崔婷，王勇，吳萬(wàn)鑫，向航，馬暉玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中?美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

土壤重金屬污染可導(dǎo)致植物中毒并通過(guò)食物鏈危害人類(lèi)健康［1］。Cd 是重要的重金屬污染物之一，全世界每年約有3.0×104t Cd 被釋放到環(huán)境中，其中1.3×104t 由人類(lèi)活動(dòng)引起［2］。中國(guó)在長(zhǎng)期的工業(yè)生產(chǎn)和礦產(chǎn)開(kāi)采活動(dòng)中造成的重金屬污染事件近年來(lái)逐漸凸顯，為此，國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)首個(gè)重金屬污染治理專項(xiàng)規(guī)劃，重點(diǎn)防控鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）等重金屬污染物，并強(qiáng)調(diào)優(yōu)先考慮植物修復(fù)防治措施［3］?！锻寥牢廴痉乐涡袆?dòng)計(jì)劃》實(shí)施以來(lái)，農(nóng)用地土壤重金屬污染得到初步遏制，“凈土保衛(wèi)戰(zhàn)”取得初步成效，然而，部分地區(qū)土壤污染隱患依然突出［4］。

植物復(fù)雜的防御反應(yīng)是其應(yīng)對(duì)不利環(huán)境影響的關(guān)鍵，Cd 脅迫通常會(huì)激活一些信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控植物轉(zhuǎn)錄和代謝以抵御Cd 脅迫［5］。植物激素信號(hào)在響應(yīng)外界脅迫方面通常具有積極作用。在Cd 脅迫下對(duì)玉米（Zea mays）根系的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素信號(hào)通路相關(guān)基因顯著富集，對(duì)生長(zhǎng)素生物合成、運(yùn)輸和下游反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄豐度的比較表明，這些基因在Cd 處理下有普遍的表達(dá)反應(yīng)，Cd 處理導(dǎo)致玉米根系生長(zhǎng)素（IAA）含量顯著降低，而外源噴施IAA 可促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增加Cd 吸收［6］。外源IAA 可顯著增加油菜對(duì)Cd的吸收，同時(shí)促進(jìn)Cd 從根部向地上運(yùn)輸［7］。Cd 脅迫通常導(dǎo)致植物生物量減少，抑制植物光合，降低礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量，并引起植物氧化應(yīng)激，而施加外源赤霉素（GA3）可緩解這種抑制作用［8］。Cd2+具有較低的氧化活性，但由于Cd2+與其他二價(jià)陽(yáng)離子在化學(xué)上的相似性，Cd2+通常會(huì)間接導(dǎo)致植物活性氧（ROS）代謝失衡，影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育［9］。植物抗氧化酶系統(tǒng)是植物清除ROS 的重要途徑，研究表明，Cd 脅迫處理黑麥草后，可溶性蛋白含量減少，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）含量均高于對(duì)照，而FeSOD，MnSOD，ChlCu/ZnSOD，Cyt Cu/ZnSOD，APX，GPX，GR 和POD 基因均上調(diào)表達(dá)［10］。另外，Cd 脅迫下，植物體內(nèi)Cd 含量顯著增加并抑制其對(duì)K、Ca、Mg、Cu、Fe、Zn 的吸收［11］。

草坪草因具有對(duì)Cd 極強(qiáng)的吸收效率、高度耐Cd能力和優(yōu)良的遺傳性狀，在Cd 污染土壤修復(fù)方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。Li 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，草地早熟禾（Poa pra?tensis）可在Cd、Zn 污染土地上較好生長(zhǎng)，表明草地早熟禾具有較強(qiáng)的Cd 耐受性。草地早熟禾分布廣泛、生物量大、抗逆性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)，可以迅速覆蓋地表，且在Cd 耐受性方面遠(yuǎn)高于超富集植物龍葵［13-14］。另一方面，草地早熟禾具有發(fā)達(dá)的不定根系統(tǒng)，短根莖可將疏叢緊密聯(lián)系在一起，形成稠密網(wǎng)狀，在無(wú)機(jī)離子吸收方面具有極大優(yōu)勢(shì)［13］。因此，利用草地早熟禾修復(fù)Cd 污染土壤在實(shí)際應(yīng)用中具有深遠(yuǎn)意義。因此，研究Cd 脅迫下草地早熟禾的生理變化及草地早熟禾對(duì)Cd 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)變，以期為Cd 污染草坪草土壤治理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以草地早熟禾品種午夜（Poa pratensiscv.Mid?night）為試驗(yàn)材料，種子由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

草地早熟禾種子用蒸餾水過(guò)夜浸泡后用70%酒精浸泡1 min，20%次氯酸鈉浸泡15 min，滅菌水沖洗5~6 次，晾干后均勻撒播在填裝蛭石的育苗缽（8 cm×10 cm）中，出苗后間苗至30 株/缽，置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ℃/20 ℃，光周期16 h/8 h。每天噴灑蒸餾水至出苗兩周后改用霍格蘭德?tīng)I(yíng)養(yǎng)液澆灌，每3 天更換1 次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)45 d 后開(kāi)始施加處理。

試驗(yàn)處理1：將預(yù)培養(yǎng)的幼苗施加不同Cd 濃度處理，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將Cd 脅迫濃度梯度依次設(shè)置為0（CK）、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L。處理7 d 后測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。處理21 d 后拍照并測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)。

試驗(yàn)處理2：將預(yù)培養(yǎng)的幼苗施加0（CK）和1 mmol/L 處理，3 d 后測(cè)定其葉片激素含量，7 d 后測(cè)定其根系和葉片Ca2+、Mg2+、Zn2+含量并測(cè)定7、14、21、28 d 時(shí)根系和葉片中的Cd 含量。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

株高和根長(zhǎng)：采用直尺測(cè)定。

葉片鮮重和根系鮮重：采用分析天平稱量。

光合色素含量測(cè)定：取新鮮的草地早熟禾葉片0.2 g，用95%乙醇浸泡24 h 后，測(cè)定470，649 和665 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值并計(jì)算相關(guān)色素含量［15］。

蒸騰速率（Tr）、葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）、凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）采用GFS?3000 便攜式光合測(cè)量?jī)x測(cè)定。

SOD 活性測(cè)定：采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定［15］。POD 活 性 測(cè) 定：采 用 愈 創(chuàng) 木 酚 法 測(cè) 定［15］。CAT、APX 活性測(cè)定：采用過(guò)氧化氫還原法測(cè)定［15］。

植物激素含量測(cè)定：參照劉燕［16］的方法，取新鮮植物組織2 g，加入液氮研磨至粉末后加入20 mL 80%預(yù)冷的甲醇溶液，在避光搖床中提取4~6 h，轉(zhuǎn)速180 r/min，4 ℃條件 下 浸提16~22 h，10 000 r/min 離心15 min，提取上清液并在殘?jiān)屑尤?0 mL 80%甲醇，渦旋儀混勻后超聲波提取5 min，再次離心并合并上清液。將上清液在40 ℃下減壓離心至20 mL，加入石油醚10 mL，充分搖勻后靜置脫色10 min，棄去上層，再次加入石油醚10 mL，10 000 r/min 離心10 min，再次棄去上層，40 ℃減壓濃縮至1/3，加10 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并上清液，并將上清液置于40 ℃減壓濃縮至近干后加入2 mL 色譜甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后在液相色譜儀中進(jìn)行IAA、ABA、GA3、ZT 含量測(cè)定。

Ca2+、Cd2+、Mg2+、Zn2+濃度的測(cè)定：對(duì)不同處理的草地早熟禾根、葉片進(jìn)行取樣，放入烘箱105 ℃殺青15 min，70 ℃烘至恒重，將不同部位研碎成粉末，過(guò)100 目（0.15 mm）篩。準(zhǔn)確稱取0.2 g，重復(fù)4 次，放入50 mL 消化管，加入8 mL 消解試劑（HNO3∶H2O2=7∶1，v，優(yōu)級(jí)純），放入微波消解儀，控制溫度：1）130 ℃，升溫10 min，保溫2 min；2）150 ℃，升溫3 min，保溫2 min；3）180 ℃，升溫3 min，保溫15 min。壓力設(shè)定均為400 PSI。消解完成后用1% HNO3定容至50 mL容量瓶，保存。用火焰原子吸收分光光度計(jì)（AA-6800，島津，日本）測(cè)定樣品溶液中Ca2+、Cd2+、Mg2+、Zn2+的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Microsoft Excel 2019 做圖，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾生長(zhǎng)的影響

1.0 mmol/L 濃度Cd 脅迫即可抑制草地早熟禾生長(zhǎng)，隨著Cd 濃度增加，抑制效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)Cd 濃度達(dá)到2.5 mmol/L 時(shí)，草地早熟禾葉片變黃，株高顯著降低，且生物量減少。同時(shí)，隨著Cd 脅迫濃度增加，草地早熟禾株高、根長(zhǎng)、葉片鮮重、根系鮮重均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且對(duì)照與各處理差異顯著（P<0.05）（圖1）。

圖1 Cd 脅迫處理下草地早熟禾株高、根長(zhǎng)、葉片鮮重、根系鮮重Fig.1 Effects of Cd stress on height，root length，leaf fresh weight and root fresh weight of kentucky bluegrass

2.2 Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾光合特性的影響

Cd 脅迫顯著抑制草地早熟禾葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量（P<0.05），葉綠素a/b 的值隨著濃度增加亦顯著降低（P<0.05）。同時(shí)，其蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率也在Cd 脅迫下顯著降低（P<0.05），而Cd 脅迫下胞間二氧化碳濃度顯著增加（P<0.05）。而施加Cd 后各濃度梯度之間蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、胞間二氧化碳濃度未發(fā)生顯著變化（P<0.05）（圖2）。

圖2 Cd 脅迫處理下草地早熟禾光合色素含量、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、胞間二氧化碳濃度Fig.2 Effects of Cd stress on photosynthetic pigment content，transpiration rate，stomatal conductance，net photosynthetic rate，and intercellular carbon dioxide concentration of kentucky bluegrass

2.3 Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾抗氧化酶活性的影響

Cd 脅迫下草地早熟禾根系中APX 活性顯著低于CK（P<0.05）（圖3?A）。葉片中（圖3-B），CAT 活性隨Cd 脅迫增加逐漸降低，3 mmol/L Cd 脅迫下葉片CAT 活性最低，比CK 降低90%，差異顯著（P<0.05），而在根系中，Cd 脅迫下CAT 活性顯著增加，1mmol/L Cd 脅迫根系CAT 活性增加幅度最大，比CK 增加2.37 倍，差異顯著（P<0.05）（圖3?B）。葉片POD 活性隨Cd 脅迫增加逐漸降低，而根系中POD 活性表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，3 mmol/L Cd 脅迫下根系POD活性增加至最大，比CK 增加40.92%，差異顯著（P<0.05）（圖3?C）。Cd 脅迫下SOD 活性表現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)（圖3?D），其中，1 mmol/L Cd 脅迫下葉片SOD 活性增至最大，2 mmol/L Cd 脅迫下根系SOD 活性增至最大，但與CK 相比，葉片SOD 活性增加21.83%，而根系SOD 活性降低17.42%，差異顯著（P<0.05）。

圖3 Cd 脅迫處理下草地早熟禾APX、CAT、POD、SOD 活性Fig.3 Effects of Cd stress on APX，CAT，POD and SOD activities of kentucky bluegrass

2.4 Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾葉片激素含量的影響

Cd 脅迫下草地早熟禾葉片IAA 和GA3含量顯著降低（P<0.05），而ZT 含量顯 著增加（P<0.05），ABA 含量變化差異不顯著（P>0.05）。其中IAA 變化最為顯著，與CK 相比，Cd 處理下葉片IAA 含量比CK 降低53.78%，差異極顯著（P<0.01）（圖4）。

圖4 Cd 脅迫處理下草地早熟禾葉片IAA、GA3、ZT、ABA 含量Fig.4 Effects of Cd stress on IAA，GA3，ZT，and ABA content in leaves of kentucky bluegrass

2.5 Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾二價(jià)陽(yáng)離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

草地早熟禾根系和葉片對(duì)Cd2+均有極顯著的富集作用（P<0.01），且根系中Cd 含量明顯高于葉片中Cd2+含量（圖5?A）。根系和葉片Zn2+含量也發(fā)生極顯著 變 化（P<0.01），分 別 比CK 降 低33.18% 和29.15%（圖5?B）。Cd 脅迫下，草地早熟禾葉片Mg2+含量明顯增加，而根系Mg2+含量明顯降低，差異極顯著（P<0.01）（圖5?C）。而Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾Ca2+含量未產(chǎn)生顯著影響（圖5?D）。

圖5 Cd 脅迫處理下草地早熟禾葉片和根系Cd2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+含量Fig.5 Effects of Cd stress on the content of Cd2+，Zn2+，Mg2+and Ca2+in the leaves and roots of kentucky bluegrass

3 討論

高濃度Cd 脅迫通常導(dǎo)致植物失綠、萎蔫、抑制植物生長(zhǎng)［17］，這種毒害現(xiàn)象通常與Cd 在植物器官中的積累有關(guān)［18］。本研究中，隨著Cd 脅迫濃度的增加，草地早熟禾也表現(xiàn)出抑制生長(zhǎng)及萎蔫變黃等毒害現(xiàn)象。

Cd 在植物葉片中的積累通常會(huì)導(dǎo)致植物類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)破壞，影響植物光合［19］。另一方面，Cd 通常在老葉中積累并破壞葉綠素結(jié)構(gòu)，而新葉中葉綠素的生物合成也造成老葉中葉綠素合成受到抑制［20］，同時(shí)，Cd脅迫導(dǎo)致對(duì)葉綠素生物合成酶活性的抑制和葉綠素酶促降解過(guò)程的激活［21］。研究認(rèn)為，Cd 脅迫通過(guò)降低合成氨基乙酰丙酸合酶所需的谷氨酸鹽的有效性［22］，而氨基乙酰丙酸合酶是葉綠素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶［23］。Cd 處理下，草地早熟禾葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著降低，表明Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾光合色素合成具有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，蒸騰速率直接影響植物體內(nèi)Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)［24］，Liu 等［25］報(bào)道，植物莖中Cd 含量與蒸騰速率呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。本研究中，Cd 處理的草地早熟禾葉片蒸騰速率顯著降低。報(bào)道指出，Cd 脅迫下，植物氣孔導(dǎo)度隨著Cd 濃度增加而降低，而氣孔導(dǎo)度的降低通常伴隨著光合速率的下降［26］。本試驗(yàn)中，Cd 脅迫導(dǎo)致草地早熟禾葉片氣孔導(dǎo)度、凈光合速率顯著降低，而胞間二氧化碳濃度增加，表明Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾光合作用具有嚴(yán)重的抑制作用。

Cd 脅迫通常會(huì)引起植物活性氧代謝失衡，植物自身?yè)碛袕?fù)雜的清除活性氧的途徑，其中抗氧化酶途徑是植物主要清除活性氧的途徑［27-29］。有報(bào)道指出，脅迫條件下產(chǎn)生的超氧自由基可被SOD 歧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫可被APX、CAT 和POD 清除［30］。不同植物抗氧化酶活性在脅迫條件下的變化并非一致，郭 鋒 等［31］研 究 發(fā) 現(xiàn)，Cd 脅 迫 下 西 葫 蘆（Cucurbita pepo）抗氧化酶活性增加，類(lèi)似的結(jié)果在張曉娟［32］對(duì)綠豆（Vigna radiata）的研究中也有報(bào)道。通常認(rèn)為，輕度脅迫可促進(jìn)植物抗氧化酶活性，而重度脅迫則抑制植物抗氧化酶活性［33］。本研究中，Cd 脅迫導(dǎo)致草地早熟禾葉片CAT、POD 活性降低，SOD 活性先增后降，而APX 活性無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)镃d 脅迫抑制草地早熟禾CAT 和POD 活性，草地早熟禾可在一定濃度的Cd 脅迫下提高SOD 的濃度以抵御Cd 毒害，而在根系中CAT、POD 和SOD 在Cd 脅迫下活性增加，APX 活性降低，而根系是草地早熟禾吸收Cd 的重要器官，根系中Cd 含量遠(yuǎn)高于葉片中Cd 含量（圖5?A），證明在高濃度Cd 脅迫下，根系依舊可以通過(guò)調(diào)節(jié)部分抗氧化酶活性來(lái)抵御Cd 毒害。

細(xì)胞壁POD 的一些酸性同工酶通過(guò)H2O2催化單酚氧化聚合反應(yīng)而木質(zhì)化，POD 可降低細(xì)胞壁可塑性并增加其硬度，因此可控制細(xì)胞生長(zhǎng)［34］。POD 可以通過(guò)影響3-吲哚乙酸（IAA）氧化酶活性來(lái)影響IAA 合成速率［5］。本研究中，Cd 脅迫導(dǎo)致葉片POD 活性下降，IAA 含量顯著降低，這可能影響草地早熟禾的正常生長(zhǎng)。GA 在控制細(xì)胞伸長(zhǎng)和莖伸長(zhǎng)中起著核心作用［35］，有研 究 表 明，施加外 源GA3可 顯 著 緩解大 豆（Glycine max）Cd 脅迫，并增加Cd 脅迫下大豆的生長(zhǎng)速率和凈同化率［36］。本研究中，Cd 脅迫處理的草地早熟禾葉片GA3含量顯著低于CK，證明Cd 毒害同樣影響GA3含量從而影響草地早熟禾生長(zhǎng)和生理狀態(tài)。細(xì)胞分裂素是參與植物多種生命過(guò)程的激素信號(hào)，玉米素（Zeatin，ZT）和其衍生物是細(xì)胞分裂素的重要組成部分，眾多研究表明，細(xì)胞分裂素參與植物葉片衰老、促進(jìn)分枝、促進(jìn)莖和根的生長(zhǎng)［37-39］。本研究中，Cd脅迫的草地早熟禾葉片ZT 含量顯著高于CK，表明內(nèi)源ZT 在草地早熟禾Cd 解毒方面可能具有積極作用。而ABA 含量在Cd 處理和對(duì)照間未發(fā)生顯著變化。

Cd 是植物非必須營(yíng)養(yǎng)元素，但土壤中的Cd 可通過(guò)鈣（Ca）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鋅（Zn）等必需二價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入植物根部，通過(guò)影響一些正常生命活動(dòng)而對(duì)植物造成毒害作用［40］。金屬陽(yáng)離子易被根系中帶負(fù)電的化合物吸引而較少的向上轉(zhuǎn)移［41］。Mg 是參與植物光合作用的和呼吸作用的重要金屬元素，參與活化磷酸變位酶和磷酸激酶，同時(shí)，在DNA 和RNA合成中也具有重要作用，植物缺乏Mg 可導(dǎo)致葉片黃化，嚴(yán)重影響葉綠素合成，抑制植物光合作用［42］。Ca通常作為第二信使參與植物抵御逆境脅迫反應(yīng)，Cd 與Zn 化學(xué)相似性較高，Cd2+可影響Zn-Finger 轉(zhuǎn)錄因子活性，取代Zn2+，從而干擾轉(zhuǎn)錄機(jī)制［43］，類(lèi)似于這種機(jī)制，Cd 取代鈣調(diào)蛋白中的Ca2+離子，引起細(xì)胞內(nèi)鈣水平變化，影響鈣信號(hào)傳導(dǎo)［44］。本研究中，草地早熟禾根系中富集更多的Cd，而Cd 脅迫后根系和葉片Zn2+含量顯著降低，表明Cd 抑制草地早熟禾Zn2+吸收。Mg2+含量Cd 處理后葉片中顯著增加而根系中Mg2+含量減少，表明Cd 脅迫導(dǎo)致更多的Mg2+向葉片運(yùn)輸，而Ca2+含量Cd 處理與CK 相比差異不顯著，證明Cd毒害對(duì)Ca2+含量影響較小。

4 結(jié)論

Cd 脅迫可造成草地早熟禾生長(zhǎng)抑制，且大部分Cd 富集在根部，Cd 吸收的同時(shí)影響Zn2+、Mg2+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。Cd 毒害可抑制草地早熟禾光合作用，減少葉片IAA 和GA3含量，增加ZT 含量。抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX 不同程度地參與草地早熟禾Cd解毒。