高加索三葉草對(duì)不同降溫模式的抗寒生理響應(yīng)

牟丹，楊帆，卡著才讓，西合多杰，徐晨晨，謝久祥，李希來

（1. 青海大學(xué)牧業(yè)學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 河南蒙古族自治縣自然資源局林業(yè)站，青海 河南 811599）

低溫對(duì)于分布在較高緯度或高海拔的多年生植物是一種不可避免的環(huán)境脅迫［1］。冷馴化被認(rèn)為是許多溫帶、寒帶植物發(fā)展耐寒性和抗凍性的一個(gè)典型過程［2］，因?yàn)橥蝗坏乃獌鰰?huì)對(duì)植物造成相當(dāng)大的損害。青藏高原氣候嚴(yán)寒，植物生長(zhǎng)期短，極端低溫、倒春寒等災(zāi)害天氣時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致植株低矮，甚至出現(xiàn)無法正常越冬、植株死亡的情況［3］。相關(guān)研究表明，青藏高原高寒地區(qū)冬春季節(jié)寒冷干燥，年積溫較低等氣候特點(diǎn)使牧草引種尤其是豆科牧草的引種較為困難［4］。

高加索三葉草（Trifolium ambiguum）原產(chǎn)于高緯度的東歐和西亞的高海拔（2 750 m）地區(qū)，其生境類型多樣，可在林草過渡帶和流石灘生長(zhǎng)［5］。高加索三葉草具有二倍體、四倍體和六倍體等多種核型，多倍性增加了其抗逆性［5］。另外，高加索三葉草具有密集的根狀莖系統(tǒng)［6］，這幾種因素使得高加索三葉草具有極強(qiáng)的抗逆能力，包括耐陰、抗病、抗?jié)?、抗旱、抗寒、抗凍融和抗雜草等特性［6-11］。近幾十年來，澳大利亞、新西蘭、美國(guó)和加拿大等國(guó)家對(duì)該三葉草進(jìn)行了一系列適應(yīng)性和利用價(jià)值的試驗(yàn)與評(píng)價(jià)，認(rèn)為高加索三葉草是許多寒冷和干旱地區(qū)不適宜種植紅三葉和白三葉地方唯一可以種植并在各方面表現(xiàn)優(yōu)良的三葉草種［12］。高加索三葉草的壽命非常長(zhǎng)，一經(jīng)建植，可永續(xù)利用，放牧和收割［9，13］。且由于其高的覆蓋性、固氮特性和飼用價(jià)值，近年來已被歐美等國(guó)家作為活地被物（living mulch）［14］，大面積用于半人工草地建植［15］和生態(tài)修復(fù)［16］。

2015年，我們將高加索三葉草從新西蘭引種到青海省河南蒙古族自治縣（簡(jiǎn)稱河南縣）3 500~3 700 m的試驗(yàn)地，發(fā)現(xiàn)其在野外均能成功越冬，并在野外形成了無性繁殖植株［17-18］。河南縣氣候嚴(yán)酷，冬季嚴(yán)寒，最低氣溫可達(dá)-37.2 ℃（1995年1月5日）。且春秋季節(jié)晝夜溫差大，時(shí)有零下低溫發(fā)生，對(duì)正處于返青或正常生長(zhǎng)的高加索三葉草造成一定的低溫傷害［19］。據(jù)筆者前期的物候觀測(cè)，至11月初，高加索三葉草在河南縣才出現(xiàn)凍萎狀態(tài)，說明其抗寒性很強(qiáng)，足以適應(yīng)河南縣的低溫環(huán)境。目前，植物對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)研究多為單一模式降溫后的生理觀測(cè)，如適溫培養(yǎng)后進(jìn)行低溫脅迫或冷馴化后進(jìn)行低溫脅迫［20-23］，而對(duì)同一物種在遭遇不同降溫模式的低溫脅迫后其生理響應(yīng)的比較研究報(bào)道較少。本研究以高加索三葉草種子實(shí)生苗為材料，利用低溫人工氣候箱模擬高加索三葉草在春秋季節(jié)遭遇的零下低溫，即通過非冷馴化降溫和冷馴化降溫兩種方式對(duì)高加索三葉草植株進(jìn)行-6 ℃冷凍脅迫，比較葉片在不同降溫模式下的形態(tài)和生理變化，并應(yīng)用主成分分析法進(jìn)行抗寒指標(biāo)篩選，為研究高加索三葉草對(duì)不同降溫模式低溫脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制和擴(kuò)大高加索三葉草在青藏高原的引種范圍提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為高加索三葉草的育成品種“蒙農(nóng)三葉草1 號(hào)”，其種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)王明玖教授于2018年提供。

1.2 試驗(yàn)處理

2019年5 至8月，在青海大學(xué)校內(nèi)牧草試驗(yàn)地和草業(yè)科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。在含有混合基質(zhì)的花盆中播種高加索三葉草種子，待長(zhǎng)出幼苗，生長(zhǎng)60 d 以后，挑選長(zhǎng)勢(shì)相同且生長(zhǎng)健康的幼苗，將其置于低溫人工氣候箱進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)30 d，模擬的生長(zhǎng)條件為：20 ℃的日溫、18 ℃的夜溫、12 000 lx 的光照強(qiáng)度、60%的濕度、12 h 的光照周期。試驗(yàn)分為兩組：非冷馴化降溫 組（Non-cold Acclimation，NA），冷馴 化降溫組（Cold-Acclimation，CA）。兩個(gè)降溫組除溫度外，其余條件均與適應(yīng)性培養(yǎng)下的條件相同，具體過程為：（1）NA 組：由20 ℃未經(jīng)4℃冷馴化直接降溫至-6℃進(jìn)行低溫脅迫；（2）CA 組：由20 ℃以2 ℃/h 梯度降溫至4 ℃/4 ℃（日溫/夜溫）冷馴化處理18 d，再直接降溫到-6 ℃進(jìn)行低溫脅迫。NA 組和CA 組于同一天9∶00 開始進(jìn)行-6 ℃冷凍脅迫處理，分別脅迫0、2、4、6 h 后剪取葉片，立即置于液氮冷凍保存，用于高加索三葉草葉片的生理指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)處理組的各時(shí)間點(diǎn)樣品均3 個(gè)重復(fù)。

1.3 形態(tài)觀察

冷凍脅迫試驗(yàn)完成后，NA 組和CA 組的植株均置于人工氣候箱（溫度10 ℃、光照強(qiáng)度4 000 lx、濕度60%、光周期12 h）進(jìn)行恢復(fù)處理。觀察4 ℃冷馴化、-6 ℃冷凍脅迫和10 ℃恢復(fù)后的葉片形態(tài)變化。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定

所測(cè)定生理指標(biāo)為：MDA 含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、POD 活性、SOD 活性和葉綠素含量。其中，MDA、可溶性糖和可溶性蛋白的含量測(cè)定參照Pu 等［24］的 方 法；SOD 和POD 活性的測(cè)定參照Yang 等［25］的 方 法；葉 綠 素 含 量 測(cè) 定 參 照He 等［26］的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并繪制圖表；運(yùn)用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高加索三葉草對(duì)不同降溫模式的形態(tài)響應(yīng)及葉片恢復(fù)情況

在冷馴化降溫和非冷馴化降溫處理過程中，高加索三葉草老葉和嫩葉的形態(tài)呈現(xiàn)出了不同的變化趨勢(shì)，總體表現(xiàn)為經(jīng)冷馴化降溫處理的葉片更能適應(yīng)冷凍脅迫，非冷馴化降溫處理的葉片在冷凍脅迫下受損更嚴(yán)重，嫩葉相比于老葉不容易受損（表1）。

表1 高加索三葉草在不同降溫模式下的葉片形態(tài)Table 1 Theleaf morphology changes of Caucasian clover under different cooling modes

2.2 高加索三葉草對(duì)不同降溫模式的生理指標(biāo)響應(yīng)情況

2.2.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化 高加索三葉草在-6 ℃處理6 h 內(nèi)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，NA 和CA兩組的MDA 含量均呈上升趨勢(shì)；NA 組上升趨勢(shì)緩慢，而CA 組上升趨勢(shì)較快（圖1?A）。整個(gè)脅迫過程，CA 組MDA 含量顯著高于NA 組（P<0.05）。冷凍脅迫6 h 時(shí)，CA 組MDA 含 量 極顯 著 高 于NA 組（P<0.01）。表明不同降溫模式均會(huì)導(dǎo)致高加索三葉草葉片MDA 積累，從而使細(xì)胞遭受傷害。

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，NA 組可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，CA 組先下降再上升，兩組可溶性蛋白含量始終高于0 h 時(shí)（圖1?B）。冷凍脅迫4 h時(shí)，CA 組達(dá)到最低值，仍顯著高于NA 組（P<0.05）。脅迫6 h 時(shí)，CA 組和NA 組含量差異最大，前者約為后者的2.03 倍。表明不同降溫模式均會(huì)使高加索三葉草葉片可溶性蛋白含量增加，以增強(qiáng)其質(zhì)膜系統(tǒng)滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)其抗寒能力，CA 組含量波動(dòng)較大且始終顯著高于NA 組（P< 0.05），說明CA 組的抗寒性表現(xiàn)更好。

冷凍脅迫2 h 后，NA 組可溶性糖含量達(dá)到最低，而CA 組含量最高，后者約為前者的2.79 倍（圖1?C）。但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，NA 組可溶性糖含量緩慢上升，6 h 時(shí)達(dá)到最高值；而CA 組出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，4 h 時(shí)達(dá)到最低值。冷凍脅迫6 h 內(nèi)，CA 組含量極顯著高于NA 組（P<0.01）。表明不同降溫模式對(duì)高加索三葉草葉片可溶性糖含量影響不同，NA 組可溶性糖含量變化不敏感，而CA 組雖含量波動(dòng)較大且始終顯極著高于NA 組（P< 0.01），說明CA 組的抗寒性表現(xiàn)更好。

圖1 不同降溫模式下高加索三葉草MDA、可溶性蛋白、可溶性糖含量Fig.1 MDA，soluble protein and soluble sugar content in Caucasian clover under different cooling modes

2.2.2 保護(hù)酶活性變化 隨著冷凍脅迫的進(jìn)行，NA組POD 活性呈上升趨勢(shì)，6 h 時(shí)達(dá)到最高值，CA 組呈先上升再下降趨勢(shì)，4 h 時(shí)達(dá)到最高值（圖2?A）。整個(gè)脅迫過程中，兩組差異不顯著（P>0.05）。表明不同降溫模式均會(huì)使高加索三葉草葉片POD 活性增加，NA 和CA 兩組均具有較強(qiáng)的清除過氧化物的能力，說明POD 活性對(duì)高加索三葉草植株抵抗不同方式的冷凍傷害均起著重要的作用。

冷凍脅迫后，NA 和CA 兩組的SOD 活性均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，且CA 組始終極顯著高于NA 組（P<0.01）（圖2?B）。表明不同降溫模式均會(huì)使高加索三葉草葉片SOD 活性增加，通過SOD 來清除體內(nèi)多余的活性氧來提升抗氧化能力，CA 組SOD 活性更高，說明CA 組比NA 組抗寒性表現(xiàn)更好。

圖2 不同降溫模式下高加索三葉草POD、SOD 活性Fig.2 POD and SOD activity in Caucasian clover under different cooling modes

2.2.3 葉綠素含量變化 冷凍脅迫后，NA 和CA 兩組各時(shí)間點(diǎn)的葉綠素含量均高于0 h 時(shí)。NA 組葉綠素含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，CA 組呈先上升再下降趨勢(shì)（圖3）。冷凍脅迫前4 h 內(nèi)，NA 組顯著低于CA 組（P<0.05）；但6 h 后，兩組差異不顯著（P>0.05）。表明不同降溫模式處理均會(huì)使高加索三葉草葉片葉綠素含量增加。

圖3 不同降溫模式下高加索三葉草葉綠素含量Fig.3 Chlorophyll content in Caucasian clover under differ?ent cooling modes

2.3 不同降溫模式的抗寒生理指標(biāo)篩選

通過對(duì)高加索三葉草在不同降溫模式的生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，根據(jù)系數(shù)的大小進(jìn)一步篩選不同處理抗寒過程的主要生理指標(biāo)。遵循特征值大于1的原則，提取出2 個(gè)主成分。NA 組前2 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為67.797%，反映了6 個(gè)指標(biāo)的大部分信息，表明前2 個(gè)主成分具有較強(qiáng)的代表性（表2）。主成分1 的貢獻(xiàn)率為45.777%，其中POD 活性和MDA 含量的系數(shù)絕對(duì)值最大；主成分2 的貢獻(xiàn)率為21.519%，其中可溶性糖含量的系數(shù)絕對(duì)值最大。表明POD 活性、MDA 含量、可溶性糖含量對(duì)非冷馴化降溫組的抗寒力貢獻(xiàn)最大，因此可將POD 活性和MDA 含量作為核心指標(biāo)，可溶性糖含量則為輔助指標(biāo)。

表2 NA 組高加索三葉草生理指標(biāo)主成分分析Table 2 Principal component analysis of physiological in?dexes of Caucasian clover in NA group

CA 組前2 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為83.442%，反映了6 個(gè)指標(biāo)的絕大部分信息，表明前2 個(gè)主成分具有很強(qiáng)的代表性，主成分1 的貢獻(xiàn)率為63.642%，其中可溶性蛋白含量和SOD 活性的系數(shù)絕對(duì)值最大；主成分2 的貢獻(xiàn)率為19.800%，其中葉綠素含量的系數(shù)絕對(duì)值最大（表3）。表明可溶性蛋白含量、SOD 活性和葉綠素含量對(duì)冷馴化降溫組的抗寒力貢獻(xiàn)最大，因此可將可溶性蛋白含量和SOD 活性作為核心指標(biāo)，葉綠素含量則為輔助指標(biāo)。

表3 CA 組高加索三葉草生理指標(biāo)主成分分析Table 3 Principal component analysis of physiological in?dexes of Caucasian clover in CA group

3 討論

高加索三葉草原產(chǎn)亞歐大陸分界線的高加索地區(qū)，20 世紀(jì)初期后被引入世界各地，包括新西蘭、澳大利亞、捷克斯洛伐克、加拿大和美國(guó)［5-6］。1985年后，高加索三葉草逐漸被引種到北京、呼和浩特、赤峰、哈爾濱和青海省黃南州等地［17，27-29］。這些引種地區(qū)囊括了從接近海平面的區(qū)域到高海拔和高緯度地區(qū)的廣大范圍，高加索三葉草在這些區(qū)域都能生存并安全越冬［30］，說明該草具有廣泛的生態(tài)位，在抗寒性方面具有卓越表現(xiàn)。關(guān)于高加索三葉草的抗寒機(jī)制，主要涉及物理和生理方面。如Costin 等［7］曾報(bào)道高加索三葉草具有能抵抗凍融的機(jī)械作用，崔英［10］為了準(zhǔn)確快捷的評(píng)價(jià)高加索三葉草的抗寒性，用到了抗寒生理生化指標(biāo)評(píng)價(jià)法。然而，涉及響應(yīng)低溫的分子研究卻鮮見報(bào)道，僅見牟丹等［32］運(yùn)用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其面臨不同降溫模的低溫脅迫進(jìn)行了分析，初步篩選到一些與抗寒相關(guān)的通路與基因。

從降溫試驗(yàn)和恢復(fù)后的葉片形態(tài)變化來看，低溫馴化有助于提高高加索三葉草的抗寒性。非冷馴化降溫組和冷馴化降溫組在-6℃處理2 h 后，形態(tài)表現(xiàn)均為受凍不嚴(yán)重，且絕大部分葉片在10 ℃處理24 h 后能恢復(fù)正常，說明高加索三葉草的抗寒性很強(qiáng)。非冷馴化降溫組各個(gè)處理下高加索三葉草葉片受害程度均較冷馴化降溫組受害嚴(yán)重，且不易恢復(fù)，這是符合常理的。但是，冷凍脅迫試驗(yàn)結(jié)束7 d 后，所有的參試植株均重新長(zhǎng)出新的葉片，說明高加索三葉草根頸芽恢復(fù)力也很強(qiáng)。

隨冷凍脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，非冷馴化降溫組和冷馴化降溫組MDA 含量均呈上升趨勢(shì)，后者顯著高于前者，說明高加索三葉草葉片細(xì)胞在不同降溫模式下均受到低溫傷害，且在4 ℃冷馴化期間葉片就開始積累一定量的MDA。兩組POD 和SOD 活性在整體上均呈上升趨勢(shì)，說明兩組葉片均可通過提高保護(hù)酶活性來清除活性氧，并減少M(fèi)DA 對(duì)質(zhì)膜的2 次傷害，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。此外，低溫對(duì)冷馴化降溫組的SOD 活性影響尤其大，說明高加索三葉草在冷馴化期間就迅速啟動(dòng)了抗氧化酶系統(tǒng)。

隨冷凍脅迫的進(jìn)行，非冷馴化降溫組可溶性蛋白含量先增加再降低，可溶性糖含量呈緩慢上升的趨勢(shì)，推測(cè)高加索三葉草葉片在面臨突然的零下低溫，為了抵御嚴(yán)寒嚴(yán)重消耗可溶性糖，同時(shí)為了及時(shí)平衡滲透壓而不斷合成可溶性蛋白；隨著脅迫的進(jìn)行，部分可溶性蛋白轉(zhuǎn)化成可溶性糖，使三葉草更好地適應(yīng)低溫。這與李瑞雪等［28］在木蘭科植物上的研究結(jié)果類似。冷凍脅迫期間，非冷馴化降溫組可溶性糖含量雖然低于脅迫0 h 時(shí)的含量，但差異不顯著，與Wang等［29］對(duì)菊花進(jìn)行-4 ℃低溫處理4 h 后的結(jié)果一致。冷馴化降溫組的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量在整個(gè)冷凍脅迫期均呈先下降再上升的趨勢(shì)，含量均顯著高于非冷馴化降溫組，且波動(dòng)更大。董愛玲等［30］也報(bào)道了低溫鍛煉使茄子幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量上升，升高幅度明顯大于未經(jīng)低溫馴化處理組。這一結(jié)果說明冷馴化可能啟動(dòng)了高加索三葉草中冷誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，使葉片細(xì)胞中可溶性蛋白累積，并促進(jìn)其降解為可溶性糖，兩者起協(xié)同作用，增強(qiáng)植株抵御低溫的能力；同時(shí)也證實(shí)了前人的研究結(jié)果，即植物冷馴化后涉及許多代謝物質(zhì)的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和兼容溶質(zhì)的積累［31］。

整個(gè)冷凍脅迫期內(nèi)，非冷馴化降溫組和冷馴化降溫組的葉綠素含量始終高于脅迫0 h 時(shí)的含量，且兩組差異不顯著?？梢钥闯鰺o論是經(jīng)非冷馴化降溫還是冷馴化降溫，高加索三葉草遭遇低溫后均能保持較高的葉綠素含量。陳凱等［37］研究也表明，在0 ℃低溫情況下，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，望天樹幼苗葉片中葉綠素含量持續(xù)增加。王秀田等［32］發(fā)現(xiàn)冬小麥DN1 經(jīng)室內(nèi)低溫馴化后，在-4 ℃時(shí)葉綠素a 和葉綠素b 含量均高于對(duì)照組。因此，冷凍脅迫后高加索三葉草葉綠素含量的增加佐證了其強(qiáng)大的抗寒性。

植物的抗寒性是一系列生理生化特征綜合作用的結(jié)果，各生理指標(biāo)相互作用，相互影響，不易凸顯某一指標(biāo)的重要性。大量研究表明，主成分分析法可有效用于指標(biāo)的篩選［34-36］。本研究中，高加索三葉草響應(yīng)不同降溫模式的生理指標(biāo)主成分分析表明：POD 活性、MDA 含量和可溶性糖含量可作為快速鑒定高加索三葉草響應(yīng)非冷馴化降溫過程的生理指標(biāo)；可溶性蛋白含量、SOD 活性和葉綠素含量可作為快速鑒定高加索三葉草響應(yīng)冷馴化降溫過程的生理指標(biāo)。

4 結(jié)論

非冷馴化降溫組和冷馴化降溫組在-6 ℃處理2 h 后均受凍不嚴(yán)重，且絕大部分葉片在24 h 內(nèi)能恢復(fù)正常；恢復(fù)7 d 后，所有的參試植株均重新長(zhǎng)出新的葉片，表明高加索三葉草耐受低溫的能力較強(qiáng)。POD 活性可作為評(píng)價(jià)非冷馴化降溫過程抗寒性的核心指標(biāo)，可溶性糖含量和葉綠素含量作為輔助指標(biāo)；可溶性蛋白含量可作為評(píng)價(jià)冷馴化降溫過程抗寒性的核心指標(biāo)，葉綠素含量和可溶性糖含量作為輔助指標(biāo)。高加索三葉草具有較強(qiáng)的抗寒能力，具備在高寒草地引種栽培的潛力。