例明顯升高(P<0.01)，其中急性期模型組較慢性期模型組上升比例大；與急慢性模型組相比，急慢性魚油組梭菌目和乳桿菌目比例顯著上調(diào)(P<0.01)，其中慢性期魚油組乳桿菌目較急性期魚油組升高比例大(P<0.05)。由此可見：魚油干預可顯著提高慢性期腸炎小鼠糞便中產(chǎn)丁酸鹽和益生菌的相對豐度。

2.2.2 魚油影響急慢性期腸炎小鼠糞便腸道菌群表型存在差異 為進一步了解腸道菌群表型功能的差異，將OTUs進行Bugbase表型預測分析，結果正如Fig.3C。與空白對照組相比，急慢性模型組厭氧菌的相對豐度顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，魚油組厭氧菌豐度明顯升高(P<0.01)；其中慢性魚油組效果優(yōu)于急性魚油組(P<0.05)。與其相反，急慢性模型組需氧菌和兼性厭氧菌的相對豐度顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，魚油組需氧菌和兼性厭氧菌豐度明顯下降(P<0.01)；其中慢性魚油組效果優(yōu)于急性魚油組(P<0.05)。有趣的是，給予魚油干預后，小鼠糞便中革蘭氏陽性菌相對豐度增加，而與致病菌和生物膜形成能力顯著下調(diào)(P<0.01)；其中慢性魚油組效果優(yōu)于急性魚油組(P<0.05)。

Fig.3 Effects of fish oil on the gut microbiota diversity and composition (A, B) Alpha diversity boxplot (ACE index and shannon index). (B) PCoA using Bray-Curtis metric distances of beta diversity. Gut bacteria species are taxonomically classified by order. (C) Phenotypic prediction based on BugBase analysis. The relative abundances of phyla possessing anaerobic, aerobic, facultatively anaerobic, gram positive, potentially pathogenic and forms biofilms. (*P<0.05,**P<0.01, compared with the control group.#P<0.05,##P<0.01, compared with the DSS model group.&P<0.05,&&P<0.01, compared with the acute DSS+FO group)

2.3 魚油改善慢性期腸炎小鼠腸道菌群與宿主互作失調(diào)

2.3.1 魚油促進緊密連接相關蛋白質(zhì)表達增強腸炎小鼠腸道機械屏障 緊密連接蛋白(tight junctions, TJs)包括閉合蛋白(claudins)、咬合蛋白(occludin)及閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens-1, ZO1)等，位于相鄰兩細胞間，對維系上皮結構功能的完整性發(fā)揮重要作用[10]。結果正如Fig.4所示，與空白對照組相比，模型組中claudin1、occludin和ZO1相對表達明顯下降(P<0.01)；其中慢性期模型組相較于急性期模型組occludin表達量更低(P<0.01)；與模型組相比，急慢性期魚油干預可上調(diào)claudin1、occludin和ZO1表達；其中慢性期魚油組相對表達量均高于急性期魚油組(P<0.05)。我們推測，DSS破壞下調(diào)緊密連接蛋白質(zhì)的表達，破壞結腸黏膜機械屏障，引起腸腔中菌群易位，誘發(fā)炎癥；而魚油干預可改善緊密連接蛋白質(zhì)的表達水平、維護機械屏障，減輕炎癥，且慢性期腸炎小鼠效果最佳。

2.3.2 魚油促進氧化代謝相關蛋白質(zhì)表達增強上皮能量代謝平衡 通常情況下，結腸上皮細胞的能量主要來自短鏈脂肪酸的有氧氧化，結腸上皮細胞有氧氧化代謝有利于維持腸腔厭氧環(huán)境和保持腸道菌群平衡[6]。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測短鏈脂肪轉運與氧化代謝相關的蛋白質(zhì)表達情況：單羧酸轉運蛋白1(monocarborxylat transporter 1, MCT1)、短鏈脂肪酸受體43(short-chain fatty acid receptor 43, GPR43)、肉堿脂酰轉移酶1A(carnitine palmotyltransferase 1A, CPT1A)、肉堿脂酰轉移酶2(carnitine palmotyltransferase 2, CPT2)、檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)，結果見Fig.4所示。與空白對照組相比，模型組中MCT1、GPR43、CPT1A、CPT2和CS相對表達量明顯下降(P<0.05)；與其相反，LDH的相對表達量顯著上調(diào)(P<0.01)；其中相比急性期模型組，慢性期模型組MCT1、GRP43、CPT1A和CS的相對表達量下調(diào)更明顯。與模型組相比，急慢性期魚油干預可上調(diào)CPT1A、CPT2和CS表達(P<0.01)，其中只有慢性期魚油干預可顯著上調(diào)MCT1和GPR43相對表達量(P<0.01)；同樣，急慢性期魚油干預可下調(diào)LDH表達(P<0.01)，兩組無統(tǒng)計學差異。由此推測，魚油干預特別是慢性期魚油干預能有效改善上皮屏障能量代謝功能異常，增強β-氧化，降低腸腔氧含量，阻止腸道微生物易位誘發(fā)炎癥。

Fig.4 Effects of fish oil on colonic epithelial mechanical barrier and energy metabolism in mice with DSS-induced colitis The amount of every protein was quantified by the integrated density (Image J) of each band (*P<0.05,**P<0.01, compared with the control group.#P<0.05,##P<0.01, compared with the DSS model group.&P<0.05,&&P<0.01, compared with the acute DSS+FO group)

2.3.3 魚油改善腸炎小鼠腸道菌群結構與代謝功能失調(diào) 基于PICRUSt2進行“封閉式”參考OTU劃分(closed-reference OTU picking)，通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對，尋找每一條測序序列的“參考序列最近鄰居”，進而通過KEGG/EggNOG等基因功能譜數(shù)據(jù)換算預測菌群的整體代謝功能，結果見圖Fig.5A，與空白對照組相比，急慢性期模型組糞便菌群的糖苷生物合成與代謝途徑和氧化磷酸化代謝受到破壞(P<0.05)；相比于模型組，慢性期魚油干預可改善菌群糖苷生物合成與代謝和氧化磷酸化代謝障礙(P<0.05)。

對各組糞便中丙酸(propionic acid)、乙酸(acetic acid)和丁酸(butyric acid)含量檢測結果正如Fig.5B。與空白對照組相比，急慢性期模型組中丙酸、乙酸和丁酸含量顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，魚油干預能有效上調(diào)乙酸、丙酸和丁酸含量(P<0.01)，其中慢性期魚油組對乙酸的上調(diào)幅度最明顯(P<0.01)，其次是丁酸(P<0.01)。短鏈脂肪酸和腸道微生物群豐度之間的相關性分析(Fig.5C)表明，腸道菌群的豐度與乙酸、丙酸和丁酸含量顯著相關。在目水平上，Eggerthellales(P<0.05)、Anaeroplasmatales(P<0.05)、Clostridiales(P<0.05)和Bifidobacteriales(P<0.01)與丁酸含量呈正相關；Bdellovibrionales(P<0.05)、Clostridiales(P<0.05)和Bifidobacteriales(P<0.05)與乙酸含量呈正相關；Enterobacterales(P<0.01)與丙酸、乙酸和丁酸含量呈負相關；Rhizobiales(P<0.05)、Verrucomicrobiales(P<0.05)、Bacillales(P<0.05)和Sphingomonadales(P<0.05)與乙酸含量呈負相關。由此推測，腸炎小鼠會改變腸道菌群自身代謝功能異常并會引起菌群結構紊亂，魚油干預可改善產(chǎn)SCFA菌群結構和益生菌比例，同時抑制兼性厭氧菌組成，進而緩解腸腔氧分壓失衡。

Fig.5 Effects of fish oil on microbial metabolism of DSS-induced colitis mice (A) Functions were predicted by PICRUSt2 using the KEGG pathway database and visualized using STAMP. (B) The fecal SCFA content was measured using gas chromatography. (C) Spearman’s correlation between fecal SCFAs and order-level abundances after fish oil treatment (*P<0.05,**P<0.01, compared with the control group.#P<0.05,##P<0.01, compared with the DSS model group.&P<0.05,&&P<0.01, compared with the acute DSS+FO group)

3 討論

3.1 魚油對維持緩解期腸炎小鼠具有更強的抗炎作用

流行病學研究顯示，亞洲國家UC發(fā)病率快速上升與飲食西方化有關，膳食中n-3/n-6 PUFAs攝入不平衡是重要影響因素[11]。Mozaffari等人近期薈萃分析納入了5項前瞻性研究和7項病例對照的分析結果表明，膳食中n-3 PUFAs攝入與UC患病風險呈顯著性負相關[12]。Wiese等人發(fā)現(xiàn)，UC患者血清中PUFAs與腸組織炎癥因子呈負相關，活動期UC患者血清PUFAs百分含量明顯低于健康人群[13]。34名UC患者組成的一項為期1年的雙盲、隨機和交叉試驗，每天給予2次10 mL魚油干預(5.0 g/d EPA+1.2 g/d DHA)，安慰劑組為橄欖油，魚油干預可顯著改善患者4周以上緩解，6個月無活動性疾病復發(fā)癥狀(直腸出血、大便稀疏、大便頻繁)[14]。一項為期6個月的雙盲、平行分組和安慰劑對照的研究，18例維持緩解期的UC患者每天給予魚油干預(3.2 g/d EPA+2.4 g/d DHA)，相比于安慰劑組(向日葵油, 2.6 g/d油酸+7.6 g/d亞油酸)，魚油干預可顯著減少維持緩解期臨床或內(nèi)窺鏡下炎癥活動性表現(xiàn)[15]。另一項64例緩解期的UC患者進行2年給予5.1 g/d魚油干預發(fā)現(xiàn)，相比于安慰劑組(玉米油)，每日魚油補充能有效延長緩解期間復發(fā)的間隔時間[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，急慢性期魚油干預均可顯著提高小鼠結腸中n-3 PUFAs含量，干預時間直接影響富集效果。魚油維持緩解小鼠腸炎的作用與魚油富集程度相關，小鼠慢性期魚油干預緩解效果優(yōu)于急性魚油干預，主要表現(xiàn)為小鼠體重恢復快，疾病活動指數(shù)評分、結腸長度、結腸水腫程度和組織病理學評分明顯降低，血清促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平明顯降低，抗炎因子IL-10水平明顯提高。

值得注意的是，慢性期魚油組小鼠結腸中EPA含量高于DHA。本文推測，魚油在慢性期表現(xiàn)出優(yōu)異的維持緩解效果可能與EPA含量有關。Ananthakrishnan等人對17萬人長達26年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，EPA的攝入與UC患病風險呈負相關[17]。Perl等人對UC患者的炎性結腸黏膜、非炎性結腸黏膜、靜息期結腸黏膜和配對性別對照的結腸黏膜中脂肪酸構成分析發(fā)現(xiàn)，與UC患者的非炎性結腸黏膜和對照組結腸黏膜相比，UC患者的炎性黏膜中花生四烯酸和DHA含量升高，α-亞麻酸、亞油酸和EPA顯著性下降，結腸炎癥程度與EPA呈負相關[18]。對2組緩解期UC患者的安慰劑對照試驗中發(fā)現(xiàn)，每天給予2次500 mg EPA-FFA(free fatty acid form of EPA, EPA-FFA)治療，患者無嚴重的不良事件，補充EPA-FFA可降低糞鈣衛(wèi)蛋白水平，減少UC患者的黏膜損傷，促進杯狀細胞(goblet cell, GC)分化[19]，調(diào)節(jié)腸道菌群組成，并維持UC患者的無癥狀緩解。此外，相比于UC輕中度常用藥柳氮磺胺吡啶，CLX-103(EPA偶聯(lián)氨基水楊酸(aminosalicylic acid, 5-ASA)可靶向結腸黏膜炎癥部位，用量少和藥效高[20, 21]。在DSS誘導的結腸炎小鼠研究中同樣發(fā)現(xiàn)，EPA緩解腸炎的效果優(yōu)于DHA，其DAI評分更低，促炎細胞因子生成和炎性細胞浸潤顯著下調(diào)。這可能與EPA通過抑制Akt和ERK(extracellular signal-regulated kinase)活化，促進緊密連接蛋白表達(例如claudin-1和occludin)，維系腸黏膜屏障完整性有關。EPA還抑制DSS誘導的腸上皮炎癥細胞浸潤和炎癥因子表達，抑制NLRP3 /IL-1β和IL-6 /STAT3炎癥通路活化[22]。

3.2 魚油有效改善維持緩解期腸炎小鼠糞便菌群功能與丁酸比例，改善腸道菌群與宿主互作失調(diào)

UC患者通常腸道菌群、腸道菌群功能多樣性和穩(wěn)定性受損，產(chǎn)短鏈脂肪酸菌豐度減少，需氧菌和兼性厭氧菌增加。在小鼠和大鼠腸炎模型中，n-3 PUFAs干預可顯著增加Akkermansia[23]、Bifidobacteria[24]和產(chǎn)丁酸菌豐度改善腸道菌群失調(diào)。治療誘導期UC常用藥5-ASA可阻止腸桿菌科擴張緩解微生態(tài)失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，魚油干預能影響小鼠糞便腸道菌群結構，特別是魚油干預可顯著提高慢性期腸炎小鼠糞便中產(chǎn)丁酸鹽菌群(Clostridiales)和益生菌(Bifidobacteriales)的相對豐度，下調(diào)需氧菌、兼性厭氧菌、致病菌和生物膜形成能力菌群的比例。微生物代謝產(chǎn)物是細菌-宿主串擾的主要溝通渠道之一，短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物，腸道內(nèi)環(huán)境改變直接影響菌群結構，進而影響短鏈脂肪酸產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，在目水平上，主要產(chǎn)短鏈脂肪酸的Clostridiales(P<0.05)和益生菌Bifidobacteriales(P<0.01)與丁酸含量呈正相關；兼性厭氧菌Enterobacterales(P<0.01)與丙酸、乙酸和丁酸含量呈負相關。魚油干預能有效上調(diào)丙酸、乙酸和丁酸含量(P<0.01)，其中慢性期魚油干預組對丁酸的上調(diào)幅度最明顯。

UC一直被報道與腸道菌群有關，有關其病原學的研究主要集中在以下兩方面：(1)持續(xù)病原體理論認為是艱難梭菌(Clostridiumdifficile)[25]和黏附侵襲性大腸桿菌(adherent invasiveE.coli, AIEC)的持續(xù)感染有關[26]；(2)大量細菌易位穿過腸黏膜屏障導致微生物屏障紊亂[27]。這些干擾通常會引起結腸上皮結構紊亂和腸道通透性改變，進而促進病原微生物和有害物質(zhì)的吸收。本研究對小鼠末端結腸組織的蛋白質(zhì)印跡法檢測結果發(fā)現(xiàn)：相比于急性期魚油干預組，慢性期魚油干預可顯著上調(diào)緊密連接蛋白質(zhì)的表達，例如claudin1、occludin和ZO1(P<0.05)。我們推測，DSS破壞小鼠黏膜屏障并下調(diào)緊密連接蛋白質(zhì)的表達，引起腸腔中菌群易位，誘發(fā)炎癥；而慢性期魚油干預能更有效維護腸上皮機械屏障，減輕炎癥。

UC的病因尚不清楚，1980年Roediger等人曾提出UC是一種由于無法利用丁酸而導致能量代謝損害的疾病，這一理論已被越來越多的證據(jù)證明[28]。結腸上皮細胞許多重要功能都依賴于能量，主要包括上皮細胞機械屏障的構建[21]和微生物屏障的穩(wěn)態(tài)[29]等 。影響結腸上皮細胞能量代謝的因素均會促發(fā)腸黏膜屏障紊亂，進而誘發(fā)UC的發(fā)生[30]和發(fā)展[31]。丁酸鹽是腸道主要的能量來源，為結腸上皮細胞提供了60%～70%的能量需求[32]。用丁酸鹽氧化抑制劑2-溴辛酸鈉(sodium 2-bromo-octanoate)對大鼠灌腸處理5天后，大鼠呈現(xiàn)UC癥狀[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，魚油能有效維持緩解慢性期腸炎小鼠改善上皮屏障能量代謝功能異常，增強β-氧化，降低腸腔氧含量，進而阻止腸腔微生物易位誘發(fā)炎癥。我們推測，相比于慢性期魚油組(維持緩解期)，可能與急性期魚油組(誘導緩解期)腸炎小鼠糞便菌群自身代謝功能異常，產(chǎn)短鏈脂肪酸菌結構和益生菌比例不足，兼性厭氧菌上調(diào)有關。Bacallao等人報道，上皮細胞ATP耗竭時，常引起肌動蛋白細胞骨架結構改變，參與細胞間連接的F-肌動蛋白明顯減少和破壞，導致細胞間隙增寬[34]。體外實驗同樣證實，正常的能量代謝功能對維持Caco-2上皮結構完整性必不可少。能量耗竭使Caco-2單層細胞中claudin 7表達下調(diào)，進而引起單層細胞滲透性增大[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性期魚油組小鼠結腸中EPA含量顯著高于DHA(P<0.05)。最近的研究認為，EPA和DHA對協(xié)調(diào)結腸炎小鼠微生物和宿主互作失衡存在差異。與DHA相比，EPA更能有效促進杯狀細胞分化、黏蛋白質(zhì)成熟、黏液顆粒組裝和分泌強化腸道黏液屏障，增強結腸黏液屏障馴化腸道微生物，促進產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群豐度為結腸上皮細胞提供能量物質(zhì)，進而緩解腸炎小鼠腸道菌群和宿主互作失衡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，DSS下調(diào)小鼠結腸上皮細胞緊密連接蛋白質(zhì)的表達，破壞結腸黏膜機械屏障，促發(fā)細菌易位，誘發(fā)炎癥；而魚油干預可改善緊密連接蛋白質(zhì)的表達水平(claudin1、occludin和ZO1)、維護機械屏障，減輕炎癥，魚油對維持緩解期的效果優(yōu)于誘導緩解期。本研究發(fā)現(xiàn)魚油對維持緩解慢性期小鼠腸炎具有更強的抗炎作用，其作用機制可能與改善維持緩解期腸炎小鼠糞便菌群功能與提高丁酸含量，改善腸道菌群與宿主互作失調(diào)有關。